Recenzja Problematyka pracy

Transkrypt

1 Prof. dr hab. Jan Sadowski Poznań, 5 czerwca 2014 r. Zakład Biotechnologii Instytut Biologii Molekularnej i Biotechnologii Wydział Biologii, Uniwersytet im. A. Mickiewicza ul. Umultowska 89, Poznań Tel.: Fax: jsad@amu.edu.pl Recenzja pracy doktorskiej mgr. Piotra Gawrońskiego zatytułowanej Molecular, physiological and bioinformatic analysis of the cellular signalling for regulation of biotic and abiotic stress responses in higher plants Recenzowana przeze mnie praca doktorska została wykonana pod kierunkiem prof. dr. hab. Stanisława Karpińskiego w Pracowni Fizjomiki i Modelowania Biotechnologicznego Roślin na Wydziale Ogrodnictwa, Biotechnologii i Architektury Krajobrazu, SGGW w Warszawie. Problematyka pracy Praca dotyczy poznania mechanizmów optymalizacji odpowiedzi komórek roślinnych na złożone bodźce o charakterze stresowym (patrz: Thesis aim and hypothesis). Rozmyślnie używam terminu bodźce o charakterze stresowym by rozróżnić je od bodźców środowiskowych niestresowych, daleko liczniejszych, działających jednocześnie, które również powodują optymalizację złożonej odpowiedzi roślin. Tu trzeba dodać: badamy bodżce stresowe, ponieważ powodują one silniejsze reakcje roślin, łatwiej obserwowalne a więc mierzalne, nie wspominając o potrzebie poznania odpowiedzi na stresy z powodu utraty części plonów. W pracy, optymalizację odpowiedzi stresowej badano u linii Arabidopsis thaliana z funkcjonalnymi i znokautowanymi genami dla syntazy izochoryzmianu (ICS1) i kinazy MAP (MPK4). Projekt doktorski opierał się na założeniu, że nie w pełni poznana rola obu białek w odpowiedzi A.thaliana na warunki stresowe jest bardzo złożona, a przede wszystkim integrująca szereg procesów komórkowych. U podstaw tego założenia była obserwacja, że geny te są indukowane na poziomie transkrypcyjnym w szeregu procesach komórkowych. Niewątpliwie ten kierunek badań jest bardzo aktualny, stanowi bowiem ważną próbę wprowadzającą biologię molekularną okresu postgenomowego w biologię systemu, a więc 1

2 całościową/kompletną analizę badanego zjawiska (tu: adaptacji do stresu). Charakterystykę funkcjonalną ICS1 i MPK4 - ich znaczenie dla wzrostu i rozwoju roślin - wykonano dla różnych, ściśle określonych warunków świetlnych i poprzez ocenę dostosowania się aparatu fotosyntetycznego. Problematyka ta, wraz z innymi zagadnieniami funkcjonowania metabolizmu komórkowego w stresie, jest konsekwentnie i ze znanym nam powodzeniem, rozwiązywana od szeregu lat w kolejnych Zespołach tworzonych i kierowanych przez Prof. dr. hab. Stanisława Karpińskiego za granicą i w kraju. Ocena merytoryczna Wyniki omawianych badań zostały przedstawione w trzech podrozdziałach, reprezentujących trzy główne zadania pracy doktorskiej. Pierwsze zadanie związane jest z poznaniem nowych funkcji syntazy izochoryzmianu (ICS1), enzymu, który dotąd uważany był przede wszystkim za ważny czynnik odpowiedzi roślin na stresy biotyczne, a przede wszystkim związany z atakiem patogenów. Ta funkcja wynika z jego dobrze opisanego udziału w biosyntezie kwasu salicylowego, głównego hormonu odpowiedzi na stresy biotyczne. W pracy, z wykorzystaniem mutanta ics1 i linii typu dzikiego ICS1, oraz po przeprowadzeniu szeregu znakomicie zaplanowanych i wykonanych eksperymentów fizjologicznych ustalono po raz pierwszy, że ICS1 ma również udział w regulacji mechanizmu przejścia stanów między fotosystemem I a II. Udowodniono ponadto, że ICS1 ma wpływ na status redoks puli plastochinonu, a także na organizację tylakoidów. Drugie zadanie, obejmowało analizę funkcjonalną kinazy białkowej, należącej do kaskady kinaz MAP, MPK4. Kinaza ta została wcześniej opisana jako ważny element sygnalizacji związanej z systemową odpornością nabytą (SAR), zależną od SA. W swej pracy doktorskiej Autor pokazał, że aktywność badanej kinazy jest ponadto niezbędna do optymalnego fotosyntetycznego transportu elektronów i także do utrzymania homeostazy reaktywnych form tlenu (RFT; ROS). Otrzymane wyniki pozwalają na bardzo ważne, oryginalne stwierdzenie: MPK4 kontroluje wzrost i rozwój roślin poprzez mechanizm niezależny od SA. Łącznie, w badaniach nad obu enzymami ustalono, że obok roli kluczowych negatywnych regulatorów w reakcji obronnej na potogeny, pełnią one również ważną funkcję w pozytywnej regulacji aklimatyzacji roślin do światła. Znaczenie tej pracy opiera się m. in. na wykazaniu, że funkcjonowanie pojedynczego genu ma wpływ na szereg procesów; albo odwracając tę zależność, że różne procesy są powiązane ze sobą poprzez integracyjne 2

