(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2016/15 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/28 ( ) A61K 39/395 ( ) A61P 37/06 ( ) C07K 16/46 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Środek do leczenia choroby (30) Pierwszeństwo: GB GB (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/51 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2016/10 (73) Uprawniony z patentu: Biotest AG, Dreieich, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 MATTHIAS GERMER, Langen, DE FRANK OSTERROTH, Dietzenbach, DE SILKE AIGNER, Frankenthal, DE CHRISTOPH UHEREK, Seligenstadt, DE ELMAR KRAUS, Bad Vilbel, DE ANDREA WARTENBERG-DEMAND, Linden, DE DANIELE WOLF, Dreieich, DE SIBYLLE KAISER, Zwingenberg, DE JUERGEN LINDNER, Frankfurt, DE CHRISTOPH BRUECHER, Eschborn, DE BENJAMIN DAELKEN, Frankfurt am Main, DE GREGOR SCHULZ, Umkirch, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 17P38126PL00 EP B Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy leczenia chorób autoimmunologicznych. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest środek, który jest humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym, które można podawać pacjentom w dawkowaniach wyższych niż opisywane uprzednio. Jest on szczególnie skuteczny u pacjentów, których choroby lub charakterystyka wymagają do skutecznego leczenia wyższych dawek. W opisie przedstawiono kompozycję farmaceutyczną zawierającą środek, taki jak przeciwciało, w skutecznym stężeniu, jak również zastosowania i sposoby leczenia z wykorzystaniem kompozycji i leków zawierających ten środek. [0002] Reakcja autoimmunologiczna jest to niemożność rozpoznania przez organizm własnych części składowych (aż do poziomów submolekularnych) jako własnych, czego skutkiem jest powstanie odpowiedzi immunologicznej przeciwko własnym komórkom i tkankom organizmu. Każdą chorobę będącą skutkiem takiej nieprawidłowej odpowiedzi immunologicznej nazywa się chorobą autoimmunologiczną. Do chorób autoimmunologicznych należą stwardnienie rozsiane (MS), reumatoidalne zapalenie stawów (RA), łuszczyca, łuszczycowe zapalenie stawów, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, choroba Crohna, miastenia (MG), autoimmunologiczny zespół niewydolności wielogruczołowej typu II (APS-II), zapalenie tarczycy Hashimoto (HT), cukrzyca typu 1 (T1D), toczeń

3 rumieniowaty układowy (SLE) i autoimmunologiczny zespół limfoproliferacyjny (ALS). [0003] Do choroby autoimmunologicznej dochodzi wtedy, gdy komórki T rozpoznają cząsteczki własne organizmu i reagują na nie; to znaczy cząsteczki wytwarzane przez komórki gospodarza. Aktywacja autoreaktywnych komórek T poprzez prezentację autoantygenów poddanych obróbce przez komórki prezentujące antygen (ang. antigen presenting cells - APC) prowadzi do ich klonalnego namnażania się i migracji do swoistych tkanek, gdzie indukują one zapalenie i niszczenie tkanek. [0004] Zazwyczaj komórki T wykazują tolerancję wobec tkanki autologicznej i reagują tylko przy prezentacji struktur heterologicznych. Dwoma mechanizmami, poprzez który układ immunologiczny uniemożliwia autoreaktywnym komórkom T indukcję ich szkodliwych funkcji, są tolerancja ośrodkowa i tolerancja obwodowa. W tolerancji ośrodkowej pośredniczy selekcja negatywna. Proces ten obejmuje eliminację przez klonalną delecję autoreaktywnych komórek T w czasie rozwoju ontogennego w grasicy. [0005] Tolerancja obwodowa jest mechanizmem zapasowym, działającym w sytuacji niepowodzenia tolerancji ośrodkowej, gdy komórki autoreaktywne wydostaną się z grasicy. Ten mechanizm tolerancji działa w sposób ciągły przez całe życie i utrzymuje komórki autoreaktywne pod kontrolą poprzez ignorowanie immunologiczne (anergię), delecję obwodową i(lub) aktywną supresję. [0006] Regulatorowe komórki T (Treg, uprzednio określane również mianem komórek supresorowych ) jako

4 część aktywnej supresji utrzymują tolerancję obwodową i regulują reakcję autoimmunologiczną (Suri-Payer i wsp., J Immunol. 157: (1996); Asano i wsp., J Exp. Med. 184: (1996); Bonomo i wsp., J. Immunol. 154: (1995); Willerford i wsp., Immunity 3: (1995); Takahashi i wsp., Int. Immunol. 10: (1998); Salomon i wsp., Immunity 12: (2000); Read i wsp., J Exp. Med. 192: (2000). Ogólnie, regulatorowe komórki T hamują aktywację i(lub) czynność efektorowych komórek T pomocniczych typu 1 (TH1) i TH2. Dysregulacja częstotliwości lub działania komórek Treg może prowadzić do ciężkich chorób autoimmunologicznych (Baecher-Allan i wsp., Immunol. Review 212: (2006); Shevach, Annu. Rev. Immunol. 18: (2000); Salomon i wsp., Immunity 12: (2000); Sakaguchi i wsp., Immunol. Rev. 182: (2001)). [0007] Określono kilka podgrup regulatorowych komórek T. Rodzina Treg składa się z dwóch kluczowych podgrup: Treg występujących naturalnie, na przykład CD4 + CD25 +, i Treg indukowanych obwodowo - Tr1 i Th3. Ponadto u ludzi i u gryzoni opisano Treg NK i Treg CD8 + (Fehervari i wsp., J. Clin. Investigation 114: (2004)). [0008] Pochodzące z grasicy komórki Treg (występujące naturalnie Treg CD4 + CD25 + ) są głównym komórkami regulatorowymi odgrywającymi rolę w regulacji reakcji autoimmunologicznej lub patogennych odpowiedzi immunologicznych. i) są one komórkami T CD4 + i stanowią 5-10% obwodowych komórek T CD4 + ii) dojrzewają w grasicy

5 iii) ogólnie cechują się skojarzoną ekspresją receptora IL-2 (CD25), drobnocząsteczkowej izoformy cząsteczki CD45, CD152 (CTLA-4) i czynnika transkrypcji FoxP3. [0009] Rolę Treg najlepiej ilustrują doświadczenia obejmujące odtworzenie komórek CD4 + u nagich myszy z niedoborem odporności, o zmniejszonej liczbie komórek CD25 +. U nagich myszy z odtworzeniem komórek CD4 + CD25 - pojawiają się rozmaite narządowo swoiste choroby autoimmunologiczne, takie jak zapalenie żołądka, zapalenie jajników, zapalenie jąder i zapalenie tarczycy (Suri-Payeri wsp.; J. Immunol. 160: (1998)). [0010] Włączenie podgrupy CD4 + CD25 + do doświadczeń nad odtwarzaniem u nagich myszy zapobiega pojawieniu się tych chorób (Sakaguchi i wsp., J Immunol. 155: (1995)). Wartość ochronną komórek CD4 + CD25 + w stosunku do narządowo swoistej reakcji autoimmunologicznej wykazano również w kilku innych modelach reakcji autoimmunologicznej (takich jak na przykład autoimmunologiczne zapalenie żołądka, zapalenie prostaty, zapalenie jajników, kłębuszkowe zapalenie nerek, zapalenie najądrzy i zapalenie tarczycy) wywoływanej przez usunięcie grasicy w okresie noworodkowym, 3 dni po urodzeniu (d3tx) lub w nieswoistym zapaleniu jelit wywołanym przez odtworzenie u myszy SCID komórek T CD4 + CD25 - o dużej zawartości CD45RB. Również podawanie przeciwciała anty-cd25 in vivo u myszy indukuje zlokalizowaną narządowo chorobę autoimmunologiczną.

6 [0011] Odkrycie znaczenia regulatora transkrypcji FoxP3 w czynności mysich regulatorowych komórek T CD4 + CD25 + i uprzednie obserwacje, że u pacjentów z zespołem IPEX (dysregulacja układu immunologicznego, poliendokrynopatia, enteropatia i dziedziczenie sprzężone z chromosomem X) ciężką chorobą zapalną podobną do tych stwierdzanych u myszy z niedoborem komórek regulatorowych CD4 + CD25 + (zespół scurfy) - występują mutacje w FoxP3, dowiodły bezpośredniej korelacji między autoimmunologicznym modelem zwierzęcym, mysimi regulatorowymi komórkami T a chorobą autoimmunologiczną u ludzi (Sakaguchi i wsp., J Immunol. 155: (1995)). [0012] Mechanizm farmaceutyczny regulatorowych komórek T nie jest w pełni jasny. Treg CD4 + CD25 + hamują aktywację poliklonalnych i swoistych antygenowo komórek T. W tej supresji rolę odgrywa zależny od kontaktu komórek mechanizm wymagający aktywacji Treg CD4 + CD25 + poprzez TCR, lecz Treg nie wykazują odpowiedzi proliferacyjnej po aktywacji TCR lub stymulacji przeciwciałami mitogennymi (anergicznymi) (Shevach, Nature Rev. Immunol 2 : 389 (2002). Po stymulacji są one kompetentne by hamować, w sposób niezależny od antygenów, odpowiedź komórek T CD4 + i komórek T CD8 +, jak również hamować aktywację komórek B i ich klonalne namnażanie się. [0013] Dostępne są dodatkowe dane wskazujące, że aktywność supresorowa Treg CD4 + CD25 + zależy również częściowo od cytokin przeciwzapalnych, takich jak TGF-β (Kingsley i wsp., J Immunol. 168: 1080 (2002); Nakamura i wsp., J Exp. Med. 194: (2001)). Za znaczeniem

7 czynnościowym wydzielania TGF-β przemawia także stwierdzenie, że u myszy z niedoborem TGF-β rozwija się choroba autoimmunologiczna i że podawanie przeciwciał neutralizujących TGF-β znosi in vivo zapobieganie reakcji autoimmunologicznej lub aktywności indukującej tolerancję przez komórki T CD4 + w niektórych modelach. [0014] W obrębie podgrupy CD4 + komórek T mogą istnieć jeszcze co najmniej dwa inne typy komórek o czynności supresyjnej, które ulegają indukcji po ekspozycji na swoisty antygen egzogenny (zwane adaptywnymi lub indukowalnymi regulatorowymi komórkami T ): komórki T regulatorowe typu 1 (Tr1) i komórki Th3. Te typy komórek można odróżnić od Treg CD4 + CD25 + na podstawie profili wytwarzania cytokin. Powiązania między tymi różnymi typami nie są jednak jasne, a ich mechanizm działania częściowo się nakłada. [0015] Komórki Tr1 indukowano przez wielokrotną stymulację TCR w obecności IL-10 i wykazano, że głównie regulują one w dół odpowiedzi immunologiczne poprzez wytwarzanie IL-10 na wysokich poziomach i umiarkowanych ilości TGF-β (Chen i wsp., J. Immunol. 171: (2003)). [0016] Komórki Th3 (identyfikowane w modelu EAE po doustnym dostarczeniu antygenu) wytwarzają duże ilości TGF-β i zmienne ilości IL-4 i IL-10. Wykazano, że sama IL-4 jest kluczowym czynnikiem różnicowania komórek Th3, w przeciwieństwie do komórek Tr1, które ulegają różnicowaniu pod wpływem IL-10 (Chen i wsp., Science 265: (1994)). [0017] Supresja czynności komórek T przez zastosowanie leków immunosupresyjnych jest główną strategią

8 terapeutyczną z powodzeniem stosowaną w leczeniu chorób autoimmunologicznych. Leki te indukują jednak ogólną immunosupresję z powodu swojej słabej selektywności, co powoduje zahamowanie nie tylko szkodliwych funkcji układu immunologicznego, lecz także funkcji użytecznych. W wyniku tego pojawiają się pewne zagrożenia, może nastąpić na przykład zakażenie, nowotworór i toksyczność leków. [0018] Środki zakłócające funkcję komórek T są filarem terapii rozmaitych chorób autoimmunologicznych. [0019] Podejście polegające na stosowaniu środków mających na celu aktywację regulatorowych komórek T w terapii chorób autoimmunologicznych okazywało się do tej pory niezwykle trudne. Aktywacja Treg poprzez TCR z wykorzystaniem agonistycznych przeciwciał anty-cd3 OKT- 3 (Abramowicz i wsp., N Engl. J Med Sep 3;327(10):736) lub poprzez cząsteczkę kostymulującą CD28 z zastosowaniem superagonistycznych przeciwciał anty-cd28 TGN 1412 prowadzi do całkowitego zaniku populacji regulatorowych komórek T, jak również innych konwencjonalnych komórek T oraz do ogólnoustrojowego indukowania i uwalniania nadmiernych ilości cytokin prozapalnych, w tym IFN-γ, TNF-α IL-1 i IL-2, czego skutkiem jest objawiający się klinicznie zespół uwalniania cytokin (ang. cytokine release syndrome - CRS) u ludzi (Suntharalingam i wsp., Ν Engl. J Med Sep 7;355(10): ). [0020] Po pierwszych 2 do 3 wstrzyknięciach 5 mg przeciwciała monoklonalnego OKT3 u większości pacjentów rozwija się zespół uwalniania cytokin z wysokimi poziomami czynnika martwicy nowotworów alfa,

