(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. G01N 33/3 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 12/43 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Sposób określania zakażenia Trichinella () Pierwszeństwo: DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 11/09 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 13/04 (73) Uprawniony z patentu: Prionics AG, Schlieren, CH (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 ALEX RÄBER, Zürich, CH TINA HAUPT, Rüdlingen, CH PATRIK BUHOLZER, Winterthur, CH (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Zofia Sulima SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-323/VAL EP B1 Opis [0001] Wynalazek dotyczy sposobu określania zakażenia Trichinella według części przedznamiennej zastrzeżenia 1. [0002] Trichinella spp. obejmuje grupę nicieni występujących na całym świecie. Gatunkami dominującymi w Europie są Trichinella spiralis, Trichinella britovi, Trichinella pseudospiralis i Trichinella nativa. Zakażenia Trichinella mogą występować u różnych gatunków, w tym ludzi, świni, szczurów, niedźwiedzi, koni i ptaków, wymieniając tylko niektóre przykłady. [0003] W przypadku Trichinella są to nicienie pasożytnicze, które przechodzą określony cykl życiowy. Larwy przedostają się do organizmu przez zjedzenie surowego lub niewystarczająco ugotowanego mięsa. Po zjedzeniu są uwalniane przez soki żołądkowe i przechodzą z mięsa do przewodu pokarmowego. Tu rosną one do dojrzałych nicieni. Po kopulacji żeńskie osobniki wydają na świat do 0 nowych larw, które przez krążenie limfy i krwi przenikają do mięśni poprzecznie prążkowanych, szczególnie przepony, języka, oka i mięśni szczęk. Larwy rosną i tworzą kompleksy larw, które z biegiem czasu wapnieją. [0004] Zakażenia Trichinella stanowią poważny problem w produkcji zwierzęcej. Należy w sposób niezawodny wykluczyć możliwość zachorowania ludzi na włośnicę po spożyciu surowego lub niewystarczająco ugotowanego mięsa chorych zwierząt. Włośnica u ludzi jest poważną chorobą, która powoduje znaczne cierpienie i w skrajnych przypadkach prowadzi do śmierci. [000] W celu bezpieczeństwa artykułów żywnościowych konieczne jest, aby wszystkie tusze świni testowano w ramach badania poubojowego. Zazwyczaj tusze przetwarza się natychmiast po uboju. Przy stosowaniu obecnych testów problematyczne jest to, że rozbiór w kolejnym po rzeźni przedsiębiorstwie obróbki mięsa zostaje natychmiast w pewnym stopniu zakończony, zanim dostępne są wyniki testów na obecność Trichinella. Stanowi to znaczny problem logistyczny. W razie wątpliwości, po uzyskaniu pozytywnych wyników, rozebrane części świni z powrotem wybiera się z obiegu przetwórczego i niszczy. [0006] Obecnie dopuszczono sposoby, w których wykrywa się Trichinella bezpośrednio. W Europie starszym sposobem, dopuszczalnym tylko podczas okresu przejściowego, jest tak zwana trychinoskopia, w której tkankę ściska się między dwiema szklanymi płytkami, a następnie bada się mikroskopowo. Sposób ten jest właściwie mało czuły, a ponadto także praco- i czasochłonny. Poza tym gatunki Trichinella, które nie ulegają otorbieniu, jak np. Trichinella pseudospiralis, nie są wykrywane albo są wykrywane lecz bardzo słabo. [0007] Innym dopuszczalnym sposobem jest tak zwany test trawienia, który jest bardziej czuły niż do tej pory opisana bezpośrednia detekcja. W teście tym tkankę mięśniową otaczającą larwę trawi się sztucznie proteazami i kwasem solnym i po różnych etapach sedymentacyjnych pozostają larwy. Następnie można mikroskopowo określić liczbę larw. Granica wykrywalności wynosi 3 do larw na gram tkanki. [0008] Znacznie szybszymi i mającymi wyraźnie wyższą czułość są sposoby serologiczne odpowiedniego rodzaju, w których najczęściej drogą pośrednią wykrywa się przeciwciała przeciw Trichinella spp. Takie sposoby serologiczne można realizować przykładowo w surowicy krwi lub soku z mięsa. Standardowe sposoby mają granicę wykrywalności wynoszącą 0,01 larwy na gram tkanki mięśniowej. [0009] W sposobach serologicznych odpowiedniego rodzaju dodaje się próbki surowicy badanego organizmu z antygenami Trichinella, np. antygenem wydalniczym/wydzielniczym (E/S). Przeciwciała ewentualnie zawarte w surowicy z powodu obecności zakażenia Trichinella wiążą antygen. Związane przeciwciała wykrywa się z kolei na przykład za pomocą znakowanych przeciwciał przeciw IgG świni. W powszechnie stosowanych sposobach serologicznych pracuje się z np. unieruchomionymi antygenami i wykazują one ewentualne związane przeciwciała IgG. Szczególnymi kolejnymi antygenami odpowied-