3 działanie pojedynczego genu (białka). Założeniem projektu doktorskiego było, że rośliny potrafią integrować szlaki sygnalizacyjne po ich zaindukowaniu przez różne bodźce jednocześnie, w celu osiągnięcia stanu zoptymalizowanej odpowiedzi Trzecie zadanie miało całkowicie odmienny charakter, bioinformatyczno-genetyczny, w którym mgr Piotr Gawroński zamierzał wskazać na mechanizm genetyczny, który mógłby mieć wpływ na określone grupy genów i szybkie, ukierunkowane dostosowanie się genomu roślin do pożądanej (adaptacyjnej) odpowiedzi stresowej. Mechanizm ten mógłby prowadzić do modyfikacji i adaptacji określonej części transkryptomu do zmieniających się warunków środowiska. Opracowując koncepcję tego zadania, Autor oparł się o wcześniejsze wstępne doniesienia na temat wpływu cis- i trans-regulatorowych czynników na poziom transkrypcji, a także naturalnej zmienności w sekwencjach genowych m. in. u różnych linii A. thaliana, a także różnych gatunków Drosophila. Koncentrując się na trzech krótkich sekwencjach regulatorowych, znanych jako ABRE, DRE i ERE, leżących w odcinku 1000 pz promotorów wielu genów, Autor porównał ich występowanie u czterech gatunków i dwóch linii wewnątrz gatunku (Cucumis sativus), które charakteryzują się bogatymi bazami danych i odpowiednimi narzędziami. Wybór ww. trzech elementów regulatorowych był trafny, bowiem powiązanie tych elementów cisregulatorowych z sygnalizacją stresową zależną od kwasu abscysynowego i etylenu jest dobrze udokumentowane. W wyniku analizy bioinformatycznej promotorów genów ortologicznych, stwierdzono istotne różnice międzygatunkowe w strukturze badanych promotorów pod względem występowania analizowanych elementów regulatorowych. Uwidoczniono różnice także między dwoma liniami ogórka, pochodzącymi ze znacząco odmiennych warunków środowiska. Autor ciekawie i w sposób uzasadniony interpretuje podłoże różnic w występowaniu elementów regulatorowych u linii pochodzenia europejskiego i azjatyckiego. Aktualne pozostaje pytanie o mechanizm dostosowujący dywergencję badanych promotorów do określonych potrzeb transkrypcyjnych, niezbędnych w adaptacji roślin do warunków stresowych. To przeprogramowanie transkrypcyjne osiągnięte na drodze nieoczekiwanie szybkiej ewolucji sekwencji regulatorowych w promotorach, rodzi pytanie o podstawy genetyczne tego procesu. Gdyby oprzeć się na klasycznych prawach genetyki populacji można sądzić, że dywergencja (liczne mutacje) musiałaby by zachodzić w większej liczbie promotorów jednocześnie, to z kolei wymagałoby dużej liczebności osobniczej, która pozwoliłaby na efektywniejsze testowanie przewagi adaptacyjnej (i selekcyjnej) części zmienionych osobników w populacji. Możliwy też jest udział nieznanego mechanizmu 3