9 interleukiny 2 i gamma-interferonu, pojawiającymi się w ciągu 1-2 godz. w krążeniu u biorców przeszczepu nerki (Abramowicz i wsp., Transplantation Apr;47(4):606-8). Skutkiem tego jest wąskie okno terapeutyczne, co ogranicza użyteczność tego przeciwciała w leczeniu choroby autoimmunologicznej. [0021] Leczenie dawką całkowitą 5-10 mg TGN1412 (0,1 mg anty-cd28 na kilogram masy ciała) prowadzi do ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej z niewydolnością wielonarządową w ciągu 90 minut od otrzymania pojedynczej dożylnej dawki TGN1412 (Suntharalingam i wsp., N Engl. J Med Sep 7;355(10): ). [0022] Istnieje ogólna zgoda co do tego, że komórki CD4 T odgrywają główną rolę w zapoczątkowywaniu i podtrzymywaniu reakcji autoimmunologicznej. Zgodnie z tym, proponuje się stosowanie mab przeciwko cząsteczkom powierzchniowym komórek T CD4, zwłaszcza mab anty-cd4, jako środków immunosupresyjnych. Jakkolwiek wiele badań klinicznych potwierdziło potencjalnezainteresowanie tym podejściem, ujawniły one również kilka problemów, które należałoby pokonać, żeby mab anty-cd4 lepiej nadawały się do zastosowania w rutynowej praktyce klinicznej. [0023] Proponuje się kilka różnych mechanizmów działania mab CD4, w tym: (1) antagonizm interakcji CD4-MHC II, prowadzący do zahamowania aktywacji komórek T, (2) modulację receptora CD4, określaną na podstawie zmniejszenia ekspresji CD4 na powierzchni komórek, (3) częściowe przekazywanie sygnałów poprzez receptor CD4 przy braku usieciowania receptora komórek T, które może hamować późniejszą aktywację komórek T i powodować apoptotyczną śmierć komórek T CD4, (4) cytotoksyczność

10 zależną od dopełniacza (CDC) lub cytotoksyczność zależną od przeciwciał (ADCC) z Fc jako mediatorem powodujące zanik komórek T CD4, i (5) stymulację regulatorowych komórek T. [0024] Cytotoksyczność zależna od dopełniacza (CDC) lub cytotoksyczność zależna od przeciwciał (ADCC) z Fc jako mediatorem powodujące zanik komórek T CD4 jest to najważniejszy z obserwowanych mechanizmów, wykazany zwłaszcza w odniesieniu do przeciwciał z podklasy IgG1. Innym mechanizmom przypisuje się tylko niewielką liczbę przeciwciał CD4, takich jak TRX-1, TNX-355, IDEC-151, OKTcdr4A, przy czym jedynie TRX-1 stanowi IgG1 (Schulze-Koops i wsp., J Rheumatol. 25(11): (1998); Mason i wsp., J Rheumatol. 29(2): (2002); Choy i wsp., Rheumatology 39(10): (2000); Herzyk i wsp., Infect Immun. 69(2): (2001); Kon i wsp., Eur Respir J. 18(1): (2001); Mourad i wsp., Transplantation 65(5): (1998); Skov i wsp., Arch Dermatol. 139(11): (2003); Jabado i wsp., J Immunol. 158(1): (1997)). [0025] W przypadku kilku przeciwciał CD4 obserwuje się zależny od dawki zanik komórek T CD4 + w wysokich dawkach (wiele cykli z dawkowaniami >100 mg) i przejściową sekwestrację (krótkotrwałą nieobecność) w niższych dawkach (wiele cykli z dawkowaniami >10 mg) (Mason i wsp., J. Rheumatol. 29 (2): (2002); Kon i wsp., Eur. Respir J. 18(1):45-52 (2001)) i HuMax- CD4 (Skov i wsp., Arch Dermatol. 139(11): (2003), Choy i wsp., Rheumatology 41 (10): (2002)). Mimo ich aktywności eliminowania, mab przeciwko CD4 nie wykazały korzystnego działania

11 klinicznego ani powtarzalnej skuteczności w badanych chorobach autoimmunologicznych, takich jak na przykład reumatoidalne zapalenie stawów (Strand i wsp., Nature Reviews 6: (2007)). Ponadto eliminowanie komórek T CD4 + T uważa się ogólnie za sytuację, która może powodować ciężką immunosupresję. [0026] Badano przeciwciała B-F5 (IgG1 myszowatych przeciwko ludzkim CD4) w różnych chorobach autoimmunologicznych. [0027] Niewielką liczbę pacjentów z ciężką łuszczycą leczono przeciwciałami myszowatych B-F5 i opisano pewne pozytywne efekty (Robinet i wsp., Eur J Dermatol 1996: 6: 141-6, i Robinet i wsp., J Am Acad Dermatol 1997; 36: 582-8). [0028] U pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów wyniki obserwowane w badaniu kontrolowanym placebo, z codzienną dawką B-F5, nie wykazały istotnej poprawy (Wendling i wsp. J Rheumatol;25(8): , 1998). [0029] U pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (MS) obserwowano pewne pozytywne efekty po 10-dniowym leczeniu. Byli to chorzy z postacią rzutowo-remisyjną; u niektórych z nich rzut nie wystąpił w ciągu 6- miesięcy po terapii (Racadot i wsp., J Autoimmun, 6(6):771-86, 1993). Podobne efekty obserwowali Rumbach i wsp. (Mult Scler;1(4):207-12, 1996). [0030] W ciężkiej chorobie Crohna nie obserwowano istotnej poprawy u pacjentów otrzymujących B-F5 przez 7 kolejnych dni (Canva-Delcambre i wsp., Aliment Pharmacol Ther 10(5):721-7, 1996). [0031] Donoszono, że przy zapobieganiu odrzuceniu alloprzeszczepów biodostępność B-F5 nie była

12 wystarczająca, żeby umożliwić wykorzystanie go do profilaktyki odrzucania alloprzeszczepów (Dantal i wsp. Transplantation, 27;62(10):1502-6, 1996). [0032] Z powyższego, jak się wydaje, wynika, że pierwszym problemem, który trzeba rozwiązać, jest konieczność stosowania dużych dawek mab do uzyskania poprawy klinicznej. Może to wynikać m.in. z małej dostępności limfocytów dla mab w tkankach docelowych. Zastosowanie większych dawek może powodować nadmierne działanie na limfocyty krwi i indukowanie niepożądanych efektów ubocznych. [0033] Inną wadą terapii przeciwciałami monoklonalnymi u ludzi jest to, że te przeciwciała na ogół uzyskuje się z komórek mysich i powodują one u biorców-ludzi odpowiedź przeciwko antygenom mysim. Powoduje to nie tylko zmniejszoną skuteczność leczenia, a nawet bardziej każdego przyszłego leczenia mysimi przeciwciałami monoklonalnymi, lecz także zwiększone ryzyko anafilaksji. [0034] Tej wady można zasadniczo uniknąć, używając przeciwciał humanizowanych, otrzymanych przez przeszczepienie regionów determinujących komplementarność (CDR) mysiego przeciwciała monoklonalnego, które determinuje swoistość wiązania antygenów, na regiony zrębowe (FR) ludzkiej cząsteczki immunoglobuliny. Celem humanizacji jest uzyskanie rekombinowanego przeciwciała o takich samych właściwościach wiązania antygenu, co mysie przeciwciało monoklonalne, z którego pochodzą sekwencje CDR, i znacznie mniej immunogenne u ludzi.

13 [0035] W niektórych przypadkach do przeniesienia właściwości wiązania antygenu (obejmujących nie tylko swoistość, lecz również powinowactwo do antygenu) wystarcza podstawienie CDR z przeciwciała mysiego w miejsce CDR ludzkich w ludzkich regionach zrębowych. W wielu przeciwciałach niektóre reszty FR mają jednak istotne znaczenie dla wiązania antygenów, ponieważ bezpośrednio stykają się one z antygenem w kompleksie przeciwciało-antygen albo dlatego, że wpływają na konformację CDR i przez to na wydajność wiązania przez nie antygenów. [0036] W większości przypadków konieczne jest zatem również podstawienie jednej lub kilku reszt zrębowych z przeciwciała mysiego w miejsce odpowiadających im ludzkich reszt FR. Jako że liczba podstawionych reszt musi być jak najmniejsza, żeby zapobiec reakcjom antymysim, problem polega na ustaleniu, która reszta lub które reszty aminokwasowe mają kluczowe znaczenie dla właściwości wiązania antygenu. Proponuje się różne metody wyboru miejsc najbardziej odpowiednich do substytucji. Jakkolwiek opracowano ogólne zasady, które mogą być użyteczne w pierwszych etapach humanizacji, ostateczny wynik jest różny w przypadku różnych przeciwciał. I tak w przypadku konkretnego przeciwciała bardzo trudno jest przewidzieć z góry, które substytucje zapewnią pożądany rezultat. [0037] Uprzednio próbowano humanizacji mysiego B-F5 i udało się wyprodukować humanizowane B-F5 (określane w dalszej części niniejszego opisu jako hb-f5) o podobnych właściwościach wiązania CD4, co rodzicielskie mysie B-F5.

14 [0038] I tak w WO 2004/ stwierdzono, że humanizowane przeciwciało BT061 (humanizowane B-F5 albo po prostu hb-f5) jest użyteczne w leczeniu chorób autoimmunologicznych, takich jak łuszczyca i reumatoidalne zapalenie stawów. W tym zgłoszeniu patentowym ujawniono kompozycje do podawania pozajelitowego wytwarzane w preparatach umożliwiających podawanie dawki od 0,1-10 mg, korzystnie od 1-5 mg. Przewidywane schematy dawkowania to dawka 1 mg dziennie dożylnie i 5 mg co drugi dzień u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów przez czas 10 dni. Największą ujawnianą dawką jest zatem jednorazowa dawka 5 mg i 25 mg w ciągu 10 dni. [0039] Wijdenes i wsp. opisali także, w abstrakcie i posterze przedstawionych na konferencji EULAR w czerwcu 2005, swoje badanie. Ujawniono leczenie 11 pacjentów cierpiących na reumatoidalne zapalenie stawów. Pacjentów leczono 5 dożylnymi wlewami po 5 mg BT061 co drugi dzień, z jednoczesnym leczeniem 150 mg diklofenakiem. [0040] Nie ujawniono, aby przeciwciało opisane w tym badaniu nadawało się do zastosowania w wyższych dawkach, i wciąż istnieje potrzeba znalezienia leczenia do zastosowania w większych dawkach, co umożliwiłoby leczenie większej liczby pacjentów. [0041] W odniesieniu do omówionego powyżej stanu techniki, celem niniejszego wynalazku jest leczenie pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi, którzy nie reagują zadowalająco na istniejące sposoby leczenia. W szczególności, celem niniejszego wynalazku jest opracowanie leczenia autoimmunologicznego, które można

15 zastosować u pacjentów w wysokich dawkach w celu ulepszenia odpowiedzi na leczenie u pacjentów, którzy obecnie nie reagują na leczenie. [0042] Nieoczekiwanie, doświadczenia przeprowadzone przez twórców wynalazku wykazały, że przeciwciało IgG1 BT061 w przeciwieństwie do innych mab przeciwko CD4, po związaniu z CD4 komórek docelowych nie indukuje ani ADCC, ani CDC, ani apoptozy. [0043] Zgodnie z tym niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję farmaceutyczną do zastosowania w leczeniu choroby autoimmunologicznej zawierającą farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i humanizowane przeciwciało anty- CD4 zdolne do aktywowania regulatorowych komórek T CD4 + CD25 +, przy czym kompozycja ma być podawana osobnikowi podskórnie w dawce humanizowanego przeciwciała anty-cd4 wynoszącej od 20 mg do 100 mg, przy czym dawka ma być podawana co tydzień, i przy czym humanizowane przeciwciało anty-cd4 zawiera domenę stałą IgG1 i posiada domeny V zdefiniowane poprzez następujące sekwencje polipeptydowe: - domena V łańcucha H: - domena V łańcucha L: 25 [0044] Niniejszy wynalazek dostarcza ponadto kompozycję farmaceutyczną do zastosowania w leczeniu choroby autoimmunologicznej zawierającą farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i humanizowane przeciwciało anty-

16 CD4 zdolne do aktywowania regulatorowych komórek T CD4 + CD25 +, przy czym kompozycja ma być podawana osobnikowi podskórnie w dawce humanizowanego przeciwciała anty-cd4 wynoszącej od 8 do 60 mg/m 2 pola powierzchni ciała osobnika, przy czym dawka ma być podawana co tydzień, i przy czym humanizowane przeciwciało anty-cd4 zawiera domenę stałą IgG1 i posiada domeny V zdefiniowane poprzez następujące sekwencje polipeptydowe: - domena V łańcucha H: - domena V łańcucha L: [0045] Niniejszy wynalazek dostarcza ponadto kompozycję farmaceutyczną do zastosowania w leczeniu choroby autoimmunologicznej zawierającą farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i humanizowane przeciwciało anty- CD4 zdolne do aktywowania regulatorowych komórek T CD4 + CD25 +, przy czym kompozycja ma być podawana osobnikowi podskórnie w dawce humanizowanego przeciwciała anty-cd4 wynoszącej od 0,2 do 1,5 mg/kg, przy czym dawka ma być podawana co tydzień, i przy czym humanizowane przeciwciało anty-cd4 zawiera domenę stałą IgG1 i posiada domeny V, zdefiniowane poprzez następujące sekwencje polipeptydowe:

17 16 - domena V łańcucha H: - domena V łańcucha L: 5 10 [0046] Dodatkowo, niniejszy wynalazek dostarcza zastosowania humanizowanego przeciwciała anty-cd4 zdolnego do aktywowania regulatorowych komórek T CD4 + CD25 + do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby autoimmunologicznej, przy czym humanizowane przeciwciało anty-cd4 zawiera domenę stałą IgG1 i posiada domeny V zdefiniowane poprzez następujące sekwencje polipeptydowe: - domena V łańcucha H: 15 - domena V łańcucha L: i przy czym kompozycja ma być podawana osobnikowi podskórnie w dawce humanizowanego przeciwciała anty-cd4 wynoszącej: (i) od 20 mg do 100 mg; (ii) od 8 do 60 mg/m pola powierzchni ciała osobnika, lub (iii) od 0,2 do 1,5 mg/kg, przy czym dawka ma być podawana co tydzień. [0047] Po zapoznaniu się z powyższym dawkowaniami należy zwrócić uwagę, że twórcy wynalazku stwierdzili, iż nieoczekiwanie humanizowane przeciwciało BT061 (humanizowane B-F5 albo po prostu hb-f5) nie powoduje

18 istotnej modulacji ani indukowania uwalniania cytokin prozapalnych w porównaniu z innymi przeciwciałami wchodzącymi w interakcję z komórkami T, takimi jak na przykład przeciwciała anty-cd3. Ponadto przeciwciało nie powoduje długotrwałego eliminowania limfocytów CD4 +. [0048] Stężenie przeciwciała nie jest szczególnie ograniczone, pod warunkiem, że przeciwciało jest obecne w stężeniu, które jest wysokie w porównaniu ze znanymi wartościami stężenia. Korzystnie jednak stężenie przeciwciała wynosi od 10 (lub powyżej 10) do 150 mg/ml, od 15 do 150 mg/ml, od 15 do 100 mg/ml, od 15 (lub powyżej 15) do 75 mg/ml lub od 20 do 60 mg/ml. Najkorzystniej, stężenie przeciwciała odpowiada (w przybliżeniu) dowolnej z wartości: 10 mg/ml, 12,5 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml lub 100 mg/ml. [0049] Objętość dawkowania podawanego osobnikowi z zastosowaniem kompozycji nie jest szczególnie ograniczona, pod warunkiem, że dostarcza ona wysokiego dawkowania całkowitego w porównaniu z dawkowaniami dotychczas znanymi, i przez to nadaje się do leczenia osobników, u których takie wysokie dawki mogą być korzystne, na przykład (bez ograniczania) w ciężkich przypadkach z długą historią choroby i niewystarczającą odpowiedzią na istniejące terapie. W szczególności, stężenie przeciwciała w danej objętości dawkowania może być różne, po to aby dostarczyć niezbędnych dawek, opisanych w niniejszym zgłoszeniu. [0050] Objętość dawkowania będzie różna w zależności od sposobu podawania. Gdy kompozycja ma być podawana przez

19 wstrzyknięcie podskórne, objętość dawkowania może wynosić od 0,1 do 3 ml, korzystnie od 0,5 do 1,5 ml, typowo około 1 ml. [0051] W niektórych przykładach wykonania kompozycję można jednak dostarczać w postaci stężonej i rozcieńczonej do mocy niezbędnej u danego osobnika. Korzystnie, w tych sytuacjach kompozycję dostarcza się we względnie małej objętości, wynoszącej około 1, 2, 3, 4 lub 5 ml. W alternatywnych przykładach wykonania kompozycję dostarcza się w niezbędnej mocy i w objętości dawkowania opisanej powyżej (to znaczy w postaci gotowej do podania). W jednym ze swoistych przykładów wykonania kompozycje farmaceutyczne do podawania podskórnego dostarcza się w postaci gotowej do podania, tak że mogą być one łatwo podawane przez personel niemedyczny. [0052] Jak wspomniano, dotychczas nie było wiadomo, że środki lumożliwiające leczenie chorób autoimmunologicznych można podawać w wysokich dawkowaniach, jakie przewiduje niniejszy wynalazek. Podczas gdy znane dawki środków umożliwiających leczenie chorób autoimmunologicznych są skuteczne u niektórych osób i w niektórych typach chorób, wiedza o tym, że mogą one być tolerowane w wyższych dawkach, otworzyła drogę do skuteczniejszego leczenia niektórych chorób autoimmunologicznych i niektórych klas pacjentów. [0053] Wynalazek zostanie zilustrowany jedynie przykładowo w odniesieniu do następujących rysunków, na których:

20 Fig. 1 przedstawia efekt BT061 na syntezę cytokin w hodowlach z krwi pełnej od 3 zdrowych dawców. Hodowle stymulowano w oddzielnych doświadczeniach 4 różnymi typami środków aktywujących: CD3=przeciwciała anty-cd3; LPS=lipopolisacharyd; PHA=fitohemaglutynina + przeciwciała anty-cd28; SEB= enterotoksyna B gronkowcowa + przeciwciała anty-cd28. Oznaczano różne cytokiny, aby zmierzyć efekty na różne subpopulacje leukocytów: komórki Treg (CD3: TGF-β, IL-10); monocyty/makrofagi (LPS: IL-10, TNFα, IL-1β); komórki Th2 (PHA: IL-4, IL-5, IL-13); komórki Th1 (SEB: IL-2, IFNγ); Fig. 2 przedstawia efekt BT061 w ludzkich hodowlach z krwi pełnej (dawcy z reumatoidalnym zapaleniem stawów) na syntezę cytokin wyzwalaną przez różne substancje stymulujące; Fig. 3 przedstawia sekwencję nukleotydową kodującą mysi region VH B-F5 (NR ID. SEKW. 5); Fig. 4 przedstawia sekwencję nukleotydową kodującą mysi region Vk B-F5 (NR ID. SEKW. 6); Fig. 5 przedstawia sekwencję nukleotydową (NR ID. SEKW. 3) fragmentu plazmidu kodującą region VH humanizowanego BF-5. Sekwencję kodującą region V podkreślono, a odpowiadającą jej sekwencję polipeptydową (NR ID. SEKW. 17) pokazano poniżej sekwencji nukleotydowej; Fig. 6 przedstawia sekwencję nukleotydową (NR ID. SEKW. 4) fragmentu plazmidu kodującą regiony VK humanizowanego BF-5. Sekwencję kodującą region V podkreślono, a odpowiadającą jej sekwencję

21 polipeptydową (NR ID. SEKW. 2) pokazano poniżej sekwencji nukleotydowej; Fig. 7A i 7B, odpowiednio, przedstawiają uwalnianie TFNα i IL-6 obserwowane w badaniu klinicznym z BT061 (pojedynczy wlew dożylny lub wstrzyknięcie podskórne) u zdrowych ochotników w porównaniu z poziomami obserwowanymi po podaniu przeciwciał monoklonalnych anty-cd3. Na rysunku podano poziomy dawek i czas do powrotu do normy. Wyniki w odniesieniu do TRX4 (oznaczone na rysunkach jako 2) opisano w Keymeulen i wsp., 2005 N. Engl. J. Med. Type 1 Diabetes patients. Wyniki w odniesieniu do teplizumabu (oznaczone na rysunkach jako 3) opisano w Herold i wsp., 2002 N. Engl. J. Med. Type I Diabetes patients. Wartości prawidłowe (oznaczone na rysunkach jako 4) opisano w Straub i wsp., 2007, Athr. & Rheumat. *) oznacza dawkę pojedynczą; **) oznacza dawkę skumulowaną, wstrzykiwaną do momentu osiągnięcia stężenia szczytowego. Fig. 8 przedstawia poziomy w osoczu IL-2 i IFN-γ po podaniu pojedynczej dawki dożylnej lub podskórnej BT061 u zdrowych ochotników. ULN = górna granica normy (ang. upper limit of normal); LLN = dolna granica normy (ang. lower limit of normal). Fig. 9 przedstawia kinetykę liczby komórek CD4 (komórek na ml osocza) u ochotników leczonych pojedynczą dawką dożylną BT061. Przedstawiono wartości średnie u 3 pacjentów na grupę dawkową. Linie kropkowane wskazują górną granicę normy (ULN) i dolną granicę normy (LLN).

22 Fig. 10 przedstawia kinetykę liczby komórek CD4 (komórek na ml osocza) u ochotników otrzymujących pojedynczą dawkę podskórną BT061. Przedstawiono wartości średnie u 3 pacjentów na grupę dawkową. Linie kropkowane wskazują górną granicę normy (ULN) i dolną granicę normy (LLN). Fig. 11, części A do H ukazują wykresy przedstawiające dane z badań klinicznych u pacjentów z łuszczycą z grupy dawkowej I jak opisano w przykładzie 7, w której pacjenci byli leczeni przez wstrzyknięcie dożylne 0,5 mg BT061 lub placebo. W częściach A do H Fig. 8 ukazano wykresy wyniku w skali PASI, odpowiednio, u pacjentów 1 do 8 z grupy dawkowej I. Fig. 12, części A do H ukazują wykresy z danymi z badań klinicznych u pacjentów z łuszczycą z grupy dawkowej II jak opisano w przykładzie 7, w której pacjenci byli leczeni przez wstrzyknięcie dożylne 2,5 mg BT061 lub placebo. W częściach A do H Fig. 9 ukazano wykresy wyniku w skali PASI, odpowiednio, u pacjentów 1 do 8 z grupy dawkowej II. Fig. 13, części A i B ukazują zdjęcia z badania klinicznego u pacjentów z łuszczycą opisanego w przykładzie 7. Zdjęcia przedstawiają tego samego pacjenta, który należał do grupy dawkowej II. Zdjęcie w części A wykonano przed leczeniem. Zdjęcie w części B wykonano 28 dni po leczeniu. Fig. 14 przedstawia wyniki badania klinicznego u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów opisanego w przykładzie 8. Na rysunku ukazano wykres słupkowy odsetka pacjentów z grup dawkowych otrzymujących podskórnie 1,25 mg, 6,25 mg, 12,5 mg i 25 mg BT061,

23 którzy osiągnęli co najmniej odpowiedź ACR20. Z każdej grupy 6 pacjentów otrzymywało dawkę przeciwciała, natomiast dwoje otrzymywało placebo. Fig. 15A i 15B przedstawiają wyniki badania klinicznego u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów opisanego w przykładzie 8. Fig. 15A przedstawia wykres słupkowy liczby bolesnych (tkliwych) stawów u pacjentów z grupy dawkowej otrzymującej 25 mg BT061 podskórnie. Fig. 15B przedstawia wykres słupkowy liczby obrzękniętych stawów u pacjentów z tej samej grupy dawkowej. Z każdej grupy 6 pacjentów otrzymywało dawkę przeciwciała, natomiast dwoje otrzymywało placebo. Fig. 16A i 16B przedstawiają wyniki badania klinicznego u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów opisanego w przykładzie 8. Na rysunkach ukazano indywidualne parametry (w %) u jednej osoby, która zareagowała na leczenie (Fig. 16A) i u jednej osoby, która nie zareagowała na leczenie (Fig. 16B), z grupy otrzymującej 25 mg podskórnie. Na rysunkach oznaczenia GA pacj. i GA lek. oznaczają, odpowiednio, ocenę globalną dokonywaną przez pacjenta i ocenę globalną dokonywaną przez lekarza. Termin PA bólu oznacza ocenę bólu przez pacjenta. Fig. 17A i 17B przedstawiają dalsze wyniki badania klinicznego u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów opisanego w przykładzie 8. Na rysunkach ukazano liczbę bolesnych stawów u pacjentów z grupy otrzymującej dawkę 1,25 mg podskórnie (Fig. 17A) i z grupy otrzymującej dawkę 6,25 mg podskórnie (Fig. 17B). Fig. 18A i 18B przedstawiają kolejne wyniki badania klinicznego u pacjentów z reumatoidalnym

24 zapaleniem stawów opisanego w przykładzie 8. Na rysunkach ukazano liczbę bolesnych stawów u pacjentów z grupy otrzymującej dawkę 50 mg podskórnie (Fig. 18A) i z grupy otrzymującej dawkę 6,25 mg dożylnie (Fig. 18B). Fig. 19 przedstawia dopasowanie sekwencji polipeptydowych VK B-F5 myszowatych (NR ID. SEKW. 8), FK-001 (NR ID SEKW. 9, 10, 11 i 12), L4L (NR ID. SEKW. 18) i L4M (NR ID. SEKW. 2) w schemacie humanizowanej postaci B-F5 (to znaczy BT061). Fig. 20 przedstawia dopasowanie sekwencji polipeptydowych VH B-F5 myszowatych (NR ID. SEKW. 7), M26 (NR ID SEKW. 13, 14, 15 i 16), H37L (NR ID. SEKW. 1) i H37V (NR ID. SEKW. 17) w schemacie humanizowanej postaci B-F5. [0054] W opisie zostanie teraz podanych więcej szczegółów. [0055] Środkami nadającymi się do zastosowania zgodnie z niniejszym opisem są środki zdolne do aktywowania regulatorowych komórek T CD4 + CD25 +. Środek może być polipeptydem, białkiem lub przeciwciałem. Gdy środek jest przeciwciałem, może to być przeciwciało monoklonalne. Korzystnie przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym anty-cd4. Przeciwciało może również korzystnie być przeciwciałem IgG1 i może być niezmodyfikowanym przeciwciałem IgG1. [0056] W korzystnym aspekcie po podaniu środek nie powoduje istotnego podwyższenia poziomu cytokin prozapalnych w osoczu krwi osobnika w porównaniu z przeciwciałami anty-cd3. W szczególności poziomy IFN-γ, TNF-α, IL-6 i/lub IL-2 po podaniu środka nie są istotnie podwyższone w porównaniu z poziomami w osoczu

25 mierzonymi u osobników zdrowych (zob. tabela A1). Konkretnie, jeżeli ULN danej cytokiny podaną w tabeli A1 przyjąć za X, to w ciągu 96 godzin po podaniu środka może dochodzić do mniej niż 20-krotnego podwyższenia poziomu X. Korzystnie może dochodzić do mniej niż 10- krotnego podwyższenia poziomu X. Korzystniej poziomy takie utrzymują się w okresie od 10 minut po rozpoczęciu podawania do 96 godzin po zakończeniu podawania. [0057] Możliwe, że u pacjentów z zaburzeniami autoimmunologicznymi poziomy cytokin przed podaniem środka są już wyższe niż poziomy obserwowane u osobników zdrowych (ULN podana w tabeli A1), na przykład z powodu modyfikacji stanu aktywacji komórek immunologicznych w porównaniu ze stanem aktywacji komórek u osobników zdrowych. W tych przypadkach stężenie danej cytokiny bezpośrednio przed podaniem środka przyjmuje się za X i w ciągu 96 godzin po podaniu środka może dochodzić do mniej niż 20-krotnego podwyższenia poziomu X. Korzystnie może dochodzić do mniej niż 10-krotnego podwyższenia poziomu X. Korzystniej poziomy takie utrzymują się w okresie od 10 minut po rozpoczęciu podawania do 96 godzin po zakończeniu podawania.