3 nimi dla sposobu serologicznego są np. te ujawnione w WO 07/ [00] Reiterova K. i in. (Infection 3(2); 07; pp89-93) ujawnili określanie zakażenia Trichinella obejmujące inkubację surowicy pacjenta z antygenem E/S sprzężonym z płytkami ELISA i oznaczenie IgG i IgM za pomocą odpowiednich anty-przeciwciał (streszczenie). [0011] Mimo że sposoby serologiczne odpowiedniego rodzaju są czułe, nie są one teraz dopuszczone do kontroli mięsa lub programów bezpieczeństwa artykułów żywnościowych. Wprawdzie sposoby serologiczne są szybsze i bardziej czułe niż testy bezpośrednie, jak np. sztuczne trawienie, jednak obecne przepisy UE nie pozwalają mimo to na indywidualne badanie tusz sposobami serologicznymi, ponieważ znanymi sposobami serologicznymi, szczególnie we wczesnej fazie zakażenia, można uzyskiwać fałszywie negatywne wyniki. Podobne stanowisko przyjmuje Międzynarodowa Komisja Włośnicowa (ICT). Również w tym przypadku krytykuje się, że okno diagnostyczne sposobów serologicznych nie wystarcza i ewentualnie pozytywne zwierzęta są pomijane przy stosowaniu dostępnych sposobów, ze względu na zbyt niski sygnał we wczesnej fazie zakażenia. Ponieważ jednak w tej fazie larwy mogą być natychmiast obecne w mięśniach i być zakaźne, u zwierząt należy w sposób niezawodny wykrywać również wczesną fazę zakażenia. [0012] Celem niniejszego wynalazku jest opracowanie niezawodnego serologicznego sposobu diagnozy zakażeń Trichinella, który umożliwia wykrywanie zarówno wczesnych zakażeń, jak również zaawansowanych zakażeń Trichinella. [0013] Cel ten osiągnięto opracowując sposób według zastrzeżenia 1. Korzystne postacie realizacji podano w zastrzeżeniach zależnych. [0014] Sposób według wynalazku realizuje się zasadniczo jak opisano powyżej. Próbkę od badanych ludzi lub zwierząt, np. surowicę lub sok z mięsa, inkubuje się korzystnie z unieruchomionymi antygenami. Przeciwciała, ewentualnie zawarte w próbce, wiążą antygeny. Kompleksy przeciwciało-antygen wykrywa się za pomocą znakowanych przeciwciał. Można stosować szczególnie sposób ELISA. Jednak można wyobrazić sobie również inne sposoby z innymi znacznikami, które np. wykrywa się optycznie. [001] Jak stwierdzono powyżej, zwykłe testy na obecność Trichinella wykrywają kompleksy przeciwciało-antygen za pomocą przeciwciał przeciwko przeciwciałom IgG, ponieważ są to trwałe przeciwciała zwykle tworzące się we wzrastającej ilości w przebiegu zakażenia. [0016] Zgodnie z wynalazkiem przewidziano obecnie, że ponadto jednocześnie bada się, czy tworzą się przeciwciała IgM. Można to osiągnąć prostym sposobem przez dodatek przeciwciał przeciwko przeciwciałom IgM. [0017] Zgodnie z wynalazkiem przewidziano również, że bada się próbki pod względem obecności przeciwciał IgM i IgG w połączeniu. We wczesnej fazie zakażenia najpierw tworzą się przeciwciała IgM, podczas gdy występowanie przeciwciał IgG rozpoczyna się dopiero od 1 dnia po zakażeniu. Zawartość przeciwciał IgM w tym czasie zaczyna się znowu zmniejszać. [0018] Względne zmniejszenie zawartości przeciwciał IgM, obserwowane natychmiast po zakażeniu, jest również głównym powodem, dlaczego np. sposób ELISA, w którym oznacza się przeciwciała IgM, uważa się za nieodpowiedni do diagnozy zakażenia Trichinella. Odnosi się to do reprezentatywnej, przeprowadzonej w Instytucie Parazytologii w Warszawie, Polska, pracy doktorskiej zatytułowanej The usefulness of ELISA test for early serological detection of Trichinella spp. infection in pigs, którą przedstawiono w ramach obrony w 06. W pracy doktorskiej przeciwstawiono sobie sposoby, w których z jednej strony wykrywa się przeciwciała IgG, a z drugiej strony przeciwciała IgM. W ramach tego ujawnienia stwierdzono, że sposób ELISA, w którym wykrywano przeciwciała IgG, jest zasadniczo odpowiedni do wykrywania zakażenia Trichinella. Przeciwciała IgM zakwalifikowano jednak jako nieodpowiednie markery reakcji humoralnej zakażonych zwierząt. Głównym powodem było to, że przynajmniej według poglądów wyrażonych w ujawnieniu nie można wykryć szczególnie Trichinella spiralis. Kolejnym powodem jest oczywiście to, że stężenie IgM stosunkowo wcześnie ponownie maleje i okno diagnostyczne może zatem objąć jedynie wczesne zakażenia.

