Wrażliwość na antybiotyki i zdolność wytwarzania śluzu przez szczepy gronkowców koagulazo-ujemnych

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: Ewa Szczuka 1, Jolanta Prawda-Zołotar 2, Maryla Nowakiewicz 2, Adam Kaznowski 1 Wrażliwość na antybiotyki i zdolność wytwarzania śluzu przez szczepy gronkowców koagulazo-ujemnych 1 Zakład Mikrobiologii, Instytutu Biologii Eksperymentalnej, Wydziału Biologii UAM w Poznaniu Kierownik: prof. dr hab. A. Kaznowski 2 Laboratorium Mikrobiologiczne, Regionalny Szpital w Kołobrzegu Kierownik: mgr J. Prawda-Zołotar Określono wrażliwość gronkowców koagulazo-ujemnych na antybiotyki oraz zdolność wytwarzania zewnątrzkomórkowego śluzu odgrywającego istotną rolę w procesie tworzenia biofilmu. Wszystkie szczepy były wrażliwe na wankomycynę, linezolid i chinupristinę/dalfopristinę, ale aż 66% było opornych na metycylinę. Większość szczepów S. epidermidis wytwarzało śluz, podczas gdy żaden z izolatów S. haemolyticus nie miał tej zdolności. Gronkowce koagulazo-ujemne (CNS, ang. coagulase-negative staphylococci) stanowią naturalną mikroflorę organizmu człowieka, najczęściej występują na skórze. Bakterie te jednak mogą powodować poważne zakażenia ludzi, w tym infekcje szpitalne, często związane z użyciem w leczeniu materiałów polimerowych, np. cewników, sztucznych zastawek serca, protez, implantów ortopedycznych itd. (7). Największy udział w tych zakażeniach mają S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. warneri i S. caprae (5). Gronkowce koagulazo-ujemne na powierzchniach abiotycznych polimerów mogą tworzyć biofilmy, w których komórki występują w polisacharydowej wydzielinie tworzącej amorficzny śluz. Biofilm sprzyja przetrwaniu bakterii w organizmie gospodarza, chroniąc je przed czynnikami fizyko-chemicznymi oraz mechanizmami odpornościowymi. W wyniku fragmentacji i odklejania się biofilmu pod wpływem urazu bakterie rozprzestrzeniają się w organizmie, zasiedlają nowe miejsca i dlatego zakażenia biofilmowe bardzo często mają charakter przewlekły i nawracający. Obecne w biofilmie bakterie wykazują większą oporność na antybiotyki, których stężenia konieczne do zabicia drobnoustrojów są wielokrotnie wyższe w porównaniu do działania na komórki planktonowe. Antybiotykoterapia pozwala na eliminacje komórek bakteryjnych uwalnianych z biofilmu, natomiast bardzo trudna jest eradykacja całej jego struktury (4). Leczenie pacjentów z zakażeniami gronkowcowymi stanowi ogromny problem ponieważ szczepy tych bakterii są przeważnie często oporne na wiele preparatów przeciwbakteryjnych. Na szczególną uwagę zasługują gronkowce metycylinooporne, ze względu na oporność na wszystkie antybiotyki ß-laktamowe, w tym

2 16 E. Szczuka i inni Nr 1 penicyliny, cefalosporyny, monobaktamy, karbapenemy oraz często na makrolidy, tetracykliny i linkozamidy (5). Celem pracy była ocena zdolności wytwarzania zewnątrzkomórkowego śluzu oraz wrażliwości na antybiotyki i chemioterapeutyki gronkowców koagulazo-ujemnych wyizolowanych z próbek materiału klinicznego pobranych od osób hospitalizowanych. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne. W badaniach wykorzystano 90 szczepów wyosobnionych z krwi, materiałów ropnych, wymazów z ran, końcówek cewników, płynu z opłucnej, wymazów z przetoki, moczu i aspiratu ze stawu kolanowego. Przynależność gatunkową szczepów określono przy użyciu zestawu ID 32 STAPH (biomérieux). Określenie zdolności do produkcji śluzu. Wytwarzanie zewnątrzkomórkowego śluzu oceniono na podłożu Congo red agar (CRA) (1). Hodowle prowadzono w temperaturze 37 0 C przez 24 h. Szczepy tworzące czarne kolonie z metalicznym połyskiem określono jako bakterie intensywnie wytwarzające polisacharydowy śluz. Szczepy rosnące w postaci czarnych kolonii wytwarzają śluz w sposób umiarkowany. Natomiast izolaty tworzące bordowe lub czerwone kolonie klasyfikowano jako niewytwarzające śluzu. Oznaczenie wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. Badanie przeprowadzono z użyciem zestawu ATB STAPH 5 (biomérieux). Określono oporność na metycylinę i linezolid metodą krążkowo-dyfuzyjną. Do oceny oporności na makrolidy i likozamidy MLS B zastosowano krążki z erytromycyną (15µg) i klindamycyną (2µg) lub linkomycyną (15µg) firmy biomérieux. Interpretację fenotypów oporności na makrolidy, likozamidy i streptograminy B dokonano zgodnie z zaleceniami Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (12). WYNIKI Z próbek materiału pobranego od chorych ludzi wyizolowano 90 szczepów gronkowców koagulazo-ujemnych. Dominowały bakterie należące do gatunków: S. epidermidis (51%), S. hominis (18%) i S. haemolyticus (13%). Rzadko izolowane były szczepy należące do gatunków: S. capitis (6%), S. xylosus (3%), S. chromogenes (2%), S. saprophyticus (2%), S. warneri (2%), S. cohnii (1%) i S. equorum (1%). Najwięcej szczepów gronkowców koagulazo-ujemnych zostało wyizolowanych z krwi (42%), z końcówek cewnika wkłucia centralnego (20%) i wymazów z ran (12%). Przeprowadzone badania wykazały, że 39 (44%) szczepów miało zdolność wytwarzania zewnątrzkomórkowego śluzu, przy czym 28 z nich charakteryzowało się intensywną produkcją, a 11 umiarkowaną. Większość szczepów S. epidermidis (61%), odznaczała się zdolnością wydzielania śluzu, podczas gdy żaden z izolatów S. haemolyticus go nie produkował. Niewielki odsetek szczepów S. hominis (13%) także wytwarzał śluz. Natomiast połowa szczepów należących do rzadko izolowanych gatunków gronkowców koagulazo-ujemnych miała zdolność wytwarzania śluzu. Wszystkie izolaty gronkowców koagulazo-ujemnych były wrażliwe na wankomycynę, linezolid i chinupristinę/dalfopristinę. Również bardzo wysoką skutecznością odznaczała się minocyklina i nitrofurantoina, odnotowano pojedyncze izolaty należące do gatunków

3 Nr 1 Wrażliwość na antybiotyki koagulazo-ujemnych gronkowców 17 S. hominis i S. xylosus oporne na te preparaty. Skutecznym antybiotykiem był kwas fusydowy, jedynie jeden izolat S. hominis i jeden S. xylosus były oporne na ten chemioterapeutyk. Oporność na rifampicynę wykazało 8% szczepów, 6 metycylino-opornych S. epidermidis i jeden S. xylosus. Zaobserwowano duże zróżnicowanie profili oporności na antybiotyki i chemioterapeutyki wśród szczepów gronkowców należących do jednego gatunku. Wszystkie szczepy S. epidermidis były oporne na co najmniej jeden lek przeciwdrobnoustrojowy, odnotowano 22 profile oporności na antybiotyki. Odsetek szczepów wielolekoopornych wynosił 70% dla S. epidermidis, 67% dla S. hominis i 58% dla S. haemolyticus. Wśród pozostałych gatunków jedynie 4% szczepów odznaczało się wielolekoopornością. Przeprowadzone badania wykazały, że 66% gronkowców koagulazo-ujemnych było opornych na metycylinę. Odnotowaliśmy zdecydowanie wyższy odsetek szczepów opornych na metycylinę wśród szczepów należących do gatunków dominujących w porównaniu z szczepami należącymi do gatunków rzadko izolowanych. Ponad połowa gronkowców koagulazo-ujemnych charakteryzowała się występowaniem mechanizmu oporności MLS B na makrolidy, linkozamidy i streptograminy B. U większości szczepów występował konstytutywny fenotyp oporności na MLS B. w tabeli i przedstawiono oporność na poszczególne antybiotyki i chemioterapeutyki szczepów należących do gatunków S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis oraz pozostałych gatunków gronkowców. Tabela I. Oporność na antybiotyki i chemioterapeutyki szczepów koagulazo-ujemnych Staphylococcus sp. Antybiotyki S. epidermidis (n = 46) S. hominis (n = 16) Odsetek (%) szczepów opornych S. haemoliticus (n = 12) S. capitis, S. xylosus, S. warnerii, S. chromogenes, S. saprophiticus, S. cohnii, S. equorum (n = 16) Penicylina Oksacylina Cefoksytyna Gentamycyna Tetracyklina Minocyklina Norfloksacyna Lewofloksacyna Erytromycyna Klindamycyna Sulfametoksazol + trimetoprim Kwas fusydowy Rifampicyna Nitrofurantoina

4 18 E. Szczuka i inni Nr 1 DYSKUSJA W niniejszej pracy oceniono częstość występowania poszczególnych gatunków gronkowców koagulazo-ujemnych w materiale klinicznym oraz zbadano ich zdolność wytwarzania zewnątrzkomórkowego polisacharydowego śluzu ogrywającego istotną rolę w tworzeniu biofilmu. Od wielu lat pojawiają się doniesienia dotyczące znacznych trudności w leczeniu zakażeń biofilmowych (4, 5, 7). Przeprowadzone badania wykazały, że prawie połowa szczepów gronkowców koagulazo-ujemnych wytwarzała polisacharydowy śluz. Zaobserwowano zróżnicowanie w produkcji śluzu przez szczepy w obrębie poszczególnych gatunków. Zdecydowana większość szczepów należących do gatunku S. epidermidis wytwarzała śluz, podczas gdy żaden z izolatów S. haemolyticus nie miał tej zdolności. Również de Silvia i wsp. (3) wskazali na brak zdolności wytwarzania polisacharydowego śluzu na agarze CRA przez szczepy należące do tego gatunku. Doniesienia naukowe wskazują, że wiele antybiotyków wykazuje ograniczoną zdolność przenikania przez śluz do głębszych warstw biofilmu (7). Ceri i wsp. (2) wykazali, że gentamicyna jest skuteczna w eradykacji biofilmu utworzonego przez szczep S. aureus ATCC W niniejszej pracy wykazano, że ponad jedna czwarta izolatów wykazuje oporność na gentamicynę i to w znacznej mierze ogranicza możliwość zastosowania tego antybiotyku w terapii. Zheng i Stewart (11) wykazali, że rifampicyna dzięki określonym właściwościom fizykochemicznym, jak wielkość i hydrofobowość cząsteczki, ma zdolność penetracji w biomasę biofilmu utworzonego przez szczep S. aureus ATCC Ponadto, antybiotyk ten powoduje dezintegrację śluzu otaczającego biofilm, działa na komórki bakteryjne będące w różnym stanie fizjologicznym oraz znajdujące się w głębszych warstwach biofilmu (10). Nasze badania wykazały, że odsetek szczepów opornych na rifampicynę jest niski. Należy jednak zaznaczyć, że tego antybiotyku nie powinno się stosować w monoterapii ze względu na szybko narastającą na niego oporność. Lekami bardzo efektywnymi w leczeniu zakażeń gronkowcowych są linezolid i wankomycyna. Oporność na te antybiotyki występuje niezwykle rzadko, wszystkie szczepy objęte naszymi badaniami były wrażliwe. Jednakże, wcześniej przeprowadzone badania wykazały, że wankomycyna i linezolid są mniej efektywne w eradykacji biofilmu (6, 8, 9). Saginur i współpracownicy (9) zaproponowali jednoczesne stosowanie dwóch lub trzech antybiotyków do eradykacji biofilmu gronkowcowego. Przeprowadzone badania na biofilmach utworzonych przez S. aureus i S. epidermidis wykazały, że taka metoda jest znacznie skuteczniejsza. Najczęstszymi antybiotykami występującymi w kombinacjach były: rifampicyna, wankomycyna, kwas fusydowy i ciprofloksacyna. Rzadziej stosowano w połączeniu z innymi antybiotykami gentamycynę i linezolid. E. Szczuka, J. Prawda-Zołotar, M. Nowakiewicz, A. Kaznowski Antimicrobial sensivity and ability to slime production of koagulaze-negative staphylococci SUMMARY The aim of this study was to assess the ability of slime production of coagulase-negative staphylococci (CoNS) and evaluate the susceptibility of bacteria to antibiotics. Strains were isolated from

5 Nr 1 Wrażliwość na antybiotyki koagulazo-ujemnych gronkowców 19 clinical specimens obtained from hospitalized patients. The most frequently isolated species were S. epidermidis (51%), S. hominis (18%), S. haemolyticus (13%). The result of this study shows that 61% of S.epidermidis produce slime on CRA (Congo red agar), whereas none of the tested S. haemolyticus strains has this ability. All examined strains were susceptible to vancomycin, linezolid and quinupristin/ dalfopristin. The majority of strains were susceptible to minocycline, fusid acid, nitrofurantoin and rifampicin. Sixty six percent of isolates were determined as methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci. PIŚMIENNICTWO 1. Arciola CR, Campoccia D, Gamberini S i inni. Detection of slime production by jeans o fan optimised Congo red agar plate test based on a colorimetric scale in Staphylococcus epidermidis clinical isolates genotyped for ica locus. Biomaterials 2002; 23: Ceri H, Olson ME, Stremick C i inni. The Calgary biofilm device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clin Microbiol 1999; 37: De Silvia GDI, Kantzanou M, Justice a i inni. The ica operon and biofilm production in coagulase- -negative staphylococci associated with carriage and disease in neonatal intensive care unit. J Clin Microbiol 2002; 40: Götz F. Staphylococcus and biofilms. Mol Microbiol 2002; 43: Götz F, Bannerman T, Schleifer K-H. The genera Staphylococcus and Micrococcus. W: The Prokaryotes. a Handbook on the biology of bacteria. Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria, Vol. 4 (Dworkin M, Falkow S., Rosenberg E, Schleifer K-H & Stackebrandt E. eds) Third edition. Springer Science+ Business Media LLC 2006, Jefferson KK, Goldmann DA, Pier GB. Use of confocal microscopy to analyze the rate of vancomycin penetration through Staphylococcus aureus biofilms. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: Mack D, Rohde H, Harris LG i inni. Biofilm formation in medical device-related infection. Int J Artif Organs 2006; 29: Raad I, Hanna H, Jiang Y i inni. Comparative activities of daptomycin, linezolid, and tigecycline against catheter-related methicilli-resistant Staphylococcus bacteremic isolates embedded in biofilm. Antimicrob Agents Chemother 2007; 51: Saginur R, Denis MS, Ferris i inni. Multiple combination bactericidal testing of staphylococcal biofilms from implant-associated infections. Antimicrob Agents Chemother 2006; 50: Toté K, Vanden Berghe D, Deschacht M i inni. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matriz and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int J Antimicrob Agentts 2009; 33: Zheng Z, Stewart PS. Penetration of rifampicin through Staphylococcus epidermidis biofilms. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: Żabicka D, Hryniewicz W. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki Oznaczenie ziarniaków gram-dodatnich z rodzaju Staphylococcus spp. Otrzymano: 4 I 2011 r. Adres Autora: Poznań, ul. Umultowska 89, Zakład Mikrobiologii, Instytut Biologii Eksperymentalnej, Wydział Biologii UAM w Poznaniu

6 KOMUNIKAT W SPRAWIE UZUPEŁNIENIA REGULAMINU PRZYGOTOWYWANIA ARTYKUŁÓW KIEROWANYCH DO PUBLIKACJI W KWARTALNIKU MEDYCYNA DOŚWIADCZALNA I MIRKOBIOLOGIA Autorem artykułu może być każda osoba, która wniosła istotny intelektualny wkład w zakresie: tematu, treści i wniosków pracy lub uzyskała i interpretowała eksperymentalne dane przedstawione w artykule. Osoby wykonujące oznaczenia laboratoryjne bez interpretacji ich wyników, dostarczające próbki materiału do badań, szczepy mikroorganizmów, odczynniki, aparaturę badawczą a także osoby, które dokonały krytycznej oceny tekstu pracy mogą być wymienione w podziękowaniach. Autorzy powinni wybrać spośród siebie jedną osobę odpowiedzialną za korespondencję z redakcją i upoważnić ją do reprezentowania ich we wszystkich sprawach związanych z publikacją. Autorzy artykułu powinni wyrazić zgodę na jego opublikowanie, co powinno być potwierdzone pisemnym oświadczeniem autora przesyłającego artykuł do redakcji czasopisma.