26 25 5 Tabela A1: Poziomy cytokin oznaczane w osoczu zdrowych ochotników. ULN (górną granicę normy) oblicza się na podstawie wartości średnich oznaczonych u 39 indywidualnych osobników + 2 x odchylenie standardowe Cytokina ULN (pg/ml) IL-2 19,4 IL-6 4,4 TNF-alfa 2,8 IFN-gamma 3, [0058] W kolejnym korzystnym aspekcie środek nie powoduje istotnego, długotrwałego zmniejszenia liczby komórek limfocytów CD4 + w osoczu krwi osobnika. Bardziej konkretnie, w okresie 72 do 96 godzin po podaniu liczba komórek limfocytów CD4 + w osoczu krwi osobnika może być większa od 250 komórek/µl (lub co najmniej 250 komórek/µl). [0059] Korzystnie, efekty na cytokiny i limfocyty CD4 + opisane powyżej obserwuje się u co najmniej 80% leczonych pacjentów. [0060] W stanie techniki wiadomo, aby zapobiec negatywnemu wpływowi na układ immunologiczny, na przykład zmniejszeniu liczby limfocytów lub indukowaniu uwalniania cytokin, można stosować przeciwciała (zwłaszcza przeciwciała wchodzące w interakcje z komórkami T) z podklasy IgG2, IgG3 lub IgG4, ponieważ przeciwciała z podklasy IgG1 wykazują silniejsze interakcje z receptorem Fc. W stanie techniki wiadomo również, że można modyfikować przeciwciała (zwłaszcza przeciwciała wchodzące w interakcje z komórkami T)

27 przez mutację Fc, deglikozylację, glikomodyfikację lub glikoinżynierię w celu osłabienia interakcji receptora Fc. [0061] W opisywanych tu doświadczeniach twórcy wynalazku stwierdzili, że w przypadku środka według niniejszego wynalazku nie jest konieczne unikanie przeciwciał z podklasy IgG1 i modyfikacje. W szczególności, dane przedstawione w niniejszym zgłoszeniu patentowym wskazują, że środek nie powoduje istotnego i długotrwałego eliminowania komórek CD4 + ani nie indukuje istotnego uwalniania cytokin w porównaniu z przeciwciałami anty-cd3. [0062] Zgodnie z tym, w korzystnym aspekcie środek jest niezmodyfikowanym przeciwciałem IgG1, to znaczy przeciwciałem, które nie zawiera mutacji Fc i którego nie poddano deglikozylacji, glikomodyfikacji ani glikoinżynierii w celu osłabienia interakcji receptora Fc, albo jego fragmentem lub pochodną. [0063] Przeciwciałami najlepiej nadającymi się do zastosowania według niniejszego opisu są humanizowane przeciwciała anty-cd4 lub ich fragmenty lub pochodne, zdolne do aktywowania regulatorowych komórek T CD4 + CD25 +. Przykłady przeciwciał zdolnych do aktywowania regulatorowych komórek T CD4 + CD25 + omówiono w Becker i wsp., (European Journal of Immunology (2007), t. 37: str ). [0064] Ogólnie, przeciwciało stosowane zgodnie z opisem zawiera także ludzki region stały (Fc). Ten region stały można dobierać spośród domen stałych z dowolnej klasy immunoglobulin, w tym IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i z dowolnego izotypu, w tym IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.

28 Korzystne regiony stałe dobiera się spośród domen stałych IgG, w szczególności IgG1. [0065] Niniejszy opis obejmuje również dowolny fragment przeciwciała zawierający jego regiony V. Obejmuje to zwłaszcza fragmenty Fab, Fab', F(ab)'2, Fv i scfv. [0066] W szczególnie korzystnym aspekcie niniejszego opisu przeciwciało jest humanizowanym przeciwciałem anty-cd4 lub jego fragmentem lub pochodną, pochodzącym z mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-cd4 B-F5. Przykładem takiego przeciwciała jest przeciwciało BT061. Przeciwciało BT061 oraz jego fragmenty i pochodne. [0067] Humanizowane przeciwciało BT061 (hb-f5) pochodzi z mysiego mab B-F5 i posiada domeny V zdefiniowane poprzez następujące sekwencje polipeptydowe: - domena V łańcucha H: - domena V łańcucha L: [0068] Do zastosowania zgodnie z niniejszym opisem nadają się także pochodne tego przeciwciała. Do pochodnych należą pochodne z domenami V zdefiniowanymi przez sekwencje polipeptydowe o co najmniej 80%, korzystnie co najmniej 90%, najkorzystniej co najmniej 95% identyczności sekwencji z NR ID. SEKW. 1 lub NR ID. SEKW. 2.

29 [0069] Szczególnie korzystne są przeciwciała zawierające regiony determinujące komplementarność (CDR) mysiego mab B-F5 i zachowujące zdolność hb-f5 do aktywowania regulatorowych komórek T CD4+CD25+. Umiejscowienie CDR w obrębie domen VH i VK przedstawiono na Fig. 19 i 20. Takie przeciwciała mogą ewentualnie wykazywać zmienność sekwencji CDR, niewpływającą w istotny sposób na swoistość ani powinowactwo wiązania. [0070] Ogólnie, stosowane przeciwciało hb-f5 zawiera ponadto ludzki region stały (Fc). Jak wskazano powyżej, ten region stały można dobierać spośród domen stałych z dowolnej klasy immunoglobulin, w tym IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i z dowolnego izotypu, w tym IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Korzystne regiony stałe dobiera się spośród domen stałych IgG, zwłaszcza IgG1. [0071] Niniejszy opis obejmuje również dowolny fragment przeciwciała BT061 zawierający jego regiony V. Obejmuje to w szczególności fragmenty Fab, Fab', F(ab)'2, Fv i scfv. [0072] Polinukleotyd kodujący domenę V łańcucha H lub łańcucha L przeciwciała BT061 można poddawać fuzji z polinukleotydem kodującym region stały ludzkiego łańcucha H lub L, żeby uzyskać ekspresję pełnych łańcuchów H i L otrzymanych w ten sposób; można również dodawać sekwencję kodującą peptyd sygnałowy, umożliwiającą wydzielanie białka. [0073] W opisie wykorzystuje się także kasety ekspresyjne, w których polinukleotyd jak opisano powyżej sprzęga się z odpowiednimi sekwencjami kontrolnymi, umożliwiającymi regulację jego

30 transkrypcji i translacji w wybranej komórce gospodarza, i rekombinowane wektory zawierające polinukleotyd lub kasetę ekspresyjną według opisu. [0074] Te rekombinowane konstrukty DNA można otrzymywać i wprowadzać do komórek gospodarza dobrze znanymi metodami rekombinacji DNA i inżynierii genetycznej. [0075] W opisie wykorzystuje się także komórkę gospodarza transformowaną polinukleotydem według opisu. [0076] Użytecznymi komórkami-gospodarzami według niniejszego opisu mogą być komórki prokariotyczne lub eukariotyczne. Spośród odpowiednich komórek eukariotycznych można wymienić na przykład komórki roślinne, komórki drożdży, takie jak Saccharomyces, komórki owadów, takie jak Drosophila lub Spodoptera, i komórki ssaków, takie jak HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS itd. [0077] Konstruowanie wektorów ekspresyjnych omawianych w opisie i transformację komórek gospodarza można przeprowadzać standardowymi metodami biologii molekularnej. [0078] Przeciwciało BT061 (hb-f5) stosowane według niniejszego wynalazku można otrzymywać przez hodowanie komórki gospodarza zawierającej wektor ekspresyjny zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą to przeciwciało, w warunkach odpowiednich do jego ekspresji, i odzyskiwanie tego przeciwciała z hodowli komórek gospodarza. Konstruowanie humanizowanego B-F5 Schemat regionów VH i VK humanizowanego B-F5 [0079] Sekwencje DNA kodujące regiony VH i VK mysiego B-F5 przedstawiono, odpowiednio, na Fig. 3 i Fig. 4 i

31 pod identyfikatorami sekwencji NR ID. SEKW. 5 i NR ID. SEKW. 6. Ludzkie VH i VK, na które przeszczepiono mysie CDR, dobrano poprzez przeszukiwanie baz danych pod kątem ludzkiego VH najbardziej podobnego do oryginalnych VH i VK mysiego B-F5. Największą homologię z VH B-F5 wykazywał region VH ludzkiego przeciwciała M26 (nr dostępu A36006). Największą homologię z VK B-F5 wykazywał region VK innego przeciwciała ludzkiego (FK- 001; NAKATANI i wsp., Biotechnology, 7 (1989), )). [0080] Skonstruowano dwa typy VK, różniące się między sobą tym, że resztą 4. była leucyna lub metionina, i oznaczono je jako L4L i L4M. Skonstruowano dwa typy VH, różniące się między sobą tym, że resztą aminokwasową 37. była leucyna lub walina, i oznaczono je jako H37L i H37V. Dopasowanie sekwencji polipeptydowych B-F5, FK- 001, L4L i L4M przedstawiono na Fig. 19. Dopasowanie sekwencji polipeptydowych B-F5, M26, H37L i H37V przedstawiono na Fig. 20. Reszty FR, o których uprzednio donoszono, że są istotne dla pakowania CDR (Chothia i wsp., Nature 342(1989), 877; Foote i wsp., J. Mol. Biol., 224(1992), 487), zaznaczono ramkami. [0081] Przez kojarzenie tych VH i VK utworzono 4 wersje regionów V. Ekspresja humanizowanego B-F5 [0082] Kolejne etapy wytwarzania humanizowanego B-F5 były takie same jak ujawniono w patencie Stanów Zjednoczonych 5,886,152 w odniesieniu do humanizowanego B-B10. [0083] Pokrótce, oddzielnie skonstruowano plazmidy ekspresyjne łańcucha H (humanizowany region VH poddany

32 fuzji z regionem stałym ludzkiego łańcucha y-1 (TAKAHASHI i wsp., Cell, 29 (1982), )) i łańcucha L (humanizowany region VK poddany fuzji z regionem stałym łańcucha K FK-001) humanizowanego B-F5. W tych plazmidach ekspresja humanizowanego B-F5 jest kontrolowana przez promotor/wzmacniacz genu ludzkiej monoklonalnej IgM - FK-001. Fig. 5 i 6, odpowiednio, przedstawiają fragmenty plazmidów kodujące regiony VH i VK humanizowanego BF-5. Sekwencje kodujące region V podkreślono, a odpowiadające im sekwencje polipeptydowe wskazano poniżej sekwencji nukleotydowej. Oba plazmidy i psv2neo jednocześnie wprowadzano do Sp2/0 szpiczaka mysiego (ATCC CRL-1581), stosując Lipofectin ni. Metodą ELISA wyselekcjonowano transfektomy wytwarzające ludzką IgG, stosując przeciwciało przeciwko ludzkiej IgG (łańcuch y) i przeciwciało przeciwko łańcuchowi K ludzkiej Ig. Charakterystyka różnych wersji humanizowanego B-F5 Szacowanie aktywności wiązania CD4 [0084] Zebrano supernatanty hodowli transfektom wytwarzanych przez cztery wersje hb-f5 i zatężono je. Różne przeciwciała oczyszczano z supernatantów hodowli metodą chromatografii powinowactwa, stosując białko A Sepharose, i oceniano pod kątem ich aktywności wiązania CD4, mierząc metodą kompetycyjnej ELISA ich aktywności hamujące wobec wiązania biotynylowanego mb-f5 z rozpuszczalnymi CD4 powleczonymi na płytkach do mikromiareczkowania. Czas inkubacji wynosił 2 godziny w temperaturze 37 C i przez noc w temperaturze 4 C.