4 [0019] We właściwych badaniach, które później wyjaśniono na podstawie Figur 1 i 2, zgłaszający stwierdzili, że przeciwciała klasy IgM występują również w zakażeniach Trichinella spiralis i dają się wykryć, np. za pomocą ELISA. Tak więc, w sprzeczności z wyrażonym poglądem, okazuje się, że przeciwciała IgM są zasadniczo odpowiednim markerem do określania wczesnych zakażeń Trichinella. [00] Od zakażenia Trichinella występuje odpowiedź immunologiczna w organizmie, którą można wykryć sposobem według wynalazku niewiele dni później. Jak przedstawiono na Fig. 1 lub 2, najpierw wykrywa się przeciwciała IgM, w późniejszym przebiegu zakażenia przeciwciała IgM i IgG, a następnie w coraz większym stopniu tylko przeciwciała IgG. [0021] Sposób według wynalazku rozpoznaje tym samym zakażenie znacznie wcześniej niż dotychczas znane sposoby i dlatego zmniejsza okno diagnostyczne (patrz też Fig. 3 omówiona poniżej). [0022] Dzięki testowi opracowanemu przez zgłaszającego, w którym najpierw wykrywa się obie odpowiedzi przeciwciał jednocześnie, nieoczekiwanie można przezwyciężyć istotne wady znanych sposobów serologicznych. [0023] W ramach ujawnienia możliwe jest ogólnie wykrycie obecności odpowiedzi przeciwciał na zakażenie Trichinella, bez przyporządkowania klasy przeciwciał. Jeśli pożądana jest również informacja o tym, czy jest to wczesne czy raczej późne stadium zakażenia, możliwe jest również stosowanie sposobu według wynalazku, w którym wykorzystuje się anty-przeciwciała z różnymi znacznikami, w zależności od tego czy są przeznaczone do wykrywania przeciwciał IgG lub IgM. [0024] Jak stwierdzono powyżej, w zwykłym i serologicznym sposobie według wynalazku do próbki dodaje się antygeny Trichinella. Jako antygeny można stosować szczególnie antygen E/S. Możliwe są również kolejne polipeptydy o działaniu immunogennym, pojedynczo lub w połączeniu, jak np. opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT/EP07/00774 lub WO 07/ [002] Można stosować oczywiście wiele różnych antygenów, szczególnie antygenów, które występują w różnych stadiach zakażenia. Z tego powodu zapewnia się lepsze właściwości wiązania ewentualnie zawartych przeciwciał w danych warunkach, co prowadzi również do lepszego wyniku. [0026] W celu ułatwienia wykrywania ewentualnie utworzonych kompleksów antygenprzeciwciało, korzystna jest możliwość stosowania antygenów w postaci unieruchomionej. Możliwe jest np. powleczenie ścianek płytek do mikromianowania antygenami. Kolejną możliwością jest związanie antygenów z kulkami. Zasadniczo odpowiednie są wszystkie sposoby unieruchamiania, za pomocą których można w łatwy sposób oddzielić przeciwciała i ewentualnie związane z nimi przeciwciała od reszty próbki. [0027] Dalej zgodnie z wynalazkiem zapewniono, że anty-przeciwciała mają znaczniki wykrywalne zwykłymi sposobami. Może to być np. znacznik odpowiedni do wykrywania za pomocą ELISA. Możliwe są jednak również inne, np. optycznie wykrywalne znaczniki, np. znaczniki fluorescencyjne. [0028] Jako badane próbki tkanki można stosować/wykorzystywać szczególnie krew, surowica, osocze, sok z mięsa. [0029] Ujawnienie, oprócz sposobu, dotyczy również zestaw diagnostyczny, który można stosować w sposobie. [00] Taki zestaw zawiera odpowiedni, szczególnie unieruchomiony antygen Trichinella, jak również przeciwciała anty-igg i anty-igm zawierające znaczniki umożliwiające wykrycie. Korzystnie antygeny Trichinella i anty-przeciwciała są konfekcjonowane oddzielnie, tak że najpierw można uzyskać kontakt między antygenami i próbką tkanki i po wystarczającym czasie inkubacji można dodać anty-przeciwciała. [0031] Korzystnie dostarcza się antygen Trichinella w postaci unieruchomionej. Możliwe jest np. sprzężenie z kulkami lub powleczenie ścianek studzienek do mikromianowania antygenem, wymieniając tylko niektóre przykłady.