4 wprowadzającego w sposób bardziej ukierunkowany efektywne modyfikacje na drodze rekombinacji. Jestem przekonany, że Autor badań wypracował interesującą opinię na ten temat - zatem dobrze byłoby ją poznać. Udokumentowana w pracy dywergencja promotorów ukazuje jednocześnie swoiste zakonserwowanie (w pewnym zakresie) struktury (zatem i funkcji) czynników transkrypcyjnych, co w tym układzie badawczym sugerowałoby, że szybkie dostosowanie ewolucyjne może obejmować tylko promotory, a nie sekwencje kodujące. Potwierdza tę obserwację wykryty brak równie efektywnej dywergencji genów na poziomie sekwencji egzonów. Ta konserwacja struktury i funkcji sekwencji kodujących (na poziomie międzygatunkowym) jest widoczna w odniesieniu do czynników kontrolujących transkrypcję pośrednio, a więc hormonów, sygnałów typu ROS (RFT), czy kinaz MAP. Tu nasuwa się pytanie, jak w takiej zintegrowanej odpowiedzi funkcjonują inne poziomy szeroko pojętej ekspresji genów tj. poziom proteomu i szerzej metabolomu, i czy Autor przewiduje inne jeszcze poziomy optymalizacji odpowiedzi (jej integracji) nazwijmy ją poziomem posttranskrypcyjnym (także posttranslacyjnym) - oparte na złożonej sieci interakcji białek i metabolitów; dodajmy: sieci, która też dostosowuje się do szybko zmieniających się warunków środowiska? Ciekaw jestem opinii Autora w tej sprawie. Ocena formalna Przystępując do oceny formalnej pracy doktorskiej mgr. Piotra Gawrońskiego, chciałbym rozpocząć od stwierdzenia, że praca napisana została wg reguł klasycznych, z tą tylko różnicą, że Autor nie opracował Wniosków. Jak wiadomo, dobrze opracowane wnioski (jednak nie wnioski stanowiące w istocie mini-podsumowania wyników, znajdowane w większości prac doktorskich) stanowią dalszą perspektywę badań i w istocie nadają właściwą perspektywę uzyskanym wynikom. Pomimo formalnego braku wniosków w tym opracowaniu, czytelnik wielokrotnie znajduje komentarze i podsumowania (w rozdziałach Wyniki i Dyskusja) mające charakter wniosków. Stanowią one w istocie bogatą interpretację i szeroką perspektywę opisywanych badań i problematyki (patrz: Wstęp). Wykaz Skrótów Nazw jest zdecydowanie niepełny. Autor podaje jedynie 16 skrótów, podczas gdy w całej pracy używa ich parokrotnie więcej. Pomimo, że wszystkie skróty zostały rozwinięte w tekście przy pierwszym użyciu, to zestaw rozwiniętych skrótów stanowiłby pomoc przy zapoznawaniu się z problematyką pracy. We Wstępie pracy przedstawiono najważniejsze zagadnienia nawiązujące do problematyki rozprawy doktorskiej. Rozdział ten został napisany konsekwentnie wg myśli 4