33 [0085] W tabeli A poniżej przedstawiono względne aktywności wiązania hb-f5 (za 100% przyjęto aktywność wiązania mb-f5): Tabela A Przeciwciało Temp. ( C) Względna aktywność wiązania (% aktywności mb-f5) H37L/L4L H37L/L4M H37V/L4L H37V/L4M [0086] Z wyników przedstawionych w tabeli A widać, że reszta leucyna ma kluczowe znaczenie dla utrzymania aktywności wiązania CD4 przez hb-f5, gdyż aktywność wiązania CD4 ulega kilkukrotnemu zmniejszeniu przy zmianie 37 Leu na 37 Val. Stwierdzono natomiast, że reszta 4. VK nie jest tak istotna dla aktywności wiązania CD4. Jako że w modelowaniu molekularnym nie wykazano ewidentnej różnicy strukturalnej między 37 Leu a 37 Val VH, wyższość H37L nad H37V w odniesieniu do aktywności wiązania CD4 była nieoczekiwana. [0087] Do oceny wybrano H37L/L4L i H37L/L4M. Ocena aktywności biologicznych in vitro humanizowanego B-F5 [0088] Oceniano aktywności biologiczne in vitro mysiego B-F5 i humanizowanych B-F5 (IgG1 H37L/L4M i IgG1

34 H37L/L4L). Badano również humanizowane B-F5 typu IgG2 (IgG2 H37L/L4M i IgG2 H37L/L4L). [0089] Aktywności biologiczne in vitro mb-f5 i czterech typów hb-f5 oceniano z użyciem komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) od zdrowych dawców. PBMC aktywowano, stosując ConA (2,5 pg/ml, 3 dni) lub PPD (10 µg/ml, 4 dni) w obecności B-F5 myszowatych lub hb- F5, i monitorowano pod kątem ich odpowiedzi proliferacyjnych przez włączanie 3H-tymidyny. [0090] B-F5 myszowatych i hb-f5 umiarkowanie mogły hamować proliferację indukowaną przez ConA, lecz aktywności były różne w przypadku różnych przeciwciał i(lub) różnych dawców. Ponadto B-F5 myszowatych i hb-f5 były zdolne do hamowania Ag-swoistej proliferacji PBMC indukowanej przez PPD. [0091] Typ IgG1 hb-f5 skuteczniej hamował proliferację indukowaną przez PPD (hamowanie aż 70%) niż mb-f5. Typ IgG1 był, jak się wydaje, skuteczniejszy niż typ IgG2, którego aktywność hamująca była niemal taka sama jak mb-f5. W przypadku typu IgG1 H37L/L4M był skuteczniejszy niż H37L/L4L. Typy IgG2 H37L/L4M i H37L/L4L wykazywały niemal takie same aktywności hamujące. Pokrótce, aktywności hamujące B-F5 w stosunku do proliferacji PBMC indukowanej przez PPD były następujące: IgG1 H37L/L4M > IgG1 H37L/L4L > IgG2 H37L/L4M = IgG2 H37L/L4L = mb-f5. [0092] Po uwzględnieniu skuteczności aktywności biologicznej in vitro i mniejszej liczby aminokwasów mysich do dalszej oceny wybrano IgG1 H37L/L4M; to właśnie przeciwciało nazwano BT061 i zastosowano do

35 udowodnienia niniejszego wynalazku w przykładach przedstawionych w niniejszym zgłoszeniu. Kompozycje i zastosowania [0093] Jak wspomniano, kompozycja farmaceutyczna i leki stosowane w niniejszym opisie umożliwiają korzystnie leczenie choroby autoimmunologicznej u pacjentów, u których korzystne są wyższe dawki. Do takich pacjentów należą między innymi ciężkie przypadki z długą historią choroby. [0094] W jednym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza również zastosowania humanizowanego przeciwciała anty- CD4 lub jego fragmentu lub pochodnej do wytwarzania leku skutecznego przeciwko chorobie autoimmunologicznej, przy czym humanizowane przeciwciało jest zdolne do aktywowania regulatorowych komórek T CD4 + CD25 +, i przy czym lek zawiera przeciwciało w stężeniu wynoszącym od 10 do 150 mg/ml, korzystnie 15 do 75 mg/ml, najkorzystniej 20 do 60 mg/ml. [0095] Ponadto opis dostarcza także zastosowania humanizowanego przeciwciała anty-cd4 lub jego fragmentu lub pochodnej do wytwarzania leku skutecznego przeciwko chorobie autoimmunologicznej, przy czym humanizowane przeciwciało jest zdolne do aktywowania regulatorowych komórek T CD4 + CD25 +, i przy czym lek podaje się osobnikowi w pojedynczej dawce albo w wielu dawkach w ilości przeciwciała od 10 do 200 mg na dawkę. [0096] Niniejszy opis dostarcza również kompozycję farmaceutyczną do leczenia choroby autoimmunologicznej zawierającą farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i środek zdolny do aktywowania regulatorowych komórek T

36 CD4 + CD25 +, przy czym kompozycja ma być podawana osobnikowi w dawce środka od 10 mg do 100 mg, 10 mg do 80 mg, 15 mg do 80 mg, 20 mg do 75 mg, korzystnie od ponad 20 mg do 60 mg i najkorzystniej od 25 mg do 60 mg. [0097] W jednym aspekcie opisu osobnik ma otrzymać wiele dawek. W tych sytuacjach odpowiednie jest, żeby dawkowanie przez okres 10 dni było większa od 25 mg lecz mniejsza lub równa 200 mg, korzystniej wynosiła od 28 mg do 100 mg i najkorzystniej od 30 mg do 100 mg. Dalej, dawkowanie przez okres 5 dni jest korzystnie większa od 15 mg, lecz mniejsza lub równa 100 mg, korzystniej wynosi od 18 mg do 100 mg, najkorzystniej od 20 mg do 100 mg. W tym aspekcie wynalazku szczególnie korzystne jest podawanie dawkowania podskórnie. [0098] Dawkę można również obliczać na podstawie pola powierzchni ciała (ang. body surface area - BSA) osobnika. Pole powierzchni ciała (BSA) można obliczać dowolną znaną metodą. Przykłady metod obliczania BSA są następujące: Wzór Mostellera: (BSA (m 2 ) = ([wzrost(cm) x masa (kg)]/3600) 1/2 (Mosteller RD: Simplified Calculation of Body Surface Area. N Engl J Med 1987 Oct 22;317(17):1098) Wzór DuBois i DuBois: BSA (m 2 ) = 0,20247 x wzrost(m) 0,725 x masa (kg) 0,425 (DuBois D; DuBois EF: A formula to estimate the approximate surface area if height and weight be known. Arch IntMed :

37 36 Wzór Haycocka: BSA (m 2 ) = 0, x wzrost(cm) 0, x masa (kg) 0,5378 (Haycock G.B., Schwartz G.J., Wisotsky D.H. Geometric method for measuring body surface area: A height weight formula validated in infants, children and adults. The Journal of Pediatrics :1:62-66) Wzór Gehana i George a: BSA (m 2 ) = 0,0235 x wzrost(cm) 0,42246 x masa (kg) 0,51456 (Gehan EA, George SL, Estimation of human body surface area from height and weight. Cancer Chemother Rep :225-35) Wzór Boyda: BSA (m 2 ) = 0, x wzrost(cm) 0,3 x masa (g)(0, (0,0188 x LOG(gramy)) [0099] Według opisu dawka środka, która ma być podawana osobnikowi, wynosi od 5 do 60 mg/m 2 pola powierzchni ciała pacjenta, korzystnie od 6 do 50 mg/m 2, a najkorzystniej 8 do 40 mg/m 2. [0100] Dawkę można także obliczać na podstawie masy ciała osobnika. Według opisu dawka środka stosowana u osobnika wynosi od 0,1 do 2 mg/kg, korzystnie 0,15 do 1,5 mg/kg, a najkorzystniej 0,2 do 1 mg/kg. [0101] W tych aspektach opisu, w których dawka jest oparta na polu powierzchni ciała lub masie ciała osobnika, korzystne jest, aby dawki stosowane w okresie 10 dni wynosiły od 10 mg/m 2 do 120 mg/m 2, korzystniej od 16 mg/m 2 do 120 mg/m 2, lub od 0,2 mg/kg do 4 mg/kg, korzystniej od 0,4 mg/kg do 4 mg/kg. Szczególnie korzystne jest podawanie dawkowania podskórnie. [0102] Według niniejszego wynalazku podaje się wiele dawek, co tydzień.

38 [0103] Czas trwania leczenia nie jest szczególnie ograniczony; typowo w leczeniu chorób autoimmunologicznych leczenie prowadzi się stale lub do momentu zmniejszania objawów do poziomu akceptowalnego dla pacjenta. Ogólnie, osobnikowi podaje się dawkę przez co najmniej 1 miesiąc. [0104] Opis dostarcza również zestawu do zastosowania zdefiniowanego powyżej, przy czym zestaw zawiera wiele dawkowań leku zdefiniowanego powyżej do jednoczesnego, kolejnego lub oddzielnego podawania osobnikowi. [0105] Dostarcza również sposobu leczenia choroby autoimmunologicznej, który to sposób obejmuje podawanie osobnikowi zdefiniowanej powyżej kompozycji farmaceutycznej. [0106] Dostarczony jest również sposób leczenia choroby autoimmunologicznej, który to sposób obejmuje podawanie osobnikowi leku, przy czym lek zawiera środek zdolny do aktywowania regulatorowych komórek T CD4 + CD25 +, i przy czym lek podaje się podmiotowi w ilości opisanej powyżej. [0107] Korzystnie, środek jest humanizowanym przeciwciałem anty-cd4 lub jego fragmentem lub pochodną pochodzącymi z mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-cd4 B-F5. [0108] Jak wspomniano, kompozycja farmaceutyczna i leki stosowane w niniejszym opisie korzystnie umożliwiają leczenie choroby autoimmunologicznej u pacjentów, u których korzystne są wyższe dawki. Do takich pacjentów należą między innymi ciężkie przypadki z długą historią choroby.

39 [0109] Korzystnie choroba autoimmunologiczna jest wybrana spośród chorób: łuszczyca, reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane, cukrzyca typu 1, nieswoiste zapalenia jelit, choroba Crohna, zapalenie tarczycy Hashimoto, autoimmunologiczne zapalenie tarczycy, autoimmunologiczna miastenia, toczeń rumieniowaty układowy, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, atopowe zapalenie skóry, zapalenie mięśnia serca i choroby związane z przeszczepieniami, takie jak reakcja przeszczep przeciwko gospodarzowi lub gospodarz przeciwko przeszczepowi, albo ogólne problemy z tolerancją narządową. [0110] W szczególnie korzystnym aspekcie wynalazku kompozycje farmaceutyczne są przeznaczone do leczenia choroby autoimmunologicznej - łuszczycy. W szczególności takie kompozycje farmaceutyczne mają być podawane podskórnie w dawkowaniach tu wyszczególnionych. [0111] Łuszczyca jest to zaburzenie powodujące zmiany lub placki łuszczycowe na skórze osoby chorej. Do oceny i dokumentowania poziomu łuszczycy u osób chorych stosuje się powszechnie skalę powierzchni i ciężkości łuszczycy (ang. Psoriasis Area and Severity Index - PASI). Ocena w skali PASI obejmuje ocenę rumienia (ang. erythema - E), nacieku (ang. infiltration - I) i złuszczania (ang. desquamation - D), oraz zajęcia pola powierzchni ciała (ang. area - A) w 4 okolicach ciała (głowa ang. head - h), tułów ang. trunk - t), kończyny górne ang. upper - - u) i kończyny dolne ang. lower - l). W poniższej tabeli B pokazano, jak działa system oceny.

40 39 TABELA B system oceny PASI Stopień ciężkości (na Nadana Zajęte pole Nadana okolicę ciała) wartość powierzchni (na wartość okolicę ciała) Bez objawów 0 <10% 1 Niewielkie % 2 Umiarkowane % 3 Wyraźne % 4 Bardzo wyraźne % % 6 [0112] Jako że głowa, kończyny górne, tułów i kończyny dolne stanowią, odpowiednio, około 10, 20, 30 i 40% pola powierzchni ciała, wynik w skali PASI oblicza się ze wzoru: PASI = 0,1(E h + I h + D h)a h + 0,2(E u + I u + D u)a u + 0,3(E t + I t + D t)a t + 0,4(E l +I l + D l)a l [0113] Wynik w skali PASI waha się od 0 do 72. Wynik równy 0 oznacza brak łuszczycy, natomiast wynik 72 odpowiada najcięższej łuszczycy. [0114] W korzystnym przykładzie wykonania tego aspektu kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku umożliwia leczenie łuszczycy, zapewniając co najmniej 40%, korzystnie co najmniej 50% poprawę wyniku w skali PASI pacjenta. Korzystnie wynik osobnika w skali PASI wynosi przed leczeniem co najmniej 10. Te efekty można obserwować co najmniej 56 dni po podaniu, korzystniej co najmniej 75 dni po podaniu. W szczególności, te efekty można obserwować u co najmniej 80% leczonych pacjentów.

41 [0115] W kolejnym aspekcie niniejszego wynalazku kompozycje farmaceutyczne są przeznaczone do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów. [0116] Reumatoidalne zapalenie stawów jest chorobą autoimmunologiczną, która powoduje przewlekłe zapalenie stawów i tkanek otaczających i może również wpływać na inne tkanki i narządy ciała. [0117] Poprawę obserwowaną u leczonego pacjenta z reumatoidalnym zapaleniem stawów często ocenia się, stosując zestaw zasadniczych parametrów Amerykańskiego Kolegium Reumatologicznego (ang. American College of Rheumatology - ACR) (Felson i wsp., Arthritis & Rheumatism, 1995, 38(6), ). Ten system definiuje wartość ACR równą 20 jako 20% poprawę w zakresie liczby bolesnych i obrzękniętych stawów i 20% poprawę w zakresie 3 z 5 pozostałych zasadniczych mierników ACR: globalna ocena dokonywana przez pacjenta i lekarza, ból, niesprawność i parametr fazy ostrej, taki jak białko C-reaktywne (CRP). [0118] W szczególności, kompozycje farmaceutyczne do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów mają być podawane podskórnie w dawkowaniach tu wyszczególnionych. [0119] Leczenie zapalenia stawów obejmuje obecnie leki pierwszej linii do opanowania bólu i zapalenia, klasyfikowane jako niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), takie jak na przykład aspiryna, ibuprofen, naproksen itd. Druga linia leczenia zapalenia stawów obejmuje podawanie kortykosteroidów (na przykład prednizonu i deksametazonu), wolno działających leków przeciwreumatycznych (SAARD) lub leków

42 przeciwreumatycznych modyfikujących przebieg choroby (DMARD), na przykład metotreksatu, penicylinaminy, cyklofosfamidu, soli złota, azatiopryny, leflunomidu itd. [0120] Kortykosteroidy, syntetyczne wersje hormonu ciała kortyzonu, stosuje się do hamowania progresji RA (na przykład prednizon i deksametazon). [0121] Opracowano również inną grupę leków do leczenia RA, określaną jako leki modyfikujące odpowiedź biologiczną (BRM), w tym antagonistów TNF-alfa (adalimumab, infliksymab, etanercept), których działanie polega na wiązaniu z receptorem białka TNFalfa lub bezpośrednim wiązaniu z TNF-alfa. [0122] W jednym przykładzie wykonania tego aspektu wynalazku kompozycje mają być podawane w skojarzeniu z lekami obecnie używanymi do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów. W szczególności, kompozycje mają być podawane z jednym z leków wymienionych powyżej, korzystnie z metotreksatem. [0123] Znane leki, takie jak metotreksat, i kompozycję farmaceutyczną według niniejszego wynalazku można podawać jednocześnie, kolejno lub oddzielnie. [0124] Wynalazek zostanie teraz dokładniej opisany w odniesieniu do poniższych konkretnych przykładów wykonania.

43 42 PRZYKŁADY PRZYKŁAD 1 Badanie zdolności immunomodulujących BT061 w odniesieniu do proliferacji komórek T Metoda [0125] Przeprowadzono hodowle krwi pełnej ze świeżo pobranej krwi obwodowej. Pokrótce, pobrano krew igłami 19G od trojga zdrowych ochotników do heparynizowanych strzykawek. Krew posiewano na 96-studzienkowe płytki do hodowli nie później niż 60 min po oddaniu krwi. [0126] Do hodowli dodawano przeciwciała stosowane w tym wynalazku (BT061, seria lub seria 70A0013B) i następnie przeprowadzano stymulację leukocytów przy 5 różnych wartościach stężenia (zob. Substancje badane poniżej). Komórki pozostawiano do interakcji z przeciwciałem przez 90 min w temperaturze 37 C, 5% CO2 w nawilżonej atmosferze, po czym do oddzielnych hodowli dodawano cztery różne substancje stymulujące: (a) przeciwciała anty-cd3 (R&D Systems; 50 ng/ml) (b) fitohemaglutyninę (PHA, Biochrom KG; 3 pa/ml) wraz z przeciwciałami anty-cd28 (Becton-Dickinson; 1 µg/ml); (c) lipopolisacharyd (LPS, podtyp 055:B15, firma Sigma Aldrich; 1 µg/ml); (d) SE-B (Bernhard-Nocht-Institut; 25 ng/ml) wraz z przeciwciałami anty-cd28 (Becton-Dickinson; 1 µg/ml). [0127] Wszystkie hodowle krwi pełnej inkubowano przez 24 godz. w temperaturze 37 C w 5% CO2 (nawilżona atmosfera). Następnie zebrano supernatanty hodowli celem oznaczenia cytokin stanowiących punkty końcowe, z

44 wyjątkiem hodowli stymulowanych PHA/anty-D28, które inkubowano przez 48 godz. w celu uzyskania dostatecznej stymulacji komórek Th2. [0128] Wyniki przedstawiono na Fig. 1. Wyniki [0129] BT061 nie wykazywało istotnego efektu na główne aktywności monocytów/makrofagów ani na aktywności Th1 jak i Th2 w hodowlach krwi pełnej od zdrowych ochotników. Występował efekt zależności od stężenia w odniesieniu do komórek Treg (czego dowodzi zwiększenie wydzielania TGF-beta). [0130] W szczególności, wyniki potwierdzają: Brak modulacji cytokiny zapalnej IL-2 w stężeniu do 50 µg/ml, co odpowiada podaniu u pacjentów wysokiej dawki - do 150 mg Brak indukowania cytokiny zapalnej IFN-gamma w stężeniach do 50 µg/ml, co odpowiada podaniu u pacjentów wysokiej dawki - do 150 mg Brak modulacji cytokin Th1/Th2 w stężeniach do 50 µg/ml, co odpowiada podaniu u pacjentów wysokiej dawki Jedynie bardzo sporadyczną regulację w górę IL-6 o marginalny przyrost, czego implikacje budzą kontrowersje Zwiększenie uwalniania TGF-beta (komórki Treg) Brak istotnego efektu na główne kierunki aktywności regulatorowej monocytów/makrofagów oraz na aktywności Th1 i Th2.

45 PRZYKŁAD 2 Badanie BT061 pod kątem wpływu na hodowane ludzkie PBMC stymulowane do odpowiedzi przeciwko toksoidowi tężca i w teście cytokinowym Metoda Test proliferacji [0131] Świeżo izolowane PBMC hodowano w 96- studzienkowych płaskodennych płytkach do mikromiareczkowania w objętości 200 μl/studzienkę (4 x 10 5 komórek/studzienkę). Substancję badaną (anty-cd4 AK BT061) zastosowano w stężeniach wynoszących 20 µg/ml, 4 µg/ml i 0,8 µg/ml (dodatkowo 40 µg/ml w teście wstępnym); toksoid tężca zastosowano w stężeniach wynoszących 25 µg/ml, 5 µg/ml i 1 µg/ml. Jako kontrolę ujemną użyto pożywkę do hodowli komórek. Wszystkie hodowle prowadzono w trzech powtórzeniach. [0132] Do stymulacji ConA użyto stężenia 2,5 µg/ml i objętości 200 µl/studzienkę. Gęstość PBMC doprowadzono do wartości 1 x 10 6 /ml i stosowano je w objętości 100 µl na studzienkę. [0133] Na zakończenie okresu hodowli wykrywano proliferację komórek, dodając 0,4 µci 3 H-tymidyny na studzienkę na 16 godzin. Na zakończenie okresu hodowli komórki odrywano od powierzchni, stosując roztwór EDTA, i zbierano na filtry z włókna szklanego za pomocą urządzenia do zbierania komórek Scatron. Za pomocą licznika scyntylacyjnego mierzono ilość radioaktywności włączanej do DNA w każdej studzience; była ona proporcjonalna do liczby proliferujących komórek, która z kolei jest funkcją liczby leukocytów, które stymulowano do wejścia w fazę S cyklu komórkowego. Parametrem odczytu była liczba (zliczenia) na minutę

46 45 5 (ang. counts per minute - cpm) i wskaźnik stymulacji (SI) dla każdej wartości stężenia jak definiowano jako cpmzwiązku/ cpmpróby ślepej. Testy cytokin [0134] Wszystkie cytokiny oznaczano ilościowo w supernatantach hodowli, stosując komercyjne zestawy ELISA według instrukcji danego producenta. Zastosowane odczynniki wymieniono w tabeli 1 poniżej: [0135] Oznaczano poziomy interleukiny (IL-1) w supernatantach hodowli, stosując zestaw A ELISA do ludzkiej IL-1 (Bender) według instrukcji producenta. Zakres testu, określony wcześniej z użyciem wzorca dostarczanego wraz z zestawem, wynosił 1,3 do 130 pg/ml w przypadku nierozcieńczonych próbek. [0136] Poziomy w supernatantach hodowli IL-4, 5, 6 i 10, jak również transformującego czynnika wzrostu (TGF) β1 i czynnika martwicy nowotworów (TNF) α oznaczono, stosując zestaw testowy OptEIA (BD Biosciences) według instrukcji producenta. Zakres testu, określony wcześniej z użyciem wzorców dostarczanych wraz z

47 zestawami, wynosił 3,8 do 330 pg/ml w przypadku IFN-γ, 6,3 do 616 pg/ml (w przypadku IL-4, 5, 10 i TNF), przy oznaczeniach w nierozcieńczonych próbkach, i 7,6 do 660 pg/ml w przypadku IL-6 przy oznaczeniach w próbkach w dwukrotnym rozcieńczeniu. [0137] Do obliczeń średniej i odchylenia standardowego uwzględniono dwa (w przypadku hodowli monocytów) lub osiem (w przypadku hodowli PBMC) oznaczeń cytokin metodą ELISA, z których każde pochodziło z niezależnych mikrohodowli. Miana powyżej górnej granicy zakresu testu (na przykład 616 pg/ml w przypadku TNF) ustawiono na tę wartość do celów obliczeń. Przed obliczeniem od każdej wartości średniej odejmowano dolną granicę zakresu testu. Wyniki [0138] BT061 (określane również terminem humanizowane B-F5 lub po prostu hb-f5 ) jest w stanie powodować supresję w sposób zależny od dawki swoistą proliferację komórek T wywoływaną przez toksoid tężca; nie stwierdzono efektu na całkowitą liczbę komórek T. Udowodniono ogólną supresję uwalniania cytokin. [0139] W tabeli 2 poniżej ukazano wpływ mab anty-cd4 BT061 na wynik testu swoistej proliferacji komórek T wywoływanej przez toksoid tężca, mierzonej w trzech powtórzeniach. [0140] Przedstawiono wartości średnie i SD włączania 3H-Tdr, mierzone w trzech powtórzeniach, jak również wskaźnik stymulacji (SI definiowany jako cpmzwiązku / cpmnic) przy każdej wartości stężenia i poziom istotności w nieparzystym, dwustronnym teście t w

48 47 stosunku do kontroli (pożywki); (n.s.: brak istotności; *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001).

49 48

50 49 [0141] Dane w tabelach 2-4 dowodzą: Wykazano zależną od dawki supresję indukowanej przez toksoid tężca proliferacji komórek T (odpowiedź typu przypominania) nawet przy wysokich dawkach BT061, co dowodzi, że BT061 nie eliminuje wszystkich odpowiedzi immunologicznych. Użyte dawki odpowiadają zastosowaniu u pacjentów wysokiej dawki do 60 mg. Ogólna supresja uwalniania cytokin (zależne od dawki zmniejszenie ilości IFN-gamma, IL-5 i TNF-alfa, bez zmian w zakresie IL-1, IL-4, IL-6, IL-10), bez wpływu na równowagę Th1/Th2. Zwiększenie uwalniania TGF-beta. PRZYKŁAD 3 Test cytometrii przepływowej na indukowaną przez BT061 (mab anty-cd4) ADCC (cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał) [0142] Komórki docelowe HuT 78 wyznakowano BT061 (hb- F5) i inkubowano z komórkami PBMC jako efektorami.

51 50 Wykrywanie martwych komórek było możliwe poprzez wychwyt barwnika DNA jodku propidyny po inkubacji przez 30 minut. Wyniki przedstawiono w tabeli 5. [0143] Dane w tabeli dowodzą braku indukowania ADCC przez BT061 (hb-f5), nawet w dużych stężeniach.

52 51 PRZYKŁAD 4 - Apoptoza [0144] W teście cytometrii przepływowej apoptozy indukowanej przez BT061 (mab anty-cd4) PBMC z krwi pełnej inkubowano z BT061 lub z kontrolą dodatnią. [0145] Po inkubacji przez 7 dni przeprowadzano wykrywanie komórek apoptotycznych przez barwienie ich anneksyną-v-fluoresceiną. Wyniki przedstawiono w tabeli 6. [0146] Dane dowodzą, że nawet przy dużych stężeniach BT061 nie dochodziło do indukowania apoptozy. PRZYKŁAD 5 Wiązanie dopełniacza [0147] W teście cytometrii przepływowej wiązania czynnika dopełniacza C1q izolowano PBMC i inkubowano je

53 52 z BT061 (mab anty-cd4), po inkubacji z oczyszczonym rekombinowanym C1q. [0148] Jako kontrolę dodatnią użyto ATG (Tecelac). [0149] Przeprowadzano wykrywanie z użyciem wyznakowanych FITC przeciwciał detekcyjnych przeciwko C1q. Wyniki przedstawiono w tabeli 7 poniżej. [0150] Dane wykazują, że nie obserwuje się wiązania dopełniacza nawet przy dużych stężeniach. PRZYKŁAD 6 - Bezpieczeństwo i tolerancja rosnących dawek BT061 [0151] Przeprowadzono badanie, w którym monitorowano bezpieczeństwo i tolerancję BT061, stosując rosnące dawki przeciwciała u zdrowych ochotników (mężczyzn i kobiet) w wieku 18 do 75 lat.

54 53 [0152] Trzydzieścioro ochotników otrzymało BT061 w podaniu dożylnym w 10 grupach dawkowania, po 3 ochotników na grupę. Następnie 15 ochotników otrzymało BT061 w podaniu podskórnym, w 5 grupach dawkowania, również po 3 ochotników na grupę. Podawanie BT061 dożylnie zilustrowano w tabeli 8 poniżej: [0153] Każdą dawkę rozcieńcza się wstrzyknięciem 0,9% chlorku sodu do całkowitej objętości 20 ml. Dawkę podaje się jako pojedynczy, ciągły wlew dożylny przez 2 godziny. [0154] Podskórne podawanie BT061 zilustrowano w tabeli 9 poniżej:

55 54 [0155] Każdą dawkę wstrzyknięto w pojedynczym bolusie. [0156] Ochotników oceniano przez 3 miesiące po wstrzyknięciu. [0157] W przypadku podania podskórnego pobierano próbki osocza przed podaniem oraz po 3, 6, 12, 24, 36, 48, 56, 72, 88, 96, 120, 144 i 168 godzinach po podaniu i w dniu 75. [0158] W przypadku podania dożylnego pobierano próbki osocza przed podaniem oraz po 30 minutach, 1, 2, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144 i 168 godzinach po podaniu. [0159] Próbki osocza analizowano, stosując standardową metodologię ELISA, aby ocenić poziomy cytokin. Do analizowanych odpowiednich cytokin należały: IFN-γ, TNF-α, IL-6 i IL-2. [0160] Próbki osocza analizowano także standardowymi metodami cytometrii przepływowej, aby określić liczbę limfocytów CD4 +. Wyniki [0161] Stwierdzono, że dożylne i podskórne dawki do 60 mg były generalnie dobrze tolerowane. Poziomy cytokin

56 55 [0162] Częstym powikłaniem natychmiastowym, występującym przy stosowaniu przeciwciał terapeutycznych wchodzących w interakcje z komórkami T, jest indukowanie uwalniania cytokin, takich jak ATG, OKT3, CAMPATH-1H i humanizowane mab anty-cd3 (TRX4, Visilizumab i Teplizumab). Do objawów należą przede wszystkim umiarkowana gorączka, bóle głowy i samoograniczające się objawy ze strony przewodu pokarmowego. Efekty uboczne korelujące z indukowaniem cytokin po podaniu przeciwciał wymagają zastosowania dodatkowych leków, takich jak środek antyhistaminowy - chlorowodorek difenhydraminy i(lub) środek przeciwzapalny - ibuprofen. [0163] Przy stosowaniu OKT3 (muromonab-cd3), swoistego wobec CD3 terapeutycznego przeciwciała monoklonalnego myszowatych, dochodziło nawet do zgonów; ciężkie efekty uboczne ograniczają zastosowanie kliniczne tego przeciwciała głównie do pacjentów z immunosupresją. [0164] Jakkolwiek humanizowane, niewiążące się z FcR, swoiste wobec CD3 przeciwciała monoklonalne, które obecnie stosuje się w klinice w leczeniu choroby autoimmunologicznej (Teplizumab i TRX4), wykazują zmniejszone efekty uboczne indukowane przez aktywację komórek T i(lub) aktywację komórek wykazujących ekspresję receptora Fc po pierwszej dawce, w porównaniu z wiążącymi FcR przeciwciałami swoistymi wobec CD3, takimi jak OKT3, obserwuje się jednak pewien stopień aktywacji komórek T i aktywację komórek wykazujących ekspresję receptora Fc, co prowadzi do uwalniania cytokin, zwykle połączonego z efektami ubocznymi zależnymi od cytokin.

