Biosynteza cyklicznego GMP w komórkach roślinnych nowe informacje dotyczące cyklaz guanylanowych

Biosynteza cyklicznego GMP w komórkach roślinnych nowe informacje dotyczące cyklaz guanylanowych Brygida Świeżawska * Katarzyna Marciniak Adriana Szmidt-Jaworska Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Katedra Fizjologii Roślin i Biotechnologii, Toruń * Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Katedra Fizjologii Roślin i Biotechnologii, ul. Lwowska 1, 87-100 Toruń, tel. (56) 61 14 456; e mail: bswiezawska@umk.pl Artykuł otrzymano 10 lutego 2015 r. Artykuł zaakceptowano 25 marca 2015 r. Słowa kluczowe: cgmp, cyklaza guanylanowa, cykliczne nukleotydy Wykaz skrótów: camp cykliczny adenozyno-3,5 -monofosforan; cgmp cykliczny guanozyno-3,5 -monofosforan; CNGC kanały jonowe bramkowane cyklicznymi nukleotydami; GC cyklaza guanylanowa; NO tlenek azotu; PDE fosfodiesteraza; RNS reaktywne formy azotu; ROS reaktywne formy tlenu Podziękowanie: Praca powstała podczas realizacji grantu NCN NN 310 301839. STRESZCZENIE prezentowanej pracy podsumowano najnowsze doniesienia na temat roślinnych cyklaz guanylanowych (GC). Cyklazy nukleotydów purynowych to enzymy zaangażo- W wane w syntezę cyklicznego guanozyno -3,5 - monofosforanu (cgmp) z guanozyno-5 -trifosforanu (GTP). Jeszcze w latach 70-tych XX wieku obecność cyklicznych nukleotydów i enzymów zaangażowanych w ich metabolizm w komórkach roślinnych budziła kontrowersje. U roślin jako pierwsze poznano GC zlokalizowane w cytosolu, ale kilka lat temu zidentyfikowano nową rodzinę białek błonowych charakteryzujących się aktywnością cyklaz guanylanowych. Białka te należą do klasy transbłonowych receptorów LRR-RLK (ang. Leucine Rich Repeats Receptor Like Kinases) posiadających zewnątrzkomórkową domenę bogatą w powtórzenia leucynowe, domenę transbłonową oraz wewnątrzkomórkową domenę kinazową. W obrębie domeny kinazowej tych białek zidentyfikowano region charakterystyczny dla cyklaz guanylanowych. Jest to sytuacja niespotykana w zwierzęcych błonowych GC, w których to dwa funkcjonalnie zróżnicowane regiony są przestrzennie rozdzielone. WPROWADZENIE Wzrost oraz rozwój roślin jest ściśle uzależniony od warunków środowiskowych, zatem prawidłowy odbiór bodźców oraz przekazywanie sygnału w obrębie komórki, bądź pomiędzy sąsiadującymi komórkami decyduje o przetrwaniu organizmu roślinnego. Zdolność do odbierania przez komórkę sygnałów uzależniona jest od obecności na jej powierzchni odpowiednich receptorów ulegających aktywacji po związaniu z ligandem, co powoduje uruchomienie kolejnych elementów kaskady sygnałowej. Do receptorów roślinnych zaliczane są między innymi kinazy histydynowe i serynowo-treoninowe (RLK), receptory związane z białkami G oraz kanały jonowe [1,2]. W sygnalizację komórkową roślin zaangażowane są zarówno przekaźniki sygnałów o prostej budowie, takie jak tlenek azotu (NO), jony wapnia (Ca 2+ ), reaktywne formy tlenu (ROS), pochodne fosfoinozytoli, cykliczne monofosforany nukleotydów (camp, cgmp), fitohormony oraz o strukturze skomplikowanej, takie jak kinazy białkowe. Ostatecznym efektem pobudzenia danego szlaku przekazywania sygnału jest najczęściej zmiana przepuszczalności kanałów jonowych, aktywacja czynników transkrypcyjnych, reorganizacja cytoszkieletu oraz indukcja ekspresji genów odpowiedzi na czynniki stresowe [2]. Mimo, że dowody wskazujące na udział cyklicznych nukleotydów w procesach zachodzących w komórkach roślinnych nie budzą już kontrowersji, to charakterystyka enzymów odpowiedzialnych za ich metabolizm nie została w pełni przeprowadzona. Jeszcze w latach 70-tych XX wieku uznawano, że cgmp nie występuje w komórkach roślinnych, co spowodowane było brakiem precyzyjnych, wysoko czułych metod pomiarowych. Najnowsze techniki pozwalają na określanie niezwykle niskiego stężenia cyklicznych nukleotydów wyrażanego w jednostce 10-15 mola (fmol) [3]. Jednocześnie, zarówno wyniki badań pośrednich, jak i bezpośrednich wskazują na obecność w komórkach roślinnych cyklaz guanylanowych (GC, ang. Guanylyl Cyclases) oraz fosfodiesteraz cyklicznych nukleotydów (PDE, ang. Phosphodiesterases), czyli enzymów odpowiedzialnych odpowiednio za syntezę i hydrolizę cyklicznego guanozyno-3,5 - monofosforanu (cgmp). Wyniki analiz dotyczących roślinnych cyklaz nukleotydów purynowych, które ukazały się do 2010 roku przedstawiono w pracy przeglądowej [4]. Jednak od tego czasu nastąpił dynamiczny rozwój badań w tej dziedzinie. Pojawiły się doniesienia na temat nowej grupy białek o aktywności cyklaz guanylanowych charakteryzujących się odmienną budową od dotychczas poznanych GC. Stąd w pracy podsumowano aktualną wiedzę o tych roślinnych enzymach. 168 www.postepybiochemii.pl

ROLA CGMP W KOMÓRKACH ROŚLINNYCH Udział cyklicznego GMP w procesach wzrostu i rozwoju roślin jest obecnie bezsporny. Potwierdzono jego zaangażowanie w szlak przekazywania sygnału świetlnego, gospodarkę jonową, sygnalizację hormonalną oraz odpowiedź roślin na czynniki stresowe [3]. Na podstawie badań transkryptomu wykazano, że bierze on udział w regulacji przepływu jonów jednowartościowych, takich jak K + czy Na + w komórkach korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana). W przypadku potraktowania korzeni roztworem niehydrolizującego analogu cgmp przenikającego przez błony (8-Br-cGMP) obserwowano wzrost aktywności transkrypcyjnej genów kodujących nieselektywne kanały jonowe i antyportery kation/ proton, co sugeruje udział tego wtórnego przekaźnika w regulacji gospodarki jonowej [3,5]. Pierwsze dowody wskazujące na uczestnictwo cgmp w sygnalizacji hormonalnej u roślin pochodzą z 1996 roku, kiedy to przeprowadzono doświadczenia mające na celu stwierdzenie udziału i