5 przewodniej pracy, a mianowicie, że wiele procesów komórkowych jest zintegrowanych w celu optymalizacji odpowiedzi komórkowej na nieustannie zmieniające się warunki środowiska. I że warunki świetlne zajmują szczególne miejsce w dostosowaniu wzrostu i rozwoju roślin; widoczne jest to poprzez włączenie się szeregu ścieżek sygnalizacji komórkowej. Rozdział ten cechuje znakomity przegląd literatury i interesujące przedstawienie najnowszych zagadnień obejmujących przejście stanów, wygaszanie nadmiaru energii świetlnej, rolę reaktywnych form tlenu, kaskady kinaz MAP, hormonów, kończąc na ukierunkowanych zmianach w transkryptomie (profilu transkrypcyjnym). Na tle tego wprowadzenia jasno zostały nakreślone wyzwania które postawił sobie Autor recenzowanej pracy. Wynikający ze Wstępu kolejny rozdział tj. Cele pracy jasno przedstawia założenia i hipotezy. Szczególnie podoba mi się brzmienie ostatniego, podsumowującego celu, który dobrze oddaje charakter przeprowadzonych badań. Zadanie to brzmi następująco: w jaki sposób rośliny integrują sygnały by uzyskać optymalny efekt dostosowania do warunków środowiska. Materiał i Metodyka zostały przedstawione w sposób umożliwiający kontynuację tego kierunku prac przez inne zespoły. W rozdziale Wyniki przedstawiono szczegółową, dobrze opracowaną dokumentację. Szczególnie interesująco zobrazowano wyniki związane z regulacją ekspresji mutanta mpk4 i jego oceną pod kątem procesu fotosyntezy (Rysunki 11 i 12). W Dyskusji, mgr Piotr Gawroński omawia dojrzale uzyskane wyniki bardzo dojrzale, na ogół z perspektywy integracji badanych procesów, co stanowi o szczególnej wartości pracy. Stanowi ona przykład badań w trudnej dziedzinie zintegrowanej biologii, co ponownie podkreślam. Wiele szczegółowych rozważań Autora ma szersze znaczenie w dziedzinie biologie i ekologii. Praca została napisana w języku angielskim, klarownie i dojrzale, co chcę zaznaczyć. Napotykane w trakcie czytania usterki redakcyjne pojawiały się z akceptowalną częstością. Podsumowując ocenę pracy doktorskiej mgr. Piotra Gawrońskiego, chciałbym stwierdzić, że podjęte badania przyniosły wyjątkowo interesujące wyniki, odsłaniające nowe poziomy funkcjonowania zarówno syntazy izochoryzmianu, jak i kinazy białkowej MAP 4. Uważam, że uzyskane wyniki stanowią cenną perspektywę dla dalszych badań nad rolą tych białek, które moglibyśmy nazwać węzłowymi (ew. osiowymi od terminu ang. hub) z jednej strony, a optymalizacją odpowiedzi stresowej z drugiej. 5

6 Praca doktorska mgr. Piotra Gawrońskiego wnosi nowe elementy poznawcze do biologii molekularnej roślin, dzięki oryginalnemu poszukiwaniu całościowego oglądu badanych procesów. Na podkreślenie zasługuje oryginalność koncepcji i zastosowanych podejść. Znakomicie zastosowano wiele metod biologii molekularnej i narzędzia bioinformatyczne, co w połączeniu ze znajomością eksperymentowania o charakterze fizjologicznym, przyniosło oryginalne wyniki. Wniosek końcowy Omawiana praca spełnia wszystkie wymogi stawiane rozprawie doktorskiej. W związku z powyższym, wnoszę do Rady Naukowej Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN o dopuszczenie Pana Magistra Piotra Gawrońskiego do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Ze względu na rangę naukową tej rozprawy doktorskiej zaproponowanie nowej roli ACS1 i MPK4 w optymalizacji odpowiedzi na stres u Arabidopsis thaliana, oraz wskazanie na istnienie mechanizmu genetycznego kierującego szybką i ukierunkowaną dywergencją promotorów genowych, prowadzącego do dostosowania transkryptomu roślin do zmieniających się warunków środowiska - wnioskuję o jej wyróżnienie. Prof. dr hab. Jan Sadowski 6