57 56 [0165] W niniejszym badaniu nieoczekiwanie stwierdzono, że indukcja cytokin, obserwowana u zdrowych ochotników po dożylnym lub podskórnym podaniu BT061, była niewielka i przemijająca w porównaniu z przeciwciałami anty-cd3. Indukcja cytokin na ogół zwiększała się przy zwiększaniu dawkowania. Nawet jednak przy najwyższych dawkach, wynoszących 40 do 60 mg, indukcja cytokin jest znacznie mniejsza niż przy stosowaniu innych przeciwciał monoklonalnych wchodzących w interakcje z komórkami T (Fig. 7A i B). [0166] Medianę szczytowych stężeń cytokin obserwowanych w dowolnym punkcie czasowym w ciągu 96 godzin po podaniu, przy stosowaniu najwyższych dawek, (40 mg do 60 mg BT061), przedstawiono na Fig. 7 i 8. [0167] Medianę szczytowego stężenia poszczególnych cytokin oblicza się następująco: mediana najwyższych stężeń cytokiny obserwowanych po podaniu przeciwciała. [0168] Fig. 7A i B przedstawiają uwalnianie TNFα i IL-6 obserwowane u zdrowych ochotników po dożylnym lub podskórnym podaniu BT061 w porównaniu z uwalnianiem po podaniu przeciwciał monoklonalnych anty-cd3, Teplizumabu i TRX4. Wartości prawidłowe tych cytokin zaczerpnięto ze Straub i wsp., (2007, Arthr. & Rheumat.). Fig. 8 przedstawia poziomy IL-2 i IFN-γ w osoczu po dożylnym lub podskórnym podaniu BT061. Mediany szczytowych poziomów obliczano w grupach dawkowych 40 i 60 mg na podstawie pomiarów w ciągu 4 dni po wstrzyknięciu przeciwciała. Górną granicę normy (ULN) obliczano na podstawie poziomów cytokin oznaczonych u 39 zdrowych osobników, przy czym ULN = wartość średnia + 2 x odchylenie standardowe.

58 57 [0169] W porównaniu z Teplizumabem i TRX4 (wyniki, odpowiednio, z Herold i wsp., 2002, New Engl. J. Med, i Keymeulen i wsp., 2005 New Engl. J. Med) BT061 indukowało jedynie marginalne i przejściowe uwalnianie cytokin. Poziomy TNF-α i IL-6 były nieznacznie podwyższone. Fig. 7 ukazuje, że mediana szczytowych wartości poziomów cytokin IL-6 i TNFα, wykrywanych w osoczu po podaniu BT061 (40 i 60 mg), były niższe niż mediana obserwowana po leczeniu swoistymi wobec CD3 przeciwciałami terapeutycznymi, Teplizumabem i TRX4. [0170] Ponadto, w przeciwieństwie do mab anty-cd3, BT061 nie powodowało istotnego podwyższenia poziomów IFN-γ i IL-2 (Fig. 8), o czym donoszono w przypadku podawania TRX4 (Keymeulen i wsp. 2005). Limfocyty CD4 + [0171] Badanie obejmowało również ocenę liczby limfocytów CD4-dodatnich w pobranych próbkach osocza. [0172] Wyniki podawania dożylnego przedstawiono poniżej w tabelach 9, 10 i 11. W tabeli 12 podano wyniki badania z podawaniem podskórnym. Wyniki przedstawiono graficznie na Fig. 9 i 10.

59 58

60 59 [0173] W szczególności, na Fig. 9 przedstawiono liczbę zliczonych komórek CD4 (komórek na ml osocza) u ochotników leczonych pojedynczą dawką dożylną BT061. Punkty danych odpowiadają wartościom średnim u 3 pacjentów w każdej grupie dawkowej. Linie kropkowane wskazują górną granicę normy (ULN) i dolną granicę normy (LLN). Obliczono ULN i LLN (wartość średnia + (lub -) odchylenie standardowe), na podstawie liczby komórek u zdrowych ochotników: 443 komórki CD4 na µl (dolna granica normy; LLN) i 1324 komórki CD4 na µl (górna granica normy; ULN). [0174] Na Fig. 10 przedstawiono liczbę zliczonych komórek CD4 (komórek na ml osocza) u ochotników leczonych pojedynczą dawką podskórną BT061. Podobnie jak na Fig. 9, punkty danych odpowiadają wartościom średnim u 3 pacjentów w każdej grupie dawkowej. Linie

61 60 kropkowane wskazują górną granicę normy (ULN) i dolną granicę normy (LLN).

62 61

63 62 [0175] W przypadku wielu przeciwciał monoklonalnych swoistych wobec CD4, znanych w stanie techniki (takich jak przeciwciała omówione w Strand i wsp., 2007), immunosupresję osiąga się przez eliminowanie limfocytów CD4-dodatnich. Wadą tych przeciwciał jest to, że u osób nimi leczonych pojawia się upośledzenie odporności i przez to podatność na inne zakażenia. [0176] Niniejsze badanie wykazało natomiast, że BT061 nie indukuje masywnego, długotrwałego eliminowania komórek CD4-dodatnich. Obserwowano jednak przejściowe zmniejszenie liczby limfocytów CD4-dodatnich z powrotem do wartości prawidłowych we krwi obwodowej w ciągu 72 godz. po podaniu przeciwciała. [0177] W punkcie czasowym 72 godz. po podaniu BT061 liczba komórek CD4 u czworga ochotników z grupy otrzymującej dawki dożylne wykazała poziomy CD4, które były poniżej tych wartości prawidłowych i były następujące: 1 ochotnik z grupy otrzymującej dawkę 100 μg dożylnie: 400 komórek CD4 na μl; 1 ochotnik z grupy 5 mg: 419 komórek CD4 na μl; 1 ochotnik z grupy 10 mg: 440 komórek CD4 na μl; i 1 ochotnik z grupy 20 mg: 392 komórek CD4 na μl. [0178] Były to jednak wartości tylko nieznacznie poniżej wartości prawidłowych. Liczba komórek CD4 u pozostałych 26 ochotników z grup otrzymujących BT061 dożylnie w 72 godzin po podaniu BT061 mieściła się w granicach normy. [0179] W grupach otrzymujących dawkę podskórnie po 72 godzinach jedynie u jednego z 15 ochotników wykazano liczbę komórek CD4 poniżej prawidłowych wartości.

64 63 [0180] Podsumowując, w przeciwieństwie do swoistych wobec CD4 mab powodujących eliminację - BT061, nawet w wysokich dawkach, indukuje jedynie przejściowe zmniejszenie liczby komórek CD4-dodatnich, po którym następuje generalny powrót do normy. Z przejściowego zmniejszenia liczby i szybkiego generalnego powrotu do wartości prawidłowych można wysnuć wniosek, że dochodzi do przejściowej redystrybucji komórek CD4-dodatnich, nie zaś do eliminowania tych komórek. PRZYKŁAD 7 Badanie kliniczne BT061 u pacjentów z przewlekłą łuszczycą od umiarkowanej do ciężkiej [0181] Zdolność hb-f5 BT061 do leczenia choroby autoimmunologicznej bada się u 56 pacjentów cierpiących na przewlekłą łuszczycę od umiarkowanej do ciężkiej. Badanie obejmuje test z podawaniem jednorazowej dawki i z eskalacją dawki, służący ocenie bezpieczeństwa i skuteczności hb-f5. [0182] Warunki badania są następujące: 56 pacjentów dzieli się na 7 grup dawkowych, z których każda grupa obejmuje osiem osób. Pięć grup dawkowych (grupy dawkowe I do V) ma otrzymywać przeciwciało lub placebo w podaniu dożylnym, a dwie grupy dawkowe (grupy dawkowe VI i VII) mają otrzymywać przeciwciało lub placebo przez podanie podskórne. Dwoje pacjentów w każdej grupie dawkowej otrzymuje placebo, a pozostałych sześcioro pacjentów w każdej grupie dawkowej otrzymuje dawkę BT061. W grupie dawkowej I sześcioro pacjentów otrzymuje 0,5 mg BT061 dożylnie. W grupach dawkowych II do V sześcioro pacjentów otrzymuje, odpowiednio, 2,5 mg,

65 64 5 mg, 10 mg lub 20 mg BT061. W grupach dawkowych VI i VII, w których podawanie jest podskórne, sześcioro pacjentów otrzymuje, odpowiednio, 12,5 mg lub 25 mg BT061. [0183] Przy podawaniu dożylnym przeciwciało/placebo ma być podawane we wlewie do żyły przedramienia zgodnie z procedurami akceptowanymi medycznie. W tym przypadku całkowitą objętość podaje się w postaci pojedynczego, ciągłego wlewu dożylnego przez 2 godziny przez perfuzor (Fresenius Pilot C, Fresenius AG, Niemcy). Każdą dawkę przeciwciała rozcieńcza się w 0,9% chlorku sodu do wstrzyknięć (B. Braun Melsungen AG, Niemcy) do całkowitej objętości 20 ml. [0184] Przy podawaniu podskórnym przeciwciało ma być podawane w postaci pojedynczego wstrzyknięcia podskórnego. Taką samą procedurę stosuje się w odniesieniu do placebo. [0185] Poziom łuszczycy u każdego pacjenta dokumentuje się, stosując skalę PASI. Jak opisano powyżej, wyższy wynik w skali PASI odpowiada wyższemu poziomowi łuszczycy. U pacjentów włączanych do badania obecna jest przewlekła łuszczyca od umiarkowanej do ciężkiej, to znaczy ich wynik w skali PASI wynosi 10 lub więcej. [0186] Wynik pacjenta w skali PASI ocenia się przed badaniem, aby uzyskać wartość wyjściową w dniu 0, i następnie ocenę powtarza się w trakcie badania w dniach 5, 7, 14, 21, 28, 42, 56 i 75. Grupa dawkowa I [0187] Sześcioro pacjentów z grupy dawkowej I otrzymało pojedyncze podanie dożylne 0,5 mg BT061, natomiast dwoje pacjentów z grupy dawkowej I otrzymało placebo.

66 65 Dawkę w stosunku do masy i dawkę na pole powierzchni ciała (BSA) u każdego pacjenta przedstawiono w tabeli 13. Pole powierzchni ciała obliczano według opisywanego tu wzoru Mostellera. [0188] Wyniki w skali PASI u pacjentów w grupie dawkowej I przedstawiono w tabeli 13 wraz z procentową poprawą w skali PASI w porównaniu z wartościami wyjściowymi. Grupa dawkowa II [0189] Sześcioro pacjentów z grupy dawkowej II otrzymało pojedyncze wstrzyknięcie dożylne 2,5 mg BT061, natomiast dwoje pacjentów z grupy dawkowej II otrzymało placebo. Dawkę w stosunku do masy i dawkę na pole powierzchni ciała (BSA) u każdego pacjenta przedstawiono w tabeli 14. [0190] Wyniki w skali PASI u pacjentów w grupie dawkowej II przedstawiono w tabeli 14 wraz z procentową poprawą w skali PASI w porównaniu z wartościami wyjściowymi. Grupa dawkowa III [0191] Sześcioro pacjentów z grupy dawkowej III otrzymało pojedyncze wstrzyknięcie dożylne 5,0 mg BT061, natomiast dwoje pacjentów z grupy dawkowej III otrzymało placebo. Dawkę w stosunku do masy i dawkę na pole powierzchni ciała (BSA) u każdego pacjenta przedstawiono w tabeli 14B. [0192] Wyniki w skali PASI u pacjentów w grupie dawkowej III przedstawiono w tabeli 14B wraz z procentową poprawą w skali PASI w porównaniu z wartościami wyjściowymi.

67 66 Grupa dawkowa IV [0193] Sześcioro pacjentów z grupy dawkowej IV otrzymało pojedyncze wstrzyknięcie dożylne 10,0 mg BT061, natomiast dwoje pacjentów z grupy dawkowej IV otrzymało placebo. Dawkę w stosunku do masy i dawkę na pole powierzchni ciała (BSA) u pacjentów przedstawiono w tabeli 14C. [0194] Wyniki w skali PASI u pacjentów w grupie dawkowej IV przedstawiono w tabeli 14C wraz z procentową poprawą w skali PASI w porównaniu z wartościami wyjściowymi.