współdziałania cgmp z giberelinami (GA) w syntezie oraz aktywacji enzymu a-amylazy w warstwie aleuronowej ziarniaków jęczmienia zwyczajnego (Hordeum vulgare) [6]. Inkubacja ziarniaków w kwasie giberelinowym (GA3) wywoływała wzrost stężenia cgmp, a następnie aktywację a-amylazy niezbędnej do ich kiełkowania. Odmienne reakcje obserwowano po podaniu inhibitora GC (LY 83583). Analogiczne obserwacje poczyniono wykonując doświadczenia na nasionach rzodkiewnika. Wykazano, że zarówno 8-Br-cGMP, jak i inhibitor fosfodiesteraz (Tadalafil) stymulują kiełkowanie, natomiast zastosowanie inhibitora GC prowadzi do zahamowania tego procesu [7]. Mechanizmy leżące u podstaw współdziałania GA z cgmp nie zostały do chwili obecnej poznane. Cykliczny GMP jest zaangażowany również w szlaki sygnałowe innych fitohormonów kwasu abscysynowego (ABA), kwasu indolilo-3-octowego (IAA) i indolilio-3-masłowego (IBA) oraz kwasu jasmonowego (JA). Wykazano, że cgmp nie tylko bierze udział w indukowanym przez ABA zamykaniu aparatów szparkowych, lecz także jest cząsteczką niezbędną do zainicjowania tego procesu. Wydaje się, że cgmp jest przekaźnikiem informacji występującym w szlaku sygnałowym poniżej nadtlenku wodoru (H 2 O 2 ) oraz NO, lecz powyżej jonów Ca 2+. W następstwie wzrostu stężenia H 2 O 2 oraz NO w komórce dochodzi do szybkiego podniesienia stężenia cgmp, a następnie wzrostu ilości wolnych jonów Ca 2+, co powoduje spadek zawartości jonów K + oraz Cl - w komórkach szparkowych i zamknięcie szparki [8]. Inne badania, z wykorzystaniem spektrometrii oraz immunocytochemii, wskazują na aktywację syntezy 8-nitro-cGMP w komórkach szparkowych rzodkiewnika pod wpływem NO oraz ABA w obecności ROS. Wykazano, że 8-nitro-cGMP powoduje zamknięcie aparatu szparkowego w dzień, podczas gdy podany egzogennie analog cgmp (8-Br-cGMP) nie wywołuje takiej reakcji. Zupełnie odmienną sytuację obserwowano w ciemności, kiedy to 8-Br-cGMP indukował otwarcie szparki, natomiast 8-nitro-cGMP był nieaktywny. Wnioskuje się zatem, że cgmp oraz jego niehydrolizujące analogi mogą pełnić odmienne role w mechanizmie zamykania i otwierania aparatów szparkowych, w zależności od zaistniałych warunków. Hipotetyczny model działania 8-nitro-cGMP zakłada, że pod wpływem ABA, JA, promieniowania UV oraz ataku patogenów wzrasta stężenie ROS i NO w komórkach roślinnych. Cząsteczka NO aktywuje cytosolową cyklazę guanylanową (AtNOGC1), która katalizuje reakcję konwersji GTP do cgmp. ROS wchodzą w reakcję z NO tworząc reaktywne formy azotu (RNS), które w połączeniu z cgmp tworzą nitrową pochodną 8-nitro-cGMP. Cząsteczka ta następnie wpływa na wzrost stężenia jonów Ca 2+ aktywujących kanały jonowe np. SAC1 (ang. Slow Anion Channel1), co ostatecznie powoduje zamknięcie aparatu szparkowego. W ciemności, fitohormony takie jak cytokininy czy auksyny powodują obniżenie stężenia ROS oraz NO, a cyklazy guanylanowe o charakterze błonowym syntetyzują cgmp, który w przypadku braku NO nie ulega przekształceniu do 8-NO-cGMP, odpowiadając za otwarcie aparatu szparkowego. Zatem wydaje się, że czynnikiem decydującym o inicjacji zamknięcia bądź otwarcia szparek jest proces nitrowania cgmp [9]. Najnowsze doniesienia potwierdzają wyniki wcześniejszych doświadczeń wskazując jednocześnie na udział cgmp w szlaku sygnałowym auksyn. Badania sprzed kilku lat wykazały, że indukowane przez IBA otwieranie aparatów szparkowych u komeliny zwyczajnej (Commelina communis) i rzodkiewnika pospolitego jest uzależnione od obecności cgmp [10,11]. Ponadto współdziałanie auksyn, NO i cgmp odnotowano w reakcji grawitropicznej w korzeniach soi (Glycine max) i procesie ukorzeniania ogórka siewnego (Cucumis sativus), jednak mechanizm molekularny powyższych oddziaływań pozostaje nieznany [12,13]. Istnieją hipotezy, że IAA powoduje wzrost stężenia cgmp w korzeniach rzodkiewnika na skutek aktywacji GC. Aplikacja 8-Br-cGMP przyspiesza zależny od IAA proces powstawania korzeni, natomiast podanie inhibitorów cyklaz guanylanowych wywołuje przeciwny efekt. W zaproponowanym mechanizmie działania cgmp w szlaku sygnałowym IAA szczególną rolę przypisuje się kinazie zależnej od cgmp (PKG, ang. cgmp- -dependent Protein Kinase). Autorzy sugerują, że wysokie stężenie cgmp powstałe na skutek aktywacji GC przez IAA wpływa na podwyższenie aktywności kinazy PKG. Białko to następnie wpływa na ligazę ubikwityny SCF TIR1, będącą kompleksem odpowiedzialnym za proteolityczną degradację białek AUX/IAA (ang. Auxin/Indole-3-Acetic Acid) w szlaku przekazywania sygnału auksynowego. Białka AUX/IAA oddziałując z czynnikami transkrypcyjnymi ARF (ang. Auxin Response Factors) hamują aktywność transkrypcyjną pierwotnych genów odpowiedzi na auksyny. Zatem ich proteolityczna degradacja umożliwia aktywację ekspresji genów zależnych od IAA, w tym tych związanych z organogenezą [14]. Niedawno podjęto próbę usystematyzowania wiedzy dotyczącej udziału cgmp w sygnalizacji wybranych fitohormonów. Doświadczenia przeprowadzone na protoplastach korzenia rzodkiewnika traktowanych roztworami poszczególnych fitohormonów dostarczyły dowodów na zaangażowanie cgmp w szlaki przekazywania sygnału większości z nich. Potwierdzono wcześniejsze spostrzeżenia wskazujące na współdziałanie cgmp z sygnalizacją ABA oraz GA. Dodatkowo odnotowano wzrost stężenia cyklicznego GMP w protoplastach w odpowiedzi na JA. W przypadku aplikacji kinetyny oraz brassinosteroidów nie zanotowano zmian stężenia endogennego cgmp, co może oznaczać, że droga sygnalizacji tych związków przebiega z pominięciem cyklicznych Postępy Biochemii 61 (2) 2015 169

nukleotydów. Szczególnie zaskakujący jest brak wzrostu zawartości cgmp w komórkach po podaniu brassinosteroidów, gdyż wcześniejsze doniesienie wskazuje, że receptor tego fitohormonu wykazuje aktywność GC [15], co w konsekwencji powinno powodować syntezę zwiększonej ilości cgmp [16]. Już pod koniec lat 80-tych XX wieku sugerowano udział cgmp w procesach zależnych od światła, w tym także w fotoperiodycznej indukcji kwitnienia. Wykazano, że cykliczny GMP działa na szlaku fitochromowym, a aplikacja cgmp uniezależnia rośliny od indukcyjnego fotoperiodu. Zagadnienie to zostało szczegółowo przeanalizowane zarówno w polsko-, jak i anglojęzycznych pracach przeglądowych [3,17]. Cząsteczce cgmp przypisuje się niezwykle istotną rolę w odpowiedzi roślin na abiotyczne oraz biotyczne czynniki stresowe. Pierwsze doniesienie o bezpośrednim udziale cyklicznego GMP w odpowiedzi roślin na stres osmotyczny pojawiło się w 2001 roku i dotyczyło korzeni rzodkiewnika poddanych działaniu chlorku sodu. Aplikacja cgmp wywoływała zmianę przepuszczalności kanałów błonowych VIC (ang. Voltage Independent Channels) względem jonów Na +, co powodowało zmniejszenie akumulacji tych jonów w komórce w warunkach stresu solnego. Analog cgmp (8-bromo-cGMP) powodował gwałtowny, ok. 40% spadek napływu jonów Na + do wnętrza komórek oraz wzrost tolerancji siewek rzodkiewnika na zasolenie [18]. Inne badania ujawniły, że do znaczącego wzrostu stężenia cgmp w komórkach rzodkiewnika dochodzi już po 5-ciu sekundach od zadziałania czynników wywołujących stres, którymi były NaCl i sorbitol. Autorzy sugerują, że cykliczny GMP działa w szlaku sygnałowym powyżej jonów wapnia, wpływając zarazem na akumulację Ca 2+ prawdopodobnie poprzez aktywację kanałów CNGC (ang. Cyclic Nucleotide Gated Channel ) [19]. Wobec powyższego, wydaje się, że cząsteczka cgmp jest jednym z podstawowych strażników homeostazy wodnej oraz jonowej w komórkach roślinnych. Potwierdzeniem tego są dane z analiz transkryptomu rzodkiewnika, które wykazały, że podanie egzogennego analogu cgmp aktywuje ekspresję genów kodujących białka zaangażowane w transport jonów jednowartościowych, H + -ATPazy lub antyportery kationowo-protonowe [3,18,19]. Czynnikiem prowadzącym do wzrostu stężenia cgmp w komórkach liści tytoniu szlachetnego (Nicotiana tabacum) jest także ozon (O 3 ) oraz związany z nim stres oksydacyjny. Podwyższenie stężenia cyklicznego nukleotydu ma miejsce dwie godziny po wystawieniu roślin na działanie O 3. Także, wzrost aktywności transkrypcyjnej genów PR1 (ang. Pathogenesis-related1) na późnym etapie obrony rośliny jest silnie uzależniony od wysokiej zawartości cgmp w komórce [20]. Wydaje się więc, że cykliczny GMP włącza się w późniejszych etapach odpowiedzi na czynnik wywołujący stres. W ostatnich latach szeroko dyskutowana jest rola cyklicznego GMP w reakcjach obronnych roślin na stres biotyczny. Wykazano, że stężenie cgmp w komórkach rzodkiewnika wzrasta szybciej oraz uzyskuje wyższe wartości po zakażeniu komórek awirulentnym szczepem Pseudomonas syringae (AvirB) w stosunku do roślin zakażonych szczepem o silnej wirulencji (DC3000). Szybka odpowiedź rośliny na szczep awirulentny wynika z natychmiastowej percepcji elicytora polegającej na specyficznym oddziaływaniu pomiędzy genami odporności R (ang. resistance) rośliny oraz genami awirulencji Avr (ang. avirulent) bakterii. Rozpoznanie patogenu wywołuje szybką reakcję ze strony rośliny obejmującą syntezę ROS, NO, JA, SA czy etylenu. Jednym z elementów odpowiedzi rośliny jest również powstawanie cgmp. W sytuacji zakażenia wirulentnym szczepem DC3000 komórki rzodkiewnika z opóźnieniem identyfikowały zagrożenie, co umożliwiło bakteriom rozprzestrzenienie się w obrębie tkanek roślinnych [21]. Wyniki te korespondowały z uzyskanymi wcześniej obserwacjami, które przypisują cząsteczce cgmp dużą rolę w procesie programowanej śmierci komórki (PCD, ang. Programmed Cell Death). Krokiem milowym, w kontekście udziału cgmp w reakcji roślin na stres biotyczny było odkrycie transbłonowych receptorów z rodziny LRR-RLK, charakteryzujących się aktywnością cyklaz guanylanowych odpowiedzialnych za proces percepcji różnych białek pochodzenia patogennego. Szczególną rolę w reakcji obronnej rośliny przypisuje się białkom AtPepR1 oraz WAKL-10 zidentyfikowanym u rzodkiewnika, których budowa oraz funkcja została szczegółowo omówiona w kolejnym rozdziale. BIOSYNTEZA cgmp U ROŚLIN CYKLAZY GUANYLANOWE Za syntezę cgmp odpowiedzialne są cyklazy guanylanowe, natomiast jego inaktywacja zachodzi przy udziale fosfodiesteraz cyklicznych nukleotydów. W obecnej chwili przeważająca ilość danych na temat budowy, roli oraz mechanizmu działania dotyczy zwierzęcych GC. Wiedza ta w przypadku komórek prokariotycznych i roślinnych jest znacznie uboższa. Jednakże już te nieliczne prace wskazują na znaczne rozbieżności w budowie oraz funkcjonowaniu tej klasy enzymów u roślin i zwierząt. ROŚLINNE ROZPUSZCZALNE CYKLAZY GUANYLANOWE Aktywność cyklaz guanylanowych została odnotowana we frakcji cytosolowej wielu tkanek zwierzęcych już w połowie lat 70-tych XX wieku. Wykazano, że zwierzęce rozpuszczalne GC (sgc) mają postać heterodimeru zbudowanego z dwóch podjednostek: a i β, których dimeryzacja jest warunkiem koniecznym do uzyskania przez enzym aktywności. W strukturze zwierzęcych GC wyróżnia się trzy funkcjonalne domeny. Na końcu aminowym polipeptydu znajduje się domena regulatorowa z prostetyczną grupą hemową (HD, ang. heme domain), następnie domena dimeryzacyjna (DD, ang. dimerization domain) oraz znajdująca się na końcu karboksylowym domena katalityczna (CD, ang. catalytic domain). Cyklazy guanylanowe z komórek zwierzęcych należą do rodziny białek H-NOX (ang. Heme-Nitric oxide and OXygen binding family) ze wspomnianą powyżej charakterystyczną, zachowaną w ewolucji grupą hemową. Region ten niezbędny jest do aktywacji sgc przez cząsteczkę NO. W następstwie związania NO z grupą hemową dochodzi do rozluźnienia wiązania grupy prostetycznej z podjednostką β i zmiany konformacji enzymu, co powoduje jego aktywację. Proces dezaktywacji polega na oddysocjowaniu cząsteczki NO od regionu hemowego. Drugim stymulatorem aktywności zwierzęcych sgc jest tlenek węgla (CO), 170 www.postepybiochemii.pl

który również przyłącza się do grupy hemowej w domenie regulatorowej enzymu. Wykazano, że aktywność enzymatyczna oczyszczonej, rozpuszczalnej GC jest 100-200- krotnie wyższa w obecności NO, a jedynie 4-krotnie wyższa po podaniu CO, co dowodzi, że tlenek węgla jest znacznie słabszym aktywatorem aniżeli tlenek azotu [22]. Zwierzęce enzymy GC wymagają do aktywacji jonów Mn 2+ lub Mg 2+. Z kolei zupełnie odmienny wpływ na ich regulację mają jony Ca 2+, gdyż cgmp oraz wapń działają antagonistycznie w wielu procesach fizjologicznych. Przykładowo, skurcz mięśni gładkich powodowany jest wzrostem stężenia jonów Ca 2+ w komórce, natomiast rozkurcz wzrostem stężenia cgmp. Na podstawie uzyskanych wyników można przypuszczać, że mechanizm działania cząsteczek cgmp oraz Ca 2+ w komórkach zwierzęcych odbywa się na zasadzie sprzężenia zwrotnego [22]. Analizy bioinformatyczne przeprowadzone podczas minionej dekady znacząco wzbogaciły zasób wiedzy na temat roślinnych cyklaz nukleotydów purynowych. W oparciu o dotychczas poznane sekwencje GC z cyjanobakterii oraz kilku niższych i wyższych organizmów eukariotycznych wyznaczono złożony z 14 reszt aminokwasowych, zachowany w ewolucji, region potencjalnego centrum aktywnego domeny katalitycznej. Analiza genomu rzodkiewnika pozwoliła na zidentyfikowanie siedmiu genów kodujących białka o przypuszczalnej aktywności cyklazy guanylanowej. Jedynie jedno z powstających na bazie tych genów białek charakteryzowało się obecnością motywu bogatego w reszty glicyny na końcu aminowym i zostało wykorzystane do badań funkcjonalnych. Analizy te pozwoliły na zidentyfikowanie oraz scharakteryzowanie pierwszej roślinnej cyklazy guanylanowej AtGC1 (sekwencję AtGC1 zdeponowano w banku genów pod numerem At5g05930). Wykazano, że enzym AtGC1 zbudowany jest z 274 reszt aminokwasowych i jako białko fuzyjne GST-GC ma masę cząsteczkową 57 kda, a do swojej aktywności wymaga jonów Mg 2+. W domenie katalitycznej zlokalizowanej na aminowym końcu polipeptydu znajdują się wszystkie charakterystyczne reszty aminokwasowe warunkujące specyficzność reakcji. Analiza specyficzności enzymu wykazała, że przejawia on znacznie wyższe powinowactwo względem GTP aniżeli ATP. Ponadto wydaje się, że białko AtGC1 ma charakter cytosolowy, gdyż w obrębie sekwencji nie zidentyfikowano motywu skierowującego do błon ani żadnej z domen charakterystycznych dla zwierzęcych sgc, czyli domeny wiążącej ligandy, domeny dimeryzacyjnej i domeny wykazującej homologię do kinaz białkowych [23]. Enzym AtGC1 znacząco różni się budową od znanych cyklaz zwierzęcych zarówno o charakterze błonowym, jak i cytosolowym. Pierwszą cechą różnicującą jest obecność domeny katalitycznej na końcu aminowym, a nie karboksylowym polipeptydu. Ponadto w roślinnej cyklazie guanylanowej nie zidentyfikowano sekwencji wiążącej hem oraz NO, a sam enzym jest aktywny w formie monomeru, a nie homo- czy heterodimeru jak zwierzęce GC [23]. Jest to tym bardziej zaskakujące w świetle wiedzy, że aktywność formy monomerycznej zaobserwowano jedynie u ameby Dictyostellium discoideum (DdsGC) oraz zawisaka tytoniowego Manduca sexta (MsGC-β3) [24,25]. W 2008 roku scharakteryzowano homolog genu AtGC1 w komórkach kukurydzy zwyczajnej (Zea mays), ZmGC1, a w 2009 roku z wilca wielkokwiatowego (Pharbitis nil), PnGC1 [26,27]. W przypadku ZmGC1 podobieństwo do izoformy z rzodkiewnika jest uderzające. Cechami wspólnymi są między innymi liczba oraz wielkość intronów oraz eksonów, brak typowej kasety TATA-box powyżej 5 końca obu genów, obecność zachowanej w ewolucji domeny katalitycznej na końcu aminowym białek, domena bogata w powtórzenia reszt glicynowych oraz brak domeny dimeryzacyjnej i wiążącej NO. Jednak sekwencja aminokwasowa domeny katalitycznej enzymu ZmGC1 jest o 9 reszt aminokwasowych krótsza od swojego homologa z rzodkiewnika. Oba białka wykazują pewne podobieństwo do cyklazy Cya2 z cyjanobakterii Synechocystis PCC6803, co może sugerować ich pochodzenie od wspólnego przodka [26]. Białko PnGC1 o aktywności cyklazy guanylanowej zidentyfikowane u wilca wielkokwiatowego wykazuje również znaczącą homologię do AtGC1 oraz ZmGC1 wynoszącą odpowiednio 79 i 70%. Podobnie jak u powyżej opisanych enzymów PnGC1 nie posiada domeny dimeryzacyjnej, transbłonowej, kinazowej ani wiążącej NO, a domena katalityczna ze wszystkimi charakterystycznymi resztami aminokwasowymi znajduje się na N-końcu polipeptydu. W obrębie sekwencji aminokwasowej PnGC1 zidentyfikowano miejsce N-mirystoilacji, które może być zaangażowane w proces odwracalnego wiązania białka do błon plazmatycznych oraz oddziaływań typu białko-białko [27]. Mimo licznych dowodów potwierdzających współdziałanie szlaków sygnałowych cgmp oraz NO u roślin, przez wiele lat nie udało się określić punktu wspólnego obu szlaków. Dopiero w 2011 roku pojawiło się doniesienie o zidentyfikowaniu w genomie rzodkiewnika cyklazy guanylanowej zależnej od NO, nazwanej AtNOGC1 [28]. Wykorzystując analizy bioinformatyczne znaleziono jedną sekwencję aminokwasową u rzodkiewnika charakteryzującą się zarówno występowaniem 14-stu określonych reszt aminokwasowych odpowiedzialnych za specyficzność względem cgmp, jak i zachowaną w ewolucji domenę H-NOX wiążącą cząsteczkę NO. Scharakteryzowana sekwencja, zdeponowana w banku genów NCBI pod numerem At1g62580, należy do klasy monooksygenaz flawinowych. Badania elektrochemiczne wykazały, że domena H-NOX jest wspólnym miejscem wiązania zarówno dla cząsteczek O 2, jak i NO, jednak ze znacznie większym powinowactwem względem NO. Białko rekombinowane AtNOGC1 w warunkach in vitro przeprowadzało konwersję GTP do cgmp w obecności jonów Mn 2+, a dodanie NO do mieszaniny reakcyjnej skutkowało podwyższeniem aktywności enzymatycznej białka. Opisane powyżej cytosolowe cyklazy guanylanowe zaangażowane są w wybrane procesy fizjologiczne roślin. Wykazano, że GC z rzodkiewnika oraz kukurydzy są elementami kaskady zdarzeń uruchamianej na skutek działania biotycznych bodźców stresowych. Enzymowi AtGC1 przypisuje się udział w odpowiedzi rzodkiewnika na infekcję bakterią Pseudomonas syringae, natomiast białko ZmGC1 bierze udział w nabywaniu Postępy Biochemii 61 (2) 2015 171

odporności kukurydzy na zakażenie grzybem Fusarium graminearum [29,26]. Cyklaza guanylanowa zidentyfikowana w komórkach wilca wielkokwiatowego bierze natomiast udział w fotoperiodycznej kontroli procesu kwitnienia [27]. ROŚLINNE BŁONOWE CYKLAZY GUANYLANOWE Zwierzęce błonowe cyklazy guanylanowe (pgc ang. particulate guanylyl cyclase) charakteryzują się zróżnicowaną lokalizacją tkankową i ze względu na to kryterium wyróżnia się 7 izoform, które oznaczono GC-A GC-G [22]. Uważa się, że pgc w komórkach zwierzęcych pełnią funkcję receptorów. Ze względu na właściwości przyłączanego liganda cyklazy te podzielono na trzy typy: receptory peptydów natriuretycznych, receptory peptydów jelitowych oraz receptory wiążące ligandy o nieznanym charakterze. W budowie tych białek wyróżnia się zewnątrzkomórkową domenę odpowiedzialną za rozpoznawanie i przyłączanie ligandów, domenę transbłonową oraz domenę wewnątrzkomórkową podzieloną na trzy strukturalnie oraz funkcjonalnie zróżnicowane regiony. Pierwszy z nich to domena wykazująca homologię do kinaz białkowych, drugi to region dimeryzacyjny odpowiedzialny za dimeryzację podjednostek katalitycznych, która jest warunkiem aktywacji enzymu oraz leżąca za nim domena katalityczna, będąca najsilniej zachowaną w ewolucji sekwencją w obrębie polipeptydu pgc [22]. Najnowsze badania poruszające problematykę roślinnych cyklaz guanylanowych skupiają się głównie na identyfikacji nowej rodziny białek błonowych o aktywności GC. Pierwszym białkiem zakotwiczonym w błonie zdolnym do konwersji GTP do cgmp był zidentyfikowany w 2007 roku u rzodkiewnika receptor brassinosteroidów BRI1 (ang. Brassinosteroid Insensitive 1) [15]. Wykorzystanie analiz bioinformatycznych umożliwiło w następnych latach identyfikację kolejnych potencjalnych błonowych GC charakteryzujących się występowaniem zachowanego w ewolucji, zbudowanego z 14 reszt aminokwasowych, centrum aktywnego oraz specyficzną budową domenową. Poza receptorem BRI1 wśród tych białek wyróżnia się: receptor peptydów patogennych (PepR1, ang. Pathogen Peptide Receptor 1) [30], receptor WAKL-10 (ang. Wall-Associated Kinase-Like 10) [31] oraz receptor fitosulfokin (PSKR1, ang. Phytosulfokine Receptor 1) [32]. Najnowsze doniesienia wskazują na istnienie u rzodkiewnika ponad czterdziestu podobnych białek o charakterystycznej budowie domenowej oraz potencjalnej aktywności enzymatycznej GC [33]. Wątpliwości budzi jednakże fakt, że powyższe dane oparte są w większości przypadków jedynie o analizy bioinformatyczne, a funkcjonowanie żadnej z czterdziestu sekwencji aminokwasowych nie zostało jak dotąd potwierdzone eksperymentalnie. Do tej pory zweryfikowano doświadczalnie aktywność czterech wymienionych powyżej receptorów o podwójnej aktywności kinazy oraz cyklazy guanylanowej. Wszystkie one należą do klasy transbłonowych receptorów LRR- -RLK (ang. Leucine Rich Repeats Receptor Like Kinases), które posiadają zewnątrzkomórkową domenę bogatą w powtórzenia leucynowe odpowiedzialne za oddziaływania z peptydami na aminowym końcu, domenę transbłonową oraz wewnątrzkomórkową domenę kinazową na karboksylowym końcu (Ryc. 1). Niezwykle interesujący okazał się fakt obecności domeny charakterystycznej dla cyklaz guanylanowych w obrębie wewnątrzkomórkowej domeny kinazowej badanego receptora. Jest to sytuacja niespotykana wśród zwierzęcych pgc. Niezwykle istotnym etapem w poszukiwaniu nowych cyklaz guanylanowych jest przeszukiwanie baz danych pod kątem obecności zachowanego w ewolucji centrum katalitycznego zbudowanego z 14 reszt aminokwasowych pełniących ściśle określone funkcje. Charakterystyczny motyw [SK] [FY] [SGC] [ILV] [GFVIL] [LDVI] [GDLAVI] [IPEVL] [DLVI] [TVLI] [WST] [PDRG] [GKE] [KR] x {2,3} [HDSE] obecny jest we wszystkich cyklazach guanylanowych zidentyfikowanych do tej pory u rzodkiewnika. Reszty seryny [S] lub lizyny [K] zlokalizowane jako pierwszy aminokwas biorą udział w tworzeniu wiązania wodorowego z resztą guaniny, reszty seryny [S], glicyny [G] lub cysteiny [C] zidentyfikowane na trzeciej pozycji odpowiadają za specyficzność substratową względem GTP, natomiast reszty lizyny [K] lub argininy [R] na pozycji czternastej stabilizują stan konwersji GTP do cgmp. Reszty zlokalizowane dwa bądź trzy miejsca za 14-to aminokwasowym motywem [H,D,S,E] biorą udział w wiązaniu jonów Mn 2+ lub Mg 2+ niezbędnych do aktywności enzymatycznej cyklaz [33] (Ryc. 2). W 2007 roku Kwezi i wsp. posiłkując się analizami bioinformatycznymi określili domenową budowę receptora brassinosteroidów BRI1 u rzodkiewnika [15]. W budowie receptora AtBRI1 domena charakterystyczna dla GC zawiera się w obrębie domeny kinazowej, tworząc jeden region o podwójnej aktywności cyklazowo-kinazowej. Potwierdzono także obecność 14 reszt aminokwasowych budujących centrum aktywne odpowiedzialne za konwersję GTP do cgmp. Doświadczenia z wykorzystaniem techniki