Ocena stężenia rozpuszczalnego receptora dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (svegfr-2) u kobiet chorych na raka piersi

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2009 Volume 45 Number 4 293-300 Praca oryginalna Original Article Ocena stężenia rozpuszczalnego receptora dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (svegfr-2) u kobiet chorych na raka piersi Anna Thielemann 1, Zygmunt Kopczyński 1, Małgorzata Janiszczak 1, Sylwia Grodecka-Gazdecka 2 1 Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej; 2 Oddział Chirurgii Onkologicznej Katedry Onkologii Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Streszczenie Cel: Warunkiem działania VEGF jest obecność swoistych receptorów, należących do rodziny kinaz tyrozynowych, takich jak VEGFR-1, VEGFR-2 oraz formy rozpuszczalne svegfr-1 i svegfr-2. Aktywacja tych receptorów zlokalizowanych na powierzchni śródbłonka naczyniowego inicjuje w tych komórkach wiele procesów biochemicznych prowadzących do unaczynienia guzów nowotworowych litych i powstania odległych przerzutów. Celem pracy była ocena stężenia receptora svegfr-2 w surowicy 103 kobiet chorych na pierwotnego raka piersi. W ocenie tej uwzględniono zaawansowanie procesu chorobowego, stopień złośliwości histologicznej guza, stan okolicznych węzłów chłonnych pachowych oraz wielkość guza pierwotnego. Metody: Stężenie rozpuszczalnej formy receptora (svegfr-2) oznaczono metodą immunoenzymatyczną (ELISA) w wersji sandwich, w oparciu o testy Quantikine firmy R&D Systems Abingdon, UK. Wyniki: W badaniach wykazano istotnie wyższe stężenie svegfr-2 w surowicy kobiet chorych na raka piersi w porównaniu do wartości tego receptora w grupie kontrolnej. Im wyższy był stopień zaawansowania klinicznego choroby, tym wyższy uzyskano poziom rozpuszczalnej formy tego receptora. Podobny kierunek zmian otrzymano przy ocenie stopnia złośliwości histologicznej guza. Znamiennie wyższe wartości svegfr-2 uzyskano także w grupie kobiet chorych na raka piersi z przerzutami i bez przerzutów. Podobną korelację wykazano pomiędzy stężeniem svegfr-2 a wielkością guza pierwotnego. Wnioski: Stężenie rozpuszczalnej formy receptora (svegfr-2) dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu w surowicy kobiet chorych na pierwotnego raka gruczołu piersiowego wykazuje zależność ze stopniem zaawansowania choroby nowotworowej. Wskazuje to na przydatność oznaczania tego receptora w ocenie klinicznej chorych na raka piersi. Estimation of soluble receptor of vascular endothelial growth factor (svegfr-2) concentration in patients with breast cancer Summary Aim: Among cell surface receptors responsible for internalizing this growth factor are VEGFR-1, VEGFR-2, members of the receptor type tyrosine kinase superfamily and soluble receptors forms svegfr-1 and svegfr-2. Following VEGF-mediated activation of these receptors in tumor endothelial cells a series of biochemical events is initiated, leading to division of these cells and subsequently, to new tumor blood vessels and metastasis formation. The aim of the study was to ascertain the value of assessment of svegfr-2 levels in serum, in 103 women with primary breast cancer and its correlations with clinical status of the disease, histological malignancy,status of axillary lymph nodes and the size of primary tumor. Methods: The assessment of concentration of soluble form of the vascular endothelial growth factor receptor svegfr-2 was performed in serum by an enzyme-linked immunosorbent assay ELISA (Quantikine test of R&D Systems, Abingdon, UK). Results: The results of the study suggested that the level of svegfr-2 in serum of women with breast cancer was significantly higher than in serum of healthy women. The relation between the level of svegfr-2 and the stage of clinical disease advancement was discovered. The statistical analysis showed a significant difference between svegfr-2 level in control group comparing to women with breast cancer in stages I, II and III of clinical disease advancement. There was a correlation between the increasing value of svegfr-2 level and aggressiveness of the disease. The similar correlation was found between svegfr-2 level and the size of primary tumor. Significant differences were also found in group of women with metastases to the axillary lymph nodes and women with no metastases. 293

Ocena stężenia rozpuszczalnego receptora dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (svegfr-2)... Conclusion: The results of the study suggested that svegfr-2 may represent a useful indicator for assessment of the clinical disease advancement. Słowa kluczowe: receptor svegfr-2, receptory dla VEGF, angiogeneza, rak piersi Key words: svegfr-2 receptor, VEGFR receptors, angiogenesis, breast cancