RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11) (13) B1. (21) Numer zgłoszenia:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (54) IntCl5: C12J 1/04 C12P 7/54 C12R 1:02 (54) Sposób wytwarzania octu (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 05/92 (73) Uprawniony z patentu: Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, Warszawa, PL (72) Twórcy wynalazku: Jerzy Czuba, Warszawa, PL Irena Sikorska, Warszawa, PL Katarzyna Warowna, Warszawa, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 10/94 (74) Pełnomocnik: Roszkowski Adam, Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego (57) 1. Sposób wytwarzania octu przy zastosowaniu bakterii rodzaju Acetobacter, według znanej technologii, znamienny tym, że do zapoczątkowania fermentacji stosuje się szczep Acetobacter aceti MW-2, wyizolowany i przechowywany w stacjonarnej hodowli powierzchniowej na podłożu o konsystencji półciekłej, zawierającym agar, źródło biostymulatorów, źródło węgla oraz źródła fosforu, azotu, potasu i magnezu oraz alkohol etylowy i kwas octowy. PL B1

2 Sposób wytwarzania octu Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania octu przy zastosowaniu bakterii rodzaju Acetobacter, według znanej technologii, znamienny tym, że do zapoczątkowania fermentacji stosuje się szczep Acetobacter aceti MW-2, wyizolowany i przechowywany w stacjonarnej hodowli powierzchniowej na podłożu o konsystencji półciekłej, zawierającym agar, źródło biostymulatorów, źródło węgla oraz źródła fosforu, azotu, potasu i magnezu oraz alkohol etylowy i kwas octowy. 2. Sposób wytwarzania octu według zastrz. 1, znamienny tym, że w półciekłym podłożu stosowanym do izolacji i przechowywania szczepu Acetobacter aceti MW-2 suma stężenia alkoholu etylowego wyrażonego w % objętościowych i stężenia kwasu octowego wyrażonego w g/100 cm3 wynosi 10-14%, korzystnie 11-12%. 3. Sposób wytwarzania octu według zastrz. 1, znamienny tym, że w półciekłym podłożu stosowanym do izolacji i przechowywania szczepu Acetobacter aceti MW-2 jako źródło biostymulatorów stosuje się octowy wyciąg biomasy drożdżowej w dawce 5-15 g/dm3, korzystnie 10 cm3/dm3, jako źródło węgla glukozę w dawce 0,5-2 g/dm3, korzystnie 1 g/dm3, jako źródło fosforu i azotu fosforan dwuamonowy w dawce 0,2-0,8 g/dm3, korzystnie 0,45 g/dm3, jako źródło potasu siarczan potasu w dawce 0,05-0,2 g/dm3, korzystnie 0,13 g/dm3, jako źródło magnezu siedmiowodny siarczan magnezu w dawce 0,1-0,5 g/dm3, korzystnie 0,3 g/dm3. 4. Sposób wytwarzania octu według zastrz. 1, znamienny tym, że dawka agaru dodawanego do podłoża wynosi 0,2-0,5 g/dm3, korzystnie 0,3 g/dm3. 5. Sposób wytwarzania octu według zastrz. 1, znamienny tym, że w odstępach od 3 do 30 dni, w zależności od temperatury hodowli i wzrostu bakterii są one przeszczepiane na świeże podłoże półciekłe. Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania octu przy użyciu bakterii rodzaju Acetobacter. W znanym sposobie wytwarzania octu ze spirytusu, przy zastosowaniu bakterii rodzaju Acetobacter otrzymuje się najczęściej ocet o zawartości kwasu octowego powyżej 10%. W procesie wytwarzania octu o takim stężeniu najniższe stężenie kwasu octowego wynosi 5-7 g/1 0 0 cm3. Bakterie rodzaju Acetobacter występujące w naturze nie są oporne na tak wysokie stężenia kwasu octowego. Również bakterie hodowane na ogólnie stosowanych podłożach laboratoryjnych, wyizolowane z fermentorów przemysłowych, nie wykazują takiej oporności. Z dotychczasowej praktyki wynika, że jedynie bakterie obecne w occie zachowują swe korzystne dla procesu technologicznego cechy. W tym celu do uruchomienia fermentacji stosuje się ocet zarodowy. Octem zarodowym jest ocet zawierający alkohol w stężeniu najczęściej 1-2% objętościowych i przechowywany w temperaturze od kilkunastu do dwudziestu kilku stopni Celsjusza, z dostępem powietrza. Sposób fermentacji z wykorzystaniem octu zarodowego, powszechnie stosowany nie gwarantuje warunków, w których fermentacja będzie prowadzona przy użyciu najbardziej korzystnego szczepu bakterii, tym bardziej, że proces fermentacji octowej jest prowadzony w niesterylnych warunkach. Ponadto, występujące zmiany warunków procesu wpływają na zmiany jakościowego składu mikroflory czynnej w tym procesie, a także na degeneracje występującej w danym fermentorze mikroflory. Ocet zarodowy pochodzący z takiego fermentora nie może więc zawierać najkorzystniejszych szczepów bakterii rodzaju Acetobacter.

3 Przy zastosowaniu wgłębnej metody wytwarzania octu o zawartości kwasu octowego ponad 10%, w znany sposób, produktywność procesu wynosi kg kwasu octowego w przeliczeniu na 1 m3 fermentowanej cieczy w ciągu 24 godzin. Zastosowanie czystej kultury bakterii o korzystnych cechach technologicznych jest podane w patencie bułgarskim nr Opisany jest szczep Acetobacter xylinum 049, który może być stosowany w produkcji octu winnego metodą wgłębną. Szczep ten został wyizolowany z fermentora przemysłowego bez wykorzystania czynników mutagennych. Wyizolowaną czystą kulturę przechowuje się na skośnym agarze brzęczkowym zawierającym 3% alkoholu i 0,2% kwasu octowego. Kulturą 48-godzinną z 50 probówek szczepi się 45 dm3wody drożdżowej z dodatkiem 1 % alkoholu i 0,2% kwasu octowego i inkubuje w warunkach wgłębnych w ciągu 48 godzin w temperaturze 28 C. Następnie, cieczą pohodowlaną szczepi się 250 dm3 wina rozcieńczonego do stężenia 6 % alkoholu i zawierającego 0,1% autolizatu drożdżowego. Po 2-3 dniach hodowli przefermentowane wino jest stosowane do szczepienia kolejnych, coraz większych objętości wina. Za każdym razem inoculum stanowi 15-20% objętości szczepionej cieczy. Szczep Acetobacter xylinum 049 wytwarza kwas octowy maksymalnie do stężenia 7,9%, a proces fermentacji w fermentorze wgłębnym trwa 2-4 doby. Szczep ten nie nadaje się do zastosowania w fermentorach ociekowych ze względu na tworzenie dużych ilości śluzu. Ze względu na niskie stężenie kwasu octowego jakie można uzyskać przy użyciu szczepu Acetobacter xylinum nie może on mieć praktycznego zastosowania w procesie wytwarzania octu o zawartości kwasu octowego powyżej 10%. Celem wynalazku jest optymalizacja procesu wytwarzania octu o zawartości kwasu octowego powyżej 10% przez zapoczątkowanie fermentacji przy użyciu wyselekcjonowanego szczepu bakterii o znanych, korzystnych cechach biotechnologicznych, charakteryzującego się w szczególności opornością na stężenia kwasu octowego występujące w procesie technologicznym oraz wysoką aktywnością i zdolnością rozmnażania się w tych warunkach. W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że bakterie rodzaju Acetobacter wykazujące najwyższą aktywność w procesie fermentacji, hodowane na powszechnie stosowanych podłożach z agarem (na skosach lub płytkach), zawierających do 4% alkoholu, nie/lub zawierających niewielką ilość kwasu octowego nie rosną lub rosną bardzo powoli. Trudności związane ze wzrostem bakterii na podłożach o konsystencji stałej wiążą się z utrudnioną dyfuzją składników podłoża do strefy wzrostu bakterii z pozostałych stref. Ponadto bakterie hodowane na takich podłożach nie wykazują oporności na stężenie kwasu octowego występujące w procesie technologicznym otrzymywania octu o zawartości kwasu octowego powyżej 10 g/ 100 cm3. Powierzchniowa, stacjonarna hodowla bakterii rodzaju Acetobacter na podłożach ciekłych (bez agaru) jest trudna. Bakterie te można hodować przy stężeniach kwasu octowego i alkoholu występujących w procesie technologicznym, jednak wysokie stężenie kwasu octowego w znaczny sposób opóźnia ich wzrost. Pojedyncze komórki bakterii z trudnością utrzymują się na powierzchni cieczy i często, zanim utworzą kożuszek, opadają w głąb cieczy i tam giną ze względu na niedobór tlenu. Podłoże o konsystencji półciekłej według wynalazku, z jednej strony pozwala na dostateczną szybkość dyfuzji składników, z drugiej strony na utrzymywanie się nawet pojedynczych komórek bakterii na powierzchni podłoża. Dzięki temu możliwa jest sprawna hodowla i selekcja bakterii rodzaju Acetobacter przydatnych w procesie technologicznym. Przy zastosowaniu takiego podłoża udało się wyselekcjonować szczep Acetpbacter aceti, bez stosowania czynników mutagennych, wykazujący wysoką oporność na kwas octowy oraz wysoką aktywność i zdolność wzrostu w warunkach procesu technologicznego wytwarzania octu o zawartości kwasu octowego powyżej 10%. Szczep oznaczony symbolem MW-2, nie wytwarza śluzu i może być stosowany do zapoczątkowania fermentacji octowej w fermentorach ociekowych (generatorach). Nieoczekiwanie okazało się, że przy użyciu wyizolowanego szczepu Acetobacter aceti MW-2, wybranego spośród kilkudziesięciu szczepów bakterii tego gatunku, wyizolowanych z fermentorów przemysłowych, możliwe jest uzyskiwanie w warunkach wgłębnej fermentacji,

4 octu o zawartości kwasu octowego powyżej 10%, z produktywnością ponad 70 kg kwasu octowego w przeliczeniu na 1 m3 fermentowanej cieczy w ciągu 24 godzin. Istota wynalazku polega na tym, że w procesie wytwarzania octu do zapoczątkowania fermentacji stosuje się szczep Acetobacter aceti MW-2, który został wyizolowany i jest przechowywany w stacjonarnej hodowli powierzchniowej na podłożu o konsystencji półciekłej zawierającym agar, źródło biostymulatorów, źródło węgla oraz źródła fosforu, azotu, potasu i magnezu oraz alkohol etylowy i kwas octowy. W półciekłym podłożu stosowanym do izolacji i przechowywaniu szczepu Acetobacter aceti suma stężenia alkoholu etylowego, wyrażonego w % objętościowych i stężenia kwasu octowego wyrażonego w g/1 0 0 cm3, podobnie jak w brzeczce fermentacyjnej stosowanej w procesie technologicznym, wynosi 10-14%, korzystnie 11-12%. W podłożu tym jako źródło biostymulatorów stosuje się octowy wyciąg biomasy drożdżowej w dawce 5-15 cm3/dm3, korzystnie 10 cm3/dm3, jako źródło węgla glukozę w dawce 0,5-2 g/dm3, korzystnie 1 g/dm3, jako źródło fosforu i azotu fosforan dwuamonowy w dawce 0,2-0,8 g/dm3, korzystnie 0,45 g/dm3, jako źródło potasu siarczan potasu w dawce 0,05-0,2 g/dm3, korzystnie 0,13 g/dm3, jako źródło magnezu siedmiowodny siarczan magnezu w dawce 0,1-0,5 g/dm3, korzystnie 0,3 g/dm3, czynnikiem nadającym konsystencję podłożu jest agar w dawce 2-5 g/dm3, korzystnie 3 g/dm3. Hodowlę bakterii prowadzi się w temperaturze C, korzystnie C (przechowywanie w temperaturze pokojowej), lub C (hodowla w cieplarce), w odstępach od 3 do 30 dni, w zależności od temperatury hodowli i szybkości wzrostu bakterii są one przeszczepiane na świeże podłoże. Ważnym elementem tej hodowli jest przeszczepianie bakterii w momencie, gdy stężenie alkoholu w podłożu obniży się do 1-1,5% objętościowych. Bakterie rozmnożone na podłożu półciekłym są następnie przenoszone do fermentora o objętości kilku dm3, zawierającego podłoże produkcyjne. Zawartością tego fermentora jest szczepiony fermentor przemysłowy, w którym fermentacja jest prowadzona w znany sposób, czyli po odfermentowaniu alkoholu do 0,2-0,5% objętościowych, 20-50% zawartości fermentora wymienia się na świeżą brzeczkę o zawartości alkoholu 10-14% objętościowych i 1-2% kwasu octowego przy nieprzerywanym napowietrzaniu. Temperaturę fermentacji utrzymuje się na stałym poziomie w granicach C, korzystnie 28 C. Cykl ten jest powtarzany w zależności od potrzeb. W miarę wzrostu szybkości fermentacji w obu fermentorach powiększa się intensywność napowietrzania, która nie powinna być wyższa niż 0,21-0,25 objętości powietrza na objętość cieczy na minutę. Po upływie kilku dni, najpierw w fermentorze laboratoryjnym, a następnie w przemysłowym, uzyskuje się przebieg fermentacji z produktywnością około 70 kg kwasu octowego w przeliczeniu na 1 m3 fermentowanej cieczy w ciągu 24 godzin. Szczep Acetobacter aceti MW-2 użyty do sposobu według wynalazku, został wyselekcjonowany w Instytucie Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego z kultury bakterii pobranej z fermentora przemysłowego w ten sposób, że ocet pobrany z fermentora przemysłowego stanowił materiał szczepienny do uruchomienia fermentacji wgłębnej w fermentorze mikrotechnicznym o objętości roboczej 3 dm3. Fermentor ten wyposażony w tlenomierz i możliwość regulacji intensywności napowietrzania pozwalał na prowadzenie hodowli bakterii w warunkach stężeń kwasu octowego i alkoholu występujących w fermentorach przemysłowych z jednoczesnym dostosowaniem intensywności napowietrzania w taki sposób, by nie dopuścić do ograniczenia szybkości fermentacji poprzez niedobór tlenu. W fermentorze tym prowadzono fermentację w ten sposób, że po przefermentowaniu alkoholu do stężenia około 0,5% objętościowych połowę jego zawartości wymieniano na świeżą brzeczkę zawierającą 10-11% objętościowych alkoholu etylowego i około 1 g/100 cm3 kwasu octowego. W sumie z fermentorów przemysłowych wyizolowano kilkadziesiąt szczepów bakterii rodzaju Acetobacter. W odróżnieniu od innych szczepów okazało się, że szczep o symbolu MW-2 nie wykazywał wzrostu po przeszczepieniu na podłoża powszechnie stosowane do identyfikacji bakterii Acetobacter tzn. nie zawierające kwasu octowego. W celu umożliwienia jego identyfikacji, niezbędna okazała się adaptacja komórek poprzez przeprowadzenie co najmniej jednego pasażu na podłożu o niskim stężeniu kwasu octowego, korzystnie na podłożu półciekłym zawierającym 1 g/100 cm3 kwasu octowego i 3% objętościowych alkoholu etylowego.

5 Szczep Acetobacter aceti MW-2 wykazuje wyłącznie metabolizm oddechowy. Tworzy katalazę, utlenia alkohol do kwasu octowego, a następnie do wody i dwutlenku węgla. Utlenia mleczany. Tworzy kwas z glukozy, jest ketogenny względem glicerolu, rośnie na etanolu jako jedynym źródle węgla i energii. Nie tworzy celulozy, nie tworzy brunatnego pigmentu. Komórki są elipsoidalne lub w kształcie krótkich pałeczek, występują pojedynczo, parami lub w łańcuszkach, są nieruchliwe, nie tworzą przetrwalników, są Gram- ujemne. Na podłożach o ph poniżej 4,5 - rosną i utleniają alkohol. Tabela przedstawia biotechnologiczną charakterystykę szczepu Acetobacter aceti MW-2 w warunkach wyrównanego przebiegu wgłębnej hodowli. Tabela Nr kolejny cyklu fermentacyjnego Czas trwania cyklu fermentacyjnego [b] Końcowa zawartość kwasu octowego g/100 cm3 Zawartość biomasy bakterii jako s.m. mg/dm3 Właściwa szybkość tworzenia produktu mg/mg/h 1 14,75 10,28 170,5 23,0 2 14,25 10,28 185,0 23,3 3 14,50 10,35 178,0 23,2 4 14,50 10,30 185,4 22,4 5 14,25 10,02 181,6 21,5 6 15,00 10,38 176,0 23,3 Przykład. Roztwór zawierający składniki pożywki w dawkach na 1 dm3: 10 cm3 octowego wyciągu z biomasy drożdży piekarskich 1g glukozy, 0,45g fosforanu dwuamonowego, 0,13g siarczanu potasu, 0,3g siedmiowodnego siarczanu magnezu, rozlewa się po 90 cm3 do sterylnych kolb stożkowych na 250 cm3 i dodaje po 0,3g agaru do każdej kolby. Kolby, po zamknięciu sterylnym korkiem z waty, na okres minut, umieszcza się na wrzącej łaźni wodnej do momentu rozpławienia agaru. Do każdej kolby dodaje się po 7 cm3 lub 8 cm3 lodowatego kwasu