68 67

69 68

70 69

71 70

72 71 [0195] Ponadto na Fig. 11A do 11H i na Fig. 12A do 12H przedstawiono wykres wyników w skali PASI w zależności od czasu u indywidualnych pacjentów. Wykresy przedstawione na Fig. 11A do 11 H przedstawiają wyniki w skali PASI u pacjentów z grupy dawkowej I, natomiast wykresy przedstawione na Fig. 12A do 12H przedstawiają wyniki w skali PASI u pacjentów z grupy dawkowej II. [0196] Jak widać z wyników przedstawionych w tabelach 13 i 14, 75% wszystkich pacjentów z grupy dawkowej I i grupy dawkowej II wykazuje ewidentną poprawę wyników w skali PASI, to znaczy co najmniej 40% poprawę w stosunku do wartości wyjściowej, po pojedynczej dawce. Należy zauważyć, że 25% pacjentów w grupie dawkowej I i grupie dawkowej II otrzymywało placebo. [0197] W istocie w obu grupach dawkowych 50% pacjentów wykazywało co najmniej 50% poprawę wyników w skali PASI, przy czym u jednego pacjenta w grupie dawkowej II poprawa wyniku w skali PASI w dniu 56 wynosiła 88% (pacjent 3 w tabeli 14). Ponadto efekt terapeutyczny jest długotrwały nawet w tych małych dawkach, a poprawa jest nadal widoczna u wielu pacjentów na koniec badania, 75 dni po podaniu. [0198] Pacjenci w grupie dawkowej III również wykazują poprawę wyników w skali PASI: u sześciorga z 8 pacjentów obserwowano po leczeniu poprawę ponad 20%, a u dwojga z tych sześciorga ponad 30% poprawę po leczeniu. Ta poprawa nie była jednak tak istotna, jak u pacjentów z grupy dawkowej I i grupy dawkowej II, którzy otrzymali mniejszą dawkę przeciwciała. Pewną skuteczność obserwuje się także u pacjentów z grupy dawkowej IV. W szczególności, pacjenci 1, 4, 5 i 8 w

73 72 tej grupie dawkowej (jak ukazano w tabeli 14C) wykazują ewidentną poprawę wyników w skali PASI, jakkolwiek ograniczoną w porównaniu z pacjentami z grup dawkowych I do III. [0199] Liczbę pacjentów wykazujących co najmniej 40%, 50%, 60% i 75% poprawę wyniku w skali PASI przedstawiono w tabeli 15. [0200] Na Fig. 13A i 13B przedstawiono dokumentację zdjęciową poprawy poziomu łuszczycy przed leczeniem i po leczeniu. Fig. 13A przedstawia powierzchnię łuszczycy na skórze pacjenta w grupie dawkowej II przed podaniem. Fig. 13B przedstawia tę samą powierzchnię łuszczycy 28 dni po podaniu. Obszar poprawy zaznaczono na Fig. 13B czarnymi kratkami. [0201] Z tych wyników jasno widać, że BT061 zapewnia skuteczne leczenie umiarkowanej i ciężkiej przewlekłej łuszczycy. [0202] Wyniki tego badania, w skojarzeniu z wynikami opisanymi powyżej w przykładzie 6, które wykazują, że

74 73 duże dawki przeciwciała według niniejszego wynalazku są na ogół dobrze tolerowane u ludzi, dowodzą zdolności kompozycji farmaceutycznych według niniejszego wynalazku do zapewniania skutecznego leczenia chorób autoimmunologicznych w opisywanych tu dawkach. PRZYKŁAD 8 Badanie kliniczne BT061 u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów [0203] Bada się zdolność BT061 do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów u pacjentów cierpiących na tę chorobę. Badanie obejmuje badanie z wieloma dawkami u 96 pacjentów podzielonych na 12 grup. W każdej grupie dwoje pacjentów otrzymuje placebo, a 6 pacjentów otrzymuje BT061. Pacjentom podaje się jedną dawkę w tygodniu przez 6 tygodni. [0204] Pacjentów dzieli się na pacjentów otrzymujących dawkę podskórnie i pacjentów otrzymujących dawkę dożylnie. W grupach otrzymujących dawkę podskórnie podaje się: 1,25 mg, 6,25 mg, 12,5 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg i 100 mg. W grupach otrzymujących przeciwciało dożylnie podaje się dawki: 0,5 mg, 2 mg, 6,25 mg, 12,5 mg i 25 mg. [0205] W grupie otrzymującej podskórnie dawkę 1,25 mg pacjentom nadaje się numery 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107 i 108. W grupie otrzymującej podskórnie dawkę 6,25 mg pacjentom nadaje się numery W grupie otrzymującej podskórnie dawkę 12,5 mg pacjentom nadaje się numery W grupie otrzymującej dawkę 25 mg podskórnie pacjentom nadaje się numery W grupie otrzymującej podskórnie dawkę 50 mg pacjentom nadaje się numery W grupie otrzymującej

75 74 dożylnie dawkę 6,25 mg pacjentom nadaje się numery [0206] Procedura podawania dożylnego i podskórnego była taka sama jak opisano w przykładzie 7 w odniesieniu do badania z łuszczycą. [0207] Poziom reumatoidalnego zapalenia stawów dokumentuje się co tydzień przez ocenę parametrów ACR, zwłaszcza badania liczby bolesnych i obrzękniętych stawów oraz monitorowanie poziomu białka C-reaktywnego (CRP) i szybkości opadania krwinek czerwonych (ang. erythrocyte sedimentation rate ESR, pol. Odczyn Biernackiego, OB. Te parametry ocenia się przed badaniem, żeby uzyskać wartość wyjściową w dniu 0, i powtarza się w trakcie badania i po badaniu w dniach 8, 22 i 43 po zakończeniu okresu podawania (to znaczy w dniach obserwacji ang. follow-up, FU 8 dzień FU, 22 dzień FU i 43 dzień FU). [0208] W poniższych tabelach podano dane uzyskane w tym badaniu. Konkretnie, w tabelach 16 do 21 podano liczbę bolesnych i obrzękniętych stawów w trakcie badania.

76 75

77 76

78 77

79 78 [0209] Fig. 14 przedstawia odsetek pacjentów z grup otrzymujących dawkę 1,25 mg, 6,25 mg, 12,5 mg i 25 mg BT061 podskórnie, uzyskujących co najmniej 20% poprawę odpowiednich parametrów ACR w trakcie badania, i odsetek pacjentów uzyskujących odpowiedź ACR20 co najmniej w tygodniu 7. [0210] W szczególności można zauważyć, że 50% pacjentów w grupie otrzymującej dawkę 25 mg podskórnie (to znaczy 4 z 8 pacjentów, przy czym 2 pacjentów otrzymuje placebo) uzyskało co najmniej 20% poprawę odpowiednich parametrów ACR w tygodniu 6. Liczby te zwiększyły się do 5 z 8 pacjentów w tygodniu 7, to znaczy 5 z 8 pacjentów osiągnęło co najmniej ACR20. Jeden pacjent w tej grupie dawkowej osiągnął ponad 50% poprawę odpowiednich parametrów ACR w tygodniach 5 i 6 (nie przedstawiono pełnego wykazu danych). [0211] Pozytywne wyniki uzyskano również u pacjentów w innych grupach dawkowych. Jeden pacjent w grupie otrzymującej podskórnie dawkę 6,25 mg osiągnął co najmniej 50% poprawę odpowiednich parametrów ACR w tygodniu 4, natomiast inny pacjent osiągnął co najmniej 70% poprawę odpowiednich parametrów ACR w tygodniu 3 (nie przedstawiono pełnego wykazu danych). [0212] Fig. 15A i 15B przedstawiają wyniki w odniesieniu do liczby bolesnych i obrzękniętych stawów u pacjentów z grupy dawkowej 25 mg BT061 podskórnie w okresie 6 tygodni. U kilkorga pacjentów obserwuje się zmniejszenie liczby bolesnych i obrzękniętych stawów w okresie leczenia. Wyniki u jednego pacjenta reagującego na leczenie i jednego pacjenta niereagującego na leczenie z tej grupy dawkowej przedstawiono,

80 79 odpowiednio, na Fig. 16A i 16B. U pacjenta reagującego na leczenie występuje istotna poprawa w zakresie liczby bolesnych i obrzękniętych stawów oraz poziomów bólu. [0213] Zmniejszenie liczby bolesnych i obrzękniętych stawów obserwuje się również u pacjentów z innych grup dawkowych. Na Fig. 17A, 17B, 18A i 18B przedstawiono liczbę bolesnych stawów, odpowiednio, w grupach dawkowych otrzymujących 1,25 mg podskórnie, 6,25 mg podskórnie, 50 mg podskórnie i 6,25 mg dożylnie w trakcie badania i w tygodniach następujących po nim. [0214] Te wyniki dowodzą skuteczności przeciwciała według niniejszego wynalazku w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów w opisywanym tu zakresie dawek. Biotest AG Pełnomocnik:

81 80 Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu choroby autoimmunologicznej zawierająca farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i humanizowane przeciwciało anty-cd4 zdolne do aktywowania regulatorowych komórek T CD4 + CD25 +, przy czym kompozycja ma być podawana osobnikowi podskórnie w dawce humanizowanego przeciwciała anty-cd4 wynoszącej od 20 mg do 100 mg, przy czym dawka ma być podawana co tydzień i przy czym humanizowane przeciwciało anty-cd4 zawiera domenę stałą IgG1 i posiada domeny V zdefiniowane poprzez następujące sekwencje polipeptydowe: - domena V łańcucha H: - domena V łańcucha L: 2. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 1, w której humanizowane przeciwciało anty-cd4 ma być podawane osobnikowi w dawce od 20 mg do 80 mg, i korzystnie od 20 mg do 60 mg. 3. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 1, w której humanizowane przeciwciało anty-cd4 ma być podawane osobnikowi w dawce 20 mg, 25 mg, 60 mg, 75 mg, 80 mg lub 100 mg. 4. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu choroby autoimmunologicznej zawierająca farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i humanizowane

82 81 przeciwciało anty-cd4 zdolne do aktywowania regulatorowych komórek T CD4+CD25+, przy czym kompozycja ma być podawana osobnikowi podskórnie w dawce humanizowanego przeciwciała anty-cd4 wynoszącej od 8 do 60 mg/m 2 pola powierzchni ciała osobnika, przy czym dawka ma być podawana co tydzień i przy czym humanizowane przeciwciało anty-cd4 zawiera domenę stałą IgG1 i posiada domeny V zdefiniowane poprzez następujące sekwencje polipeptydowe: - domena V łańcucha H: - domena V łańcucha L: 5. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 4, przy czym kompozycja ma być podawana osobnikowi w dawce humanizowanego przeciwciała anty-cd4 wynoszącej od 8 do 50 mg/m 2, i korzystnie od 8 do 40 mg/m Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu choroby autoimmunologicznej zawierająca farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i humanizowane przeciwciało anty-cd4 zdolne do aktywowania regulatorowych komórek T CD4+CD25+, przy czym kompozycja ma być podawana osobnikowi podskórnie w dawce humanizowanego przeciwciała anty-cd4 wynoszącej od 0,2 do 1,5 mg/kg, przy czym dawka ma być podawana co tydzień, i przy czym humanizowane przeciwciało anty-cd4 zawiera domenę stałą IgG1 i posiada domeny V

83 82 zdefiniowane poprzez następujące sekwencje polipeptydowe: - domena V łańcucha H: (NR ID. SEKW. 1) - domena V łańcucha L: 7. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 6, przy czym kompozycja ma być podawana osobnikowi w dawce humanizowanego przeciwciała anty-cd4 wynoszącej od 0,2 do 1 mg/kg, i korzystnie w dawce 1 mg/kg. 8. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń, przy czym choroba autoimmunologiczna wybrana jest spośród: łuszczycy, reumatoidalnego zapalenia stawów, stwardnienia rozsianego, cukrzycy typu 1, nieswoistego zapalenia jelit, choroby Crohna, autoimmunologicznego zapalenia tarczycy, autoimmunologicznej miasteni, tocznia rumieniowatego układowego i chorób związanych z przeszczepieniami, takich jak choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi, lub ogólne problemy z tolerancją narządową. 9. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według dowolnego z poprzednich zastrz., przy czym kompozycja dostarczana jest w objętości dawkowania wynoszącej 0,1 do 3 ml, korzystnie 0,5 do 1,5 ml.

84 Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 8, przy czym chorobą autoimmunologiczną jest łuszczyca lub reumatoidalne zapalenie stawów. 11. Zastosowanie humanizowanego przeciwciała anty- CD4 zdolnego do aktywowania regulatorowych komórek T CD4 + CD25 + do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby autoimmunologicznej, przy czym humanizowane przeciwciało anty-cd4 zawiera domenę stałą IgG1 i posiada domeny V zdefiniowane poprzez następujące sekwencje polipeptydowe: - domena V łańcucha H: - domena V łańcucha L: i przy czym kompozycja ma być podawana osobnikowi podskórnie w dawce humanizowanego przeciwciała anty-cd4 wynoszącej: (i) od 20 mg do 100 mg; (ii) od 8 do 60 mg/m 2 pola powierzchni ciała pacjenta, lub (iii) od 0,2 do 1,5 mg/kg, przy czym dawka ma być podawana co tydzień. 12. Zastosowanie według zastrz. 11, przy czym: (i) choroba autoimmunologiczna wybrana jest spośród: łuszczycy, reumatoidalnego zapalenia stawów, stwardnienia rozsianego, cukrzycy typu 1, nieswoistego zapalenia jelit, choroby Crohna, autoimmunologicznego zapalenia tarczycy, autoimmunologicznj miasteni, tocznia rumieniowatego układowego i chorób związanych z przeszczepieniami, takich jak choroba przeszczep

85 84 przeciwko gospodarzowi, lub ogólne problemy z tolerancją narządową, a korzystnie chorobą tą jest łuszczyca lub reumatoidalne zapalenie stawów; i(lub) (ii) kompozycja dostarczana jest w objętości dawkowania wynoszącej 0,1 do 3 ml, korzystnie od 0,5 do 1,5 ml. Biotest AG Pełnomocnik:

86 85

87 86

88 87

89 88

90 89

91 90

92 91

93 92

94 93

95 94

96 95

97 96

98 97

99 98

100 99

101 100

102 101

103 102

104 103

105 104

106 105

107 106

108 107

109 108

110 109

111 110

112 111

113 112

114 113

115 114

116 115

117 116