immunoenzymatycznej oraz spektrometrii masowej wykazały, że białko BRI1 wykazuje specyficzność substratową względem GTP w obecności jonów Mg 2+. Autorzy pracy sugerują, że cgmp może być wtórnym przekaźnikiem sygnału w wielu reakcjach zależnych od brassinosteroidów. Wykazano, że wiele genów indukowanych pod wpływem działania BR podlega również ekspresji w obecności wysokiego stężenia cyklicznego GMP [15]. Wyniki te nie znalazły jednak potwierdzenia w badaniach fizjologicznych, gdyż w protoplastach korzenia rzodkiewnika traktowanych roztworami brassinosteroidów nie obserwowano zmian endogennego stężenia cgmp [16]. Kolejnym białkiem o prawdopodobnej aktywności cyklazowej u rzodkiewnika jest receptor fitosulfokin PSKR1, który także należy do rodziny białek LRR-RLK. Fitosulfokiny są pentapeptydami, które w swojej strukturze zawierają sulfonowaną resztę tyrozyny i odpowiadają za stymulację różnicowania oraz wzrostu komórek, embriogenezę somatyczną i tworzenie korzeni przybyszowych. Peptydy te działają poprzez receptory PSKR1 znajdujące się w błonach komórkowych. Wykazano, że budowa receptora fitosulfokin jest identyczna jak w przypadku receptora BRI1 i charakteryzuje się występowaniem domeny o podwójnej funkcji: kinazy serynowo-treoninowej oraz cyklazy guanylanowej. Domena kinazowa (cytoplazmatyczna) białka AtP- SKR1 wykazuje aktywność kinazy serynowo-treoninowej w warunkach in vitro w obecności substratu peptydu 1 Ser/ Thr. Dowiedziono jednocześnie, że ta sama domena ma ak- 172 www.postepybiochemii.pl

Rycina 1. Schemat przedstawiający domenową budowę błonowych cyklaz guanylanowych u zwierząt (A) oraz roślin (B). tywność GC przeprowadzając reakcję syntezy cgmp z GTP w warunkach in vivo. Ponadto, protoplasty wyizolowane z komórek mezofilu liścia rzodkiewnika potraktowane peptydem fitosulfokinowym PSKa charakteryzowały się znacznym wzrostem stężenia cgmp w stosunku do protoplastów kontrolnych. Podobny efekt fizjologiczny uzyskano wskutek nadprodukcji receptora PSKR1 w komórkach rzodkiewnika. Wyniki te stanowiły pierwszy dowód na to, że receptor o podwójnej aktywności kinazowo-cyklazowej sprawnie przeprowadza obie reakcje (fosforylacji oraz cyklizacji GTP) w żywej komórce roślinnej [32]. Autorzy publikacji stworzyli hipotetyczny model funkcjonowania receptora PSKR1. Nieaktywny receptor może występować zarówno w formie monomeru jak i dimeru, a dopiero związanie liganda PSKα powoduje aktywację PSKR1. Nie jest jasne, czy wskutek aktywacji uruchamiana jest najpierw aktywność kinazowa czy cyklazowa białka, jednak prawdopodobne wydaje się, że do zainicjowania aktywności cyklazy guanylanowej wymagane jest powstanie homodimerycznej formy receptora. Zatem przypuszcza się, że przyłączenie liganda powoduje fosforylację krzyżową bądź autofosforylację indukującą dimeryzację PSKR1, co w następstwie umożliwia konwersję GTP do cgmp. Najnowsze doniesienia sugerują także ścisły udział jonów Ca 2+ w regulacji aktywności kinazowo-cyklazowej białka PSKR1 [34]. Obecność jonów Ca 2+ wzmacnia aktywność GC i drastycznie obniża aktywność kinazową receptora PSKR1, zatem wydaje się, że zmiany stężenia tych jonów pełnią w zależności od potrzeby rolę włącznika jednej bądź drugiej domeny wewnątrzkomórkowej. Pozostałe dwa receptory scharakteryzowane w komórkach rzodkiewnika PepR1 oraz WAKL-10 zaangażowane są w odpowiedź rośliny na infekcję patogenową. Podobnie jak receptory BRI1 i PSKR1 w swojej budowie posiadają one domenę o podwójnej aktywności kinazy serynowo- treoninowej oraz cyklazy guanylanowej zlokalizowaną w cytosolowej części polipeptydu [30,31]. Wykazano, że domena zewnątrzkomórkowa obu wymienionych białek ma zdolność Rycina 2. Zachowana w ewolucji domena katalityczna o długości 14-stu aminokwasów zidentyfikowana w roślinnych cyklazach guanylanowych wraz z zaznaczeniem miejsc funkcyjnych. Postępy Biochemii 61 (2) 2015 173

do rozpoznawania molekularnych wzorców niebezpieczeństwa pochodzących z własnych cząsteczek uszkodzonych na skutek działania czynnika wywołującego stres (DAMPs, ang. Danger-Associated Molecular Patterns) lub pochodzących z cząsteczek obcych (PAMPs, ang. Pathogen-Associated Molecular Patterns lub MAMPs, ang. Microbe- Associated Molecular Patterns). Jest to pierwsza linia obrony roślin przed infekcjami prowadząca do uruchomienia mechanizmu odporności podstawowej (PTI). Wśród wzorców DAMPs wyróżnia się rodzinę sześciu endogennych peptydów, które u rzodkiewnika określone zostały jako AtPeps. Czynniki te po połączeniu z receptorami PepR1 lub PepR2 uruchamiają kaskadę zdarzeń prowadzącą do obrony przed biotycznymi czynnikami wywołującymi stres [35]. Wykazano, że białko błonowe AtPepR1 jest receptorem peptydów AtPeps1-6, a białko AtPepR2 odpowiedzialne jest za wiązanie AtPep1 i AtPep2. Podobieństwo sekwencji aminokwasowych obu receptorów szacowane jest na 76% [36]. Wykazano, że wskutek rozpoznania peptydów AtPeps następuje aktywacja kinazowo-cyklazowej domeny receptora i synteza cgmp. Kolejnym etapem szlaku sygnałowego jest aktywacja kanału bramkowanego cyklicznymi nukleotydami CNGC2, w wyniku której następuje napływ jonów Ca 2+ do cytosolu oraz uruchomienie kaskady zdarzeń zależnych od wapnia. Proponowany przez autorów model odpowiedzi komórki roślinnej na działanie elicitora zakłada ścisłe współdziałanie receptora PepR1, cząsteczek cgmp oraz jonów Ca 2+ w odpowiedzi roślin na biotyczne czynniki stresowe [30]. Czwartym roślinnym białkiem o właściwościach błonowej GC jest receptor WAKL-10. Należy on do rodziny WAK/ WAK-like (WAKL), w skład której wchodzi 26 białek. Białko WAKL-10 zbudowane jest z zewnątrzkomórkowego peptydu sygnałowego, domeny rozpoznającej ligandy, transbłonowej oraz wewnątrzkomórkowej z