octowego. W okresie rozpławiania agaru i stygnięcia, bezpośrednio po dodaniu kwasu octowego, następuje wyjaławianie podłoża. Po ostygnięciu do około 40 C, do kolb dodaje się jałowo po 4,2 cm3 spirytusu rektyfikowanego. Na podłożu tym w warunkach stacjonarnej hodowli powierzchniowej przechowuje się wyizolowany szczep Acetobacter aceti MW-2 przez kilka lat z zachowaniem niezmiennych cech jego przydatności technologicznej. Hodowlę prowadzi się w cieplarce w temperaturze C, lub w temperaturze pokojowej. W zależności od warunków hodowli, przeszczepień na kolejne, świeże podłoże dokonuje się w odstępach 3-30 dni. Bakteriami z jednej kolby może być szczepione podłoże w jednej lub w dwóch, trzech kolbach. Jako pośrednie stadium stosuje się fermentor laboratoryjny o objętości kilku dm3. W opisywanym przykładzie stosuje się fermentor o objętości około 4 dm3. Przed przystąpieniem do szczepienia fermentora przygotowuje się w nim 2 dm3 mieszaniny octu i brzeczki fermentacyjnej. Mieszanina ta zawiera 7 g/100 cm3 kwasu octowego i 4% objętościowych alkoholu. Zawartość fermentora pasteryzuje się w temperaturze C przez kilka minut. Stosowana brzeczka zawiera 11% objętościowych alkoholu i 1 g/100 cm3kwasu octowego oraz składniki pożywki w następujących dawkach: wyciąg drożdżowy w dawce 0,75 cm3/dm3, glukozę w dawce 1,5 g/dm3, fosforan dwuamonowy w dawce 0,42 g/dm3, siarczan potasu w dawce 0,12 g/dm3, siedmiowodny siarczan magnezu w dawce 0,25 g/dm3. Przed szczepieniem uruchamia się mieszadło w fermentorze i doprowadza temperaturę cieczy do około 28 C. Ciecz zawartą w fermentorze szczepi się biomasą bakterii zebraną z powierzchni podłoża półciekłego z kilku do dwudziestu kilku kolb. Od tego momentu temperaturę cieczy utrzymuje się na stałym poziomie natomiast intensywność mieszania i napowietrzania

6 dostosowuje się do szybkości pobierania tlenu przez bakterie. Najkorzystniejsze jest utrzymywanie w tym okresie stopnia nasycenia cieczy tlenem w granicach 50-70%. Wskazane jest dolewanie do fermentora, co najmniej raz na dobę, po około 100 cm3 mieszaniny octu i brzeczki o podanym wcześniej składzie. Po odfermentowaniu alkoholu do 0,5% objętościowych z fermentora usuwa się część cieczy, pozostawiając około 1,5 dm3 i dodaje taką samą objętość brzeczki. Jednocześnie fermentor przemysłowy napełnia się mieszaniną brzeczki i octu, która zawiera około 4% objętościowych alkoholu i 7 g/100 cm3 kwasu octowego, podobnie jak w fermentorze laboratoryjnym przed jego szczepieniem kulturą bakterii pobraną z podłoża półciekłego. Mieszaninę tę napowietrza się i doprowadza do temperatury C. Następnie zawartość fermentora przemysłowego szczepi się inoculum pochodzącym z fermentora laboratoryjnego, w którym prowadzi się fermentacje w znany sposób, przy czym ocet otrzymywany w kolejnych cyklach fermentacyjnych dodaje się, bez przerw w napowietrzaniu, do napowietrzonej brzeczki w fermentorze przemysłowym. Po wlaniu kilku partii cieczy z fermentora laboratoryjnego do fermentora przemysłowego stwierdza się przyrost zawartości kwasu octowego. Po osiągnięciu przyrostu zawartości kwasu octowego powyżej 0,5 g/100 cm3 w ciągu doby proces szczepienia fermentora przemysłowego można uznać za zakończony. Od tego momentu fermentację prowadzi się w znany sposób. Ocet otrzymywany w fermentorze przemysłowym jest następnie stosowany do zapoczątkowania fermentacji w kolejnych fermentorach przemysłowych w znany sposób. Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 cgz. Cena zł