5 [0032] W istocie unieruchomienie antygenu służy do tego, aby umożliwić łatwiejsze oddzielenie ewentualnych kompleksów antygen-przeciwciało od próbki. To oddzielenie ułatwia specyficzne wykrywanie kompleksów. [0033] Oprócz testów heterogenicznych oczywiście możliwe są również testy homogeniczne, tj. sposoby, w których antygen występuje jako nieunieruchomiony. Korzystnym sposobem byłby np. test polaryzacji fluorescencji. Realizacja takiego sposobu jest znana specjaliście. W związku z tym nie będzie dalej omówiona. [0034] Jak już wspomniano przy opisie sposobu, zestaw zawiera jako antygen korzystnie tak zwany antygen E/S z Trichinella lub immunogenne fragmenty tego antygenu. Możliwe jest oczywiście również zastosowanie kolejnych polipeptydów z Trichinella o działaniu antygenowym. Zasadniczo można stosować wszystkie peptydy lub polipeptydy, które mają szereg aminokwasów, które tworzą ciągły lub nieciągły epitop, który jest rozpoznawany przez surowice pochodzące od świń zakażonych Trichinella. [003] Możliwe jest oczywiście też łączenie wielu różnych antygenów w zestawie. Antygeny mogą występować jako mieszanina. Możliwe jest również ich dostarczenie przykładowo jako białek fuzyjnych sprzężonych ze sobą. [0036] Znaczniki na anty-przeciwciałach mogą być ostatecznie tak zbudowane, że w prosty sposób umożliwiają wykrywanie optyczne. Korzystne jest jednak stosowanie sposobu ELISA. Oczywiście anty-przeciwciała mogą również być sprzężone z odpowiednimi enzymami, które umożliwiają pożądane wykrywanie za pomocą ELISA. [0037] Oczywiście postacie opisane w związku z zestawem, mimo że nie zostały wymienione, można realizować odpowiednio również w ramach sposobu. [0038] Poniżej szczegółowo omówiono wynalazek na podstawie kilku ilustracji. [0039] Na ilustracjach: Fig. 1 i Fig. 2 schematycznie przedstawiają wyniki sposobów ELISA przy określaniu odpowiedzi immunologicznej świń sztucznie zakażonych doustnie 000 larw T. spiralis, a Fig. 3 (A)-(C) schematycznie przedstawiają okna diagnostyczne pokryte różnymi sposobami identyfikacji zakażeń Trichinella. [0040] Figury 1 i 2 przedstawiają w każdym wypadku wyniki 3 sposobów ELISA. Przedstawiono w każdym wypadku przebieg odpowiedzi IgG ( ), IgM ( ), jak również połączonej ( ) odpowiedzi IgG i IgM na zakażenie Trichinella w różnych punktach czasowych. [0041] Świnie sztucznie zakażono doustnie 000 larw T. spiralis i badano próbki surowicy zakażonych świń w różnych punktach czasowych. Fig. 1 i Fig. 2 przedstawiają wyniki badań, które przeprowadzono w takich samych warunkach na próbkach uzyskanych z różnych stad świń. [0042] Próbki pobierano w następujących dniach po zakażeniu 0, 7, 14, 21, 28, 3, 42 i 49 (d.p.i. = dni po zakażeniu). Okazało się, że połączonym wykrywaniu można było wykryć odpowiedź IgM i IgG już 7 dnia po zakażeniu, a następnie utrzymywała się ona przez cały czas życia zwierzęcia. [0043] Przedstawiono ponadto reakcje IgM, które mierzono stosunkowo wcześnie po zakażeniu i odpowiedź IgG, która jest wykrywalna od ok. 1 dnia, a następnie jest stosunkowo stale wykrywalna przez resztę czasu życia zwierzęcia. [0044] Obie Figury 1 i 2 przedstawiają podobne przebiegi reakcji wspomnianych powyżej. [004] Fig. 3 (A)-(C) schematycznie przedstawia okno diagnostyczne pokryte różnymi sposobami [(A) = test trawienia; (B) = zwykły test ELISA E/S i (C) = ELISA według wynalazku] do identyfikacji zakażenia Trichinella. [0046] Figura 3 (A) pokazuje, że najwcześniejszym punktem czasowym, w którym zakażenie Trichinella daje się wykryć sztucznym testem trawienia, jest 17 dzień po zakażeniu. [0047] Figura 3 (B) pokazuje warunki do identyfikacji zakażenia Trichinella u świń z zastosowaniem zwykłego sposobu E/S-ELISA. Okazało się tu, że wykrycie odpowiedzi immunologicznej zwykłym sposobem serologicznym najwcześniej możliwe jest 21 dnia po zakażeniu. Do tego punktu czasowego larwy mogą już być zakaźne.

6 1 [0048] Figura 3 (C) pokazuje warunki sposobu według wynalazku do identyfikacji świń zakażonych Trichinella. Najwcześniejszym punktem czasowym, w którym daje się wykryć odpowiedź przeciwciał w próbkach ze świń zakażonych Trichinella, jest 7 dzień po zakażeniu. Jest to wyraźnie wcześniej niż w przypadku obu sposobów przedstawionych w (A) i (B). 7 dnia larwy nadal nie są jeszcze zakaźne. Przyjmuje się zatem, że sposób według wynalazku umożliwia wystarczająco niezawodne określenie zakażenia Trichinella. [0049] Porównanie różnych sposobów wykrywania w (A), (B) i (C) przedstawiono liniami przerywanymi. b pokazuje okno diagnostyczne dla powszechnie stosowanego testu E/S- ELISA (B), a pokazuje okno diagnostyczne dla znanego testu sztucznego trawienia (A), natomiast c pokazuje okno diagnostyczne dla sposobu ELISA według wynalazku (C). Również z tego przedstawienia wynika wyraźnie, że sposobem według wynalazku zakażone świnie można wykryć w istotnie wcześniejszym punkcie czasowym. Okno diagnostyczne staje się przez to wyraźnie węższe, wykrycie zakażenia Trichinella jest możliwe nawet wcześniej niż testem sztucznego trawienia i czyni tego rodzaju sposób diagnostyczny odpowiednim do indywidualnego badania mięsa w rzeźni. Zastrzeżenia patentowe 2 1. Sposób określania zakażenia Trichinella u zwierząt lub ludzi, obejmujący inkubację próbki tkanki z antygenem Trichinella pobranej od zwierzęcia lub człowieka, obróbkę próbki tkanki, dodanie anty-przeciwciał do próbki tkanki i sprawdzenie czy ma miejsce wiązanie anty-przeciwciała do ewentualnie zawartego w próbce tkanki kompleksu antygen-przeciwciało, znamienny tym, że jako anty-przeciwciało jednocześnie dodaje się przeciwciało anty-igg i przeciwciało anty-igm. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że jako antygen Trichinella stosuje się antygen E/S. 3. Sposób według zastrzeżenia 1 albo 2, znamienny tym, że stosowane antygeny występują w postaci unieruchomionej. 4. Sposób według jednego z poprzednich zastrzeżeń, znamienny tym, że stosuje się znakowane anty-przeciwciała.. Sposób według jednego z poprzednich zastrzeżeń znamienny tym, że dostarcza się przeciwciała anty-igg z innym znacznikiem niż przeciwciała anty-igm. 6. Sposób według jednego z poprzednich zastrzeżeń, znamienny tym, że próbką tkanki jest surowica, osocze lub sok z mięsa. Uprawniony: Pełnomocnik: Prionics AG mgr inż. Zofia Sulima Rzecznik patentowy

7 6

8 7

9 8 DOKUMENTY CYTOWANE W OPISIE Ta lista dokumentów cytowanych przez Zgłaszającego została przyjęta jedynie dla informacji czytającego i nie jest częścią składową europejskiego opisu patentowego. Została ona utworzona z dużą starannością; Europejski Urząd Patentowy nie ponosi jednak żadnej odpowiedzialności za ewentualne błędy i braki. Dokumenty patentowe cytowane w opisie WO A [0009] [0024] EP W [0024] Dokumenty niepatentowe cytowane w opisie REITEROVA K. i in. Infection, 07, tom 3 (2), [00]