regionem kinazowo- -cyklazowym. W obrębie domeny zewnątrzkomórkowej wyróżnia się powtórzenia EGF (ang. Epidermal Growth Factor) oraz EGF2-like wiążące jony Ca 2+ i odgrywające szczególną rolę w rozpoznawaniu ligandów. Domena ta jest słabo zachowana ewolucyjnie, co daje możliwość rozpoznawania i wiązania dużej ilości ligandów o różnorodnej budowie. W obrębie domeny cytoplazmatycznej białka WAKL-10 występuje silnie zachowany w ewolucji zbudowany z 14 reszt aminokwasowych motyw warunkujący aktywność GC, który otoczony jest domeną kinazową. Aktywność kinazowa i cyklazowa tego regionu została potwierdzona badaniami in vitro. Autorzy sugerują, że białko WAKL-10 jest receptorem wielu molekularnych wzorców cząsteczek pochodzących od mikroorganizmów (MAMPs), takich jak chityna, flagelina czy czynnik NPP1 (ang. Necrosis-inducing Phytophthora Protein 1). Zaobserwowany znaczny i szybki wzrost aktywności transkrypcyjnej genu WAKL-10 zarówno w odpowiedzi na infekcję patogenami biotroficznymi (Pseudomonas syringae, Phytophthora infestans, Golovinomyces orontii) jak i nekrotroficznymi (Botrytis cinerea) sugeruje jego udział w szybkiej odpowiedzi obronnej na szerokie spektrum mikroorganizmów. Wzrost ekspresji genu WAKL-10 jest ściśle skorelowany z jednoczesnym podwyższeniem aktywności transkrypcyjnej genów szybkiej odpowiedzi roślin na stres biotyczny zaangażowanych w szlak syntezy fitohormonów (SA oraz JA) oraz fitoaleksyny o nazwie kamaleksyna. Proponowany model działania receptora WAKL-10 zakłada rozpoznanie i związanie liganda za pomocą motywu EGF w domenie zewnątrzkomórkowej, następnie przekazanie sygnału do domeny kinazowo-cyklazowej wewnątrz komórki odpowiadającej za szybką syntezę cgmp, który prawdopodobnie aktywuje kanały jonowe CNGC uruchamiając wczesną odpowiedź rośliny na bodziec stresowy [30]. PODSUMOWANIE Obecnie wiadomo, że wiele podstawowych procesów fizjologicznych zachodzących w komórkach roślinnych przebiega z udziałem cyklicznego guanozyno-3,5 -monofosforanu. W związku z tym mało prawdopodobne wydaje się, że za syntezę cgmp w komórce roślinnej odpowiedzialna jest pojedyncza cyklaza guanylanowa. Wykazano, że poza zidentyfikowanymi początkowo cytosolowymi białkami o aktywności GC, konwersję GTP do cgmp niejako przy okazji przeprowadzają także białka błonowe. Ściśle określona, charakterystyczna budowa domenowa oraz obecność wysoko zachowanego w ewolucji zbudowanego z 14 reszt aminokwasowych motywu katalitycznego warunkuje jednoczesną aktywność kinazową oraz cyklazową tych białek. Należy zauważyć, że analizy bioinformatyczne ujawniły występowanie co najmniej 40 sekwencji aminokwasowych cechujących się potencjalną aktywnością cyklaz guanylanowych, jednak tylko niewielka część z nich została zweryfikowana eksperymentalnie. Zatem wydaje się, że wiedza na ten temat wymaga dalszego sukcesywnego uzupełniania, gdyż niewykluczone jest istnienie także innych roślinnych GC o zupełnie odmiennej budowie i mechanizmie regulacji. PIŚMIENNICTWO 1. Huang GT, Ma SL, Bai LP, Zhang L, Ma H, Jia P, Liu J, Zhong M, Guo ZF (2012) Signal transduction during cold, salt, and drought stresses in plants. Mol Biol Rep 39: 969-987 2. Xiong L, Ishitani M (2006) Stress signal transduction: components, pathways and network integration. Abiotic Stress Tolerance in Plants. Springer, Dordrecht, the Netherlands, str. 3 29 3. Lemtiri-Chlieh F, Thomas L, Marondedze C, Irving H, Gehring C (2011) Cyclic nucleotides and nucleotide cyclases in plant stress responses, W: Shanker A, Venkateswarlu B (red) Abiotic Stress Response in Plants - Physiological, Biochemical and Genetic Perspectives. InTech - Open Access Publisher, str. 137-182 4. Szmidt-Jaworska A (2010) Plant purine nucleotide cyclases. Postepy Biochem 56: 409-417 5. Maathuis FJM (2006) cgmp modulates gene transcription and cation transport in Arabidopsis roots. Plant J 45: 700-711 6. Penson SP, Schuurink RC, Fath A, Gubler F, Jacobsen JV, Jones RL (1996) cgmp is required for gibberellic acid-induced gene expression in barley aleurone. Plant Cell 8: 2325-2333 7. Teng Y, Xu W, Ma M (2010) cgmp is required for seed germination in Arabidopsis thaliana. J Plant Physiol 167: 885-889 8. Dubovskaya LV, Bakakina YS, Kolesneva EV, Sodel DL, McAinsh MR, Hetherington AM, Volotovski ID (2011) cgmp-dependent ABA-induced stomatal closure in the ABA-insensitive Arabidopsis mutant abi1-1. New Phytol 191: 57-69 9. Joudoi T, Shichiri Y, Kamizono N, Akaike T, Sawa T, Yoshitake J, Yamada N, Iwai S (2013) Nitrated cyclic GMP modulates guard cell signaling in Arabidopsis. Plant Cell 25: 558-571 10. Cousson A (2001) Pharmacological evidence for the implication of both cyclic GMP-dependent and -independent transduction pathways within auxin-induced stomatal opening in Commelina communis (L.). Plant Sci 161: 249-258 174 www.postepybiochemii.pl

11. Cousson A (2010) Indolyl-3-butyric acid-induced Arabidopsis stomatal opening mediated by 3,5 -cyclic guanosine-monophosphate. Plant Physiol Biochem 48: 977-986 12. Hu X, Neill SJ, Tang Z, Cai W (2005) Nitric oxide mediates gravitropic bending in soybean roots. Plant Physiol 137: 663-670 13. Pagnussat GC, Lanteri ML, Lamattina L (2003) Nitric oxide and cyclic GMP are messengers in the indole acetic acid-induced adventitious rooting process. Plant Physiol 132: 1241-1248 14. Nan W, Wang X, Yang L, Hu Y, Wei Y, Liang X, Mao L, Bi Y (2014) Cyclic GMP is involved in auxin signalling during Arabidopsis root growth and development. J Exp Bot 65: 1571-1583 15. Kwezi L, Meier S, Mungur L, Ruzvidzo O, Irving H, Gehring Ch (2007) The Arabidopsis thaliana brassinosteroid receptor (AtBRI1) contains a domain that functions as a guanylyl cyclase in vitro. PLoS One 2: 449 16. Isner JCh, Nuhse T, Maathuis FJM (2012) The cyclic nucleotide cgmp is involved in plant hormone signalling and alters phosphorylation of Arabidopsis thaliana root proteins. J Exp Bot 63: 3199-3205 17. Szmidt-Jaworska A, Jaworski K, Kopcewicz J (2007) Cyclic nucleotides in higher plants. Post Biol Kom 34: 49-67 18. Maathuis FJM, Sanders D (2001) Sodium uptake in Arabidopsis roots is regulated by cyclic nucleotides. Plant Physiol 127: 1617-1625 19. Donaldson L, Ludidi N, Knight MR, Gehring C, Denby K (2004) Salt and osmotic stress cause rapid increases in Arabidopsis thaliana cgmp levels. FEBS Lett 569: 317-320 20. Pasqualini S, Meier S, Gehring C, Madeo L, Fornaciari M, Romano B, Ederli L (2009) Ozone and nitric oxide induce cgmp- dependent and independent transcription of defence genes in tobacco. New Phytol 181: 860-870 21. Meier S, Madeo L, Ederli L, Donaldson L, Pasqualini S, Gehring C (2009) Deciphering cgmp signatures and cgmp-dependent pathways in plant defence. Plant Signal Behav 4: 307-309 22. Lucas KA, Pitari GM, Kazerounian S, Ruzi-Steward I, Park J, Schulz S, Chepenik KP, Waldman SA (2000) Guanylyl cyclases and signaling by cyclic GMP. Pharmacol Rev 52: 375 413 23. Ludidi N, Gehring C (2003) Identification of a novel protein with guanylyl cyclase activity in Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 278: 6490-6494 24. Roelofs J, Meima M, Schaap P, van Haastert PJM (2001) The Dictyostelium homologue of mammalian soluble adenylyl cyclase encodes a guanylyl cyclase. EMBO J 20: 4341 4348 25. Nighorn A, Byrnes KA, Morton DB (1999) Identification and characterization of a novel beta subunit of soluble guanylyl cyclase that is active in the absence of a second subunit and is relatively insensitive to nitric oxide. J Biol Chem 274: 2525 2531 26. Yuan J, Liakat Ali M, Taylor J, Liu J, Sun G, Liu W, Masilimany P, Gulati-Sakhuja A, Pauls KP (2008) A guanylyl cyclase-like gene is associated with Gibberella ear rot resistance in maize (Zea mays L.). Theor Appl Genet 116: 465-479 27. Szmidt-Jaworska A, Jaworski K, Pawełek A, Kopcewicz J (2009) Molecular cloning and characterization of a guanylyl cyclase, PnGC-1, involved in light signaling in Pharbitis nil. J Plant Growth Regul 28: 367-380 28. Mulaudzi T, Ludidi N, Ruzvidzo O, Morse M, Hendricks N, Iwuoha E, Gehring C (2011) Identification of a novel Arabidopsis thaliana nitric oxide-binding molecule with guanylate cyclase activity in vitro. FEBS Lett 585: 2693-2697 29. Meier S, Gehring C (2006) Emerging roles in plant biotechnology for the second messenger cgmp - guanosine 3, 5 -cyclic monophosphate. Afr J Biot 5: 1687-1692 30. Qi Z, Verma R, Gehring C, Yamaguchi Y, Zhao Y, Ryan CA, Berkowitz GA (2010) Ca2+ signaling by plant Arabidopsis thaliana Pep peptides depends on AtPepR1, a receptor with guanylyl cyclase activity, and cgmp-activated Ca2+ channels. Proc Natl Acad Sci USA 107: 21193 21198 31. Meier S, Ruzvidzo O, Morse M, Donaldson L, Kwezi L, Gehring C (2010) The Arabidopsis Wall Associated Kinase-Like 10 gene encodes a functional guanylyl cyclase and is co-expressed with pathogen defense related genes. PLoS One 5: e8904 32. Kwezi L, Ruzvidzo O, Wheeler JI, Govender K, Iacuone S, Thompson PE, Gehring Ch, Irving HR (2011) The Phytosulfokine (PSK) receptor is capable of guanylate cyclase activity and enabling cyclic GMP-dependent signaling in plants. J Biol Chem 286: 22580-22588 33. Wong A, Gehring C (2013) The Arabidopsis thaliana proteome harbors undiscovered multi-domain molecules with functional guanylyl cyclase catalytic centers. Cell Commun Signal 8: 48 34. Muleya V, Wheeler J, Ruzvidzo O, Freihat L, Manallack D, Gehring Ch, Irving H (2014) Calcium is the switch in the moonlighting dual function of the ligand-activated receptor kinase phytosulfokine receptor 1. Cell Commun Signal 12: 60 35. Klauser D, Flury P, Boller T, Bartels S (2013) Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signal Behav 8: e25346 36. Yamaguchi Y, Huffaker A, Bryan AC, Tax FE, Ryan CA (2010) PEPR2 is a second receptor for the Pep1 and Pep2 peptides and contributes to defense responses in Arabidopsis. Plant Cell 22: 508-522 Biosynthesis of cyclic GMP in plant cells new insight into guanylate cyclases Brygida Świeżawska *, Katarzyna Marciniak, Adriana Szmidt-Jaworska Nicolaus Copernicus University, Faculty of Biology and Environment Protection, Chair of Plant Physiology and Biotechnology, Lwowska 1 St., 87-100 Torun, Poland * e mail: bswiezawska@umk.pl Acknowledgements: Work in author s laboratory is supported bygrant from National Science Center NN 310 301839. Key words: cgmp, guanylyl cyclase, cyclic nucleotides ABSTACT Cyclic 3,5 -guanosine monophosphate (cgmp) is involved in many physiological processes in plants. Concentration of this second messenger in plant cell is determined by guanylyl cyclases (GCs) responsible for cgmp synthesis and phosphodiesterases (PDEs) involved in cgmp inactivation. First discovered plant GCs were localized in cytosol, but few years ago a new family of plasma membrane proteins with guanylyl cyclase activity was identified in Arabidopsis thaliana. These proteins belong to the family of a leucine-rich repeat receptor-like kinases (LRR-RLK) with extracellular leucine-rich repeat domain, a transmembrane-spanning domain, and an intracellular kinase domain. A novel class of guanylyl cyclases contain the GC catalytic center encapsulated within the intracellular kinase domain. These molecules are different to animal GCs in that the GC catalytic center is nested within the kinase domain. In presented paper we summarized the most recent data concerning plant guanylyl cyclases. Postępy Biochemii 61 (2) 2015 175