Biotechnologia interdyscyplinarna dziedzina nauki i techniki, zajmująca się zmianą materii żywej i poprzez wykorzystanie

Transkrypt

1 Biotechnologia interdyscyplinarna dziedzina nauki i techniki, zajmująca się zmianą materii żywej i poprzez wykorzystanie organizmów żywych, ich części, bądź pochodzących od nich produktów, a także modeli procesów biologicznych w celu tworzenia wiedzy, dóbr i usług (MNiSW, 2006)

2 Biotechnologia interdyscyplinarna dziedzina nauki i techniki, zajmująca się zmianą materii żywej i poprzez wykorzystanie Czynniki biologiczne (biokatalizatory) komórki, ich części lub izolowane enzymy Cel: nagromadzanie biomasy otrzymywanie odpowiedniego metabolitu wytwarzanego przez komórki przemiana chemiczna składniku pożywki substratu, ksenobiotyku

3 Schemat blokowy procesu biotechnologii antybiotyków 2. rozmnażanie materiału posiewowego a szczep produkcyjny (zamrożony lub zliofllizowany) b hodowla szczepu na skosach agarowych c hodowla w kolbach Roux d hodowla wstrząsana e hodowla w bioreaktorach posiewowych

4 Program ćwiczeń

5 Schemat blokowy procesu biotechnologii antybiotyków 1. Przygotowanie podłoży hodowlanych 2. rozmnażanie materiału posiewowego a szczep produkcyjny (zamrożony lub zliofllizowany) b hodowla szczepu na skosach agarowych c hodowla w kolbach Roux (płytkach Petriego d hodowla wstrząsana e hodowla w bioreaktorach posiewowych/ (3) produkcyjnych

6 Metabolit wtórny Tacrolimus Produkt fermentacji Streptomyces tsukubaensis (Streptomyces hygroscopicus) Immunosupresant stosowany w prewencji odrzucenia przeszczepu i w chorobach autoimmunologicznych 10 do 100 razy aktywniejszy od cyklosporyny Koszt stosowania tacrolomusu w terapii po transplantacjach i w dermatologii jest wysoki Wysoka cena preparatów zawierających tacrolimus jest w części spowodowana niską produktywnością szczepów S. tsukubaensis

7 Historia odkrycia i wprowadzenia do lecznictwa tacrolimusu

8 Mechanizm działania tacrolimusu na limfocyty T Bulusu MA et al. Fortschr Chem Org Naturst. 2011;94:59-126

9 Tacrolimus (FK-506) 23-członowy makrolakton zawierający hemiketalowe ugrupowanie a,bdiketoamidowe Izomeria: 14 asymetrycznych atomów węgla, izomeria cis-trans, tautomeria

10 Tautomeria FK-506 Namiki J et al. J Antibiot (Tokyo) 1993; 56:

11 Domeny tacrolimusu Bulusu MA et al. Fortschr Chem Org Naturst. 2011;94:59-126

12 Cel naszych badań :podwyższenie produktywności szczepu S.tsukubaensis co pozwoli obniżyć koszty produkcji

13 Istnieją dwie metody optymalizacji procesu biosyntezy idiolitu przez szczep produkcyjny: Modyfikacja szczepu Mutageneza, Fuzja protoplastów, Metody transformowanego DNA Optymalizacja procesu poprzez optymalizację składu podłoża oraz warunków hodowli

14 Optymalizacja warunków hodowli szczepu Streptomyces tsukubaensis przez poszukiwanie prekursorów biosyntezy

15 Biogeneza FK506, fragmenty z których składana jest cząsteczka: Szikimian jako starter (ugrupowanie cykloheksylowe), malonylo-coa (octan), methylmalonylo-coa (propionian), metoksymalonylo-acp, Pipekolinian pochodzący z cząsteczki lizyny Goranovic D et al..j Biol Chem 2010;285(19):

16 Pathway for biosynthesis of FK506 (according to Motamedi and Shafiee) Motamedi H, Shafiee A.. Eu J Biochem 1998; 256:

17 Testowane prekursory biosyntezy Pochodne piperydyny i pirydyny Kwas pirydyno-2-karboksylowy (pikolinowy), Kwas piperydyno-2- karboksylowy (pipekolinowy), Kwas pirydino-3-karboksylowy (nikotynowy), Amid kwasu pirydyno-3-karboksylowego (nikotynamid) Trójwęglowe kwasy i alkohole kwas propanowy propan-1,3-diol propanol

18 Pathway for biosynthesis of FK506 (according to Motamedi and Shafiee) Motamedi H, Shafiee A.. Eu J Biochem 1998; 256:

19 Streptomyces tsukubaensis Tacrolimus (mg/l) Tacrolimus Nicotinamide Nicotinic acid Picolinic acid Pipecolic acid 0 0,001 0,0025 0,005 0,01 0,02 Concentration of medium additive (%) Pipecolic acid Picolinic acid Nicotinic acid Nicotinamide Enrichment of the fermentation medium in piperidine-2-carboxylic acid, pyridine-2-carboxylic acid,, pyridine-3-carboxylic acid or pyridine- 3-carboxylic acid amide caused growth of the productivity in Streptomyces tsukubaensis: sixfold, sevenfold, threefold and fivefold, respectively Turlo J, et al.: Enzyme and Microbial Technology, 2012

20 Tacrolimus (mg/l) Productivity of mycelium (mg/g) Mycelial growth (g /L) Tacrolimus (mg/l) Impact of medium additives on the mycelial growth and tacrolimus productivity Nicotinamide Nicotinic acid Picolinic acid Pipecolic acid 0 0,001 0,0025 0,005 0,01 0,02 Concentration of medium additive (%) Nicotinamide Nicotinic acid Picolinic acid Pipecolic acid 0 0,001 0,0025 0,005 0,01 0,02 Concentration of medium additive (%) R² = 0,9566 Nicotinamide Nicotinic acid Picolinic acid Pipecolic acid Nicotinamide Nicotinic acid Picolinic acid Pipecolic acid 10 R² = 0, Strain growth (g /L) 0 0 0,001 0,0025 0,005 0,01 0,02 Concentration of medium additive (%)

21 Suplement medium hodowlanego, który nie wpływa na wzrost szczepu a podwyższa produktywność Prekursor biosyntezy Suplement medium hodowlanego, który podwyższa wzrost szczepu i podwyższa produktywność (istnieje liniowa korelacja)? Promotor wzrostu Suplement medium hodowlanego, który podwyższa wzrost szczepu i podwyższa produktywność (istnieje korelacja nieliniowa)? Być może pełni obydwie funkcje

22 sala ćwiczeń KTiZTLiBF hala maszyn KTiZTLiBF Kolby wstrząsane (500 ml) powinny zawierać po 200 ml podłoża hodowlanego

23 1 kolba zawierająca 100 ml podłoża 3 kolby, każda zawierająca 200 ml podłoża, razem 600 ml podłoża 1 kolba zawierająca 200 ml podłoża

24