VIII. Diagnostyka mikrobiologiczna głównych drobnoustrojów odpowiedzialnych za zakażenia przewodu pokarmowego i zapalenie otrzewnej

Transkrypt

1 VIII. Diagnostyka mikrobiologiczna głównych drobnoustrojów odpowiedzialnych za zakażenia przewodu pokarmowego i zapalenie otrzewnej Pałeczki Gram-ujemne niefermentujące Ćwiczenie 1. Wykonanie i ocena preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama. Opis preparatu: Ćwiczenie 2. Ocena wzrostu szczepów na podłożach stałych: a. agar z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej (AK) Pseudomonas aeruginosa typ hemolizy Acinetobacter baumannii typ hemolizy

2 b. podłoże MacConkey a (MC) Pseudomonas aeruginosa.. Acinetobacter baumannii.. c. podłoże z cetrymidem (Cet) Pseudomonas aeruginosa.. Acinetobacter baumannii.

3 d. podłoże Kinga B Pseudomonas aeruginosa. Acinetobacter baumannii. e. agar zwykły (AZ) Pseudomonas aeruginosa.. Acinetobacter baumannii.

4 Ćwiczenie 3. Ocena zdolności wytwarzania barwników na podłożu płynnym i stałym. Większość szczepów wytwarza barwniki rozpuszczalne w wodzie i dyfundujące do podłoża: - fluoresceinę (piowertynę) barwnik żółto-zielony, fluoryzuje w świetle lampy UV przy długości fali 366 nm, - piocyjaninę barwnik zielony lub niebieski, - piorubrynę barwnik czerwony, - piomelaninę barwnik brązowy. Ocenić w promieniach lampy Wooda (366 nm) zdolność wytwarzania barwników przez szczepy Pseudomonas aeryginosa i Acinetobacter baumannii szczepy: 1. Pseudomonas aeruginosa 2. Acinetobacter baumannii a. bulion zwykły 1 2 b. agar zwykły 1 2

5 c. podłoże Kinga B 1 2 Ćwiczenie 4. Ocena zdolności wytwarzania oksydazy cytochromowej. Zasada metody: pasek impregnuje się odczynnikiem na oksydazę (tetrametyl-pfenylodiamina) i kwasem askorbinowym. Bakterie wytwarzające oksydazę, w obecności tlenu atmosferycznego i cytochromu c utleniają fenylodiaminę do indofenolu. Wykonanie: 1. Dwa paski bibuły filtracyjnej położyć na szkiełka podstawowe i nasączyć paroma kroplami odczynnika do wykrywania oksydazy. 2. Jałową ezą pobrać 1 kolonię szczepu Pseudomonas aeruginosa i rozprowadzić na pasku, następnie wyjałowić ezę i na drugi pasek pobrać szczep Acinetobacter baumannii. 3. Zaobserwować zmianę zabarwienia w czasie 0,5-2 minut. Szczep badany Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii obserwowane wyniki Wnioski:...

6 Ćwiczenie 5. Identyfikacja pałeczek niefermentujących z wykorzystaniem testu API 20 NE. Zasada metody: Test API 20 NE jest wystandaryzowanym zestawem do identyfikacji Gramujemnych, niejelitowych pałeczek o niewysokich wymaganiach odżywczych (np. Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Moraxella, Vibrio, Aeromonas itd.) będący połączeniem 8 testów konwencjonalnych 12 i testów asymilacyjnych (zmętnieniowych). Przygotować test zgodnie instrukcją producenta Po inkubacji dokonać odczytu wg załączonej instrukcji, a wyniki wpisać do karty odczytu.

7 Zinterpretować otrzymane wyniki zgodnie z książką kodową lub odczytem z APIweb.

8 Ćwiczenie 6. Interpretacja wyniku badania lekowrażliwości. Wykonanie odczytu: na podłożu Muellera-Hintona, odczytać średnicę zahamowania wzrostu wokół krążka z antybiotykiem, trzymając płytkę 5-8 cm nad czarną powierzchnią oświetloną z boku, z dokładnością do 1 mm, przykładając miarkę od tyłu. Wynik badania lekowrażliwości dla szczepu... Antybiotyk Strefa zahamowania wzrostu w mm Interpretacja wyniku Wnioski:

9 Clostridium difficile, Campylobacter i Helicobacter Ćwiczenie 7. Wykonanie i ocena preparatu mikroskopowego Clostridium difficile barwionego metodą Grama. Opis preparatu: Ćwiczenie 8. Wykrywanie Clostridium difficile w kale za pomocą testu CoproStrip C. difficile GDH + Toxin A + Toxin B. Zastosowanie: CoproStrip C. difficile GDH + Toxin A + Toxin B jest szybką metodą immunochromatograficzną (karta combo) do jednoczesnego jakościowego wykrywania dehydrogenazy glutaminianowej Clostridium difficile (GDH), toksyny A i toksyny B w kale, stosowaną w diagnostyce zakażeń wywołanych przez C. difficile. Przygotowanie próbki kału: Użyć oddzielną fiolkę z buforem do przygotowania każdej próbki kału. Odkręcić korek fiolki i wprowadzić szpatułką próbkę kału pobrać ok. 125 mg. Zamknąć fiolkę z buforowaną próbką stolca. Mieszać fiolkę przez 15 sekund w celu zapewnienia dobrej dyspersji próbki. W przypadku płynnych próbek kału, pobrać 125 µl próbki kroplomierzem lub pipetą automatyczną i dodać do fiolki z buforem. Instrukcja wykonania testu kasetkowego CoproStrip C. difficile GDH + Toxin A + Toxin B firmy Savyon Diagnostics Ltd.3 Habosem St. Ashdod ISRAEL Wykonanie testu: Wszystkie testy, próbki kału i bufor przed badaniem pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej (15-30ºC). Nie otwierać woreczka zanim test nie jest gotowy do wykonania. 1. Wyjąć test z zapieczętowanej torebki i używać go możliwie jak najszybciej. 2. Wstrząsnąć fiolką do pobierania próbek, aby zapewnić dobrą dyspersję próbki. Zerwać końcówkę fiolki. 3. Za pomocą oddzielnej końcówki (pipety) dla każdej próbki dokładnie odmierzyć 4 krople lub 100 μl próbki do każdej studzienki (tj. testy A, B i C). Uruchomić stoper. 4. Odczytać wyniki po 10 minutach od chwili wprowadzenia próbki na pole testowe.

10 Instrukcja wykonania testu kasetkowego CoproStrip C. difficile GDH + Toxin A + Toxin B firmy Savyon Diagnostics Ltd. 3 Habosem St. Ashdod ISRAEL Studzienki do nanoszenia próbki badanej Membrana testów A, B i C jest powleczona przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko antygenowi GDH Clostridium difficile (test A), przeciw antygenowi toksyny A Clostridium difficile (test B) i przeciw antygenowi toksyny B Clostridium difficile (test C) w linii regionu testowego. Podczas badania próbka przemieszcza się przez membranę i zawarte w próbce antygeny reagują z wybarwionymi na kolor czerwony przeciwciałami zawartymi w teście. W przypadku pozytywnego wyniku badania w obszarze oznaczonym literą T: w teście A specyficzne przeciwciała obecne na membranie reagują z antygenem GDH Clostridium difficile obecnym w kale i generują jedną linię o czerwonej barwie, w teście B specyficzne przeciwciała obecne na membranie reagują z antygenem toksyny A obecnym w kale i generują jedną linię o czerwonej barwie, w teście C specyficzne przeciwciała obecne na membranie reagują z antygenem toksyny B i generują jedną linię o czerwonej barwie. Kontrola jakości: Próbka przepływa przez membranę do przeciwciała unieruchomionego w regionie kontrolnym (obszar oznaczony literą C). Zielone linie pojawiające się w rejonie kontrolnym stanowią kontrolę wewnętrzną testu. Pojawienie się paska koloru zielonego w rejonie kontrolnym informuje o wprowadzeniu wystarczającej objętości próbki, uzyskaniu właściwego przepływu oraz stanowi wewnętrzną pozytywną kontrolę reagentów. Interpretacja wyników: Intensywność koloru czerwonego w regionie wyniku (obszar oznaczony literą T) zmienia się w zależności od stężenia antygenów w próbce. Pojawienie się czerwonej linii, niezależnie od jej intensywności, świadczy o dodatnim wyniku testu.

11 Tabela interpretacji wyników:

12 Ćwiczenie 9. Helicobacter pylori preparat z hodowli barwiony metoda Grama. Opis preparatu: Ćwiczenie 10. Wykonanie testu ureazowego z materiału biopsyjnego. Zasada metody: Enzymatyczny rozkład mocznika przez bakterie Helicobacter pylori powoduje powstanie NH 3 i CO 2 w podłożu Christensena. Powstający NH 3 alkalizuje podłoże i powoduje zmianę zabarwienia z żółtego na różowo-amarantowe. Wykonanie: Do podłoża zawierającego 2% mocznika dodać wycinek błony śluzowej żołądka. Całość inkubować w temperaturze 37ºC od 20 minut do 2 godzin. Odczytać wynik. Wnioski:..... O czym może świadczyć dodatni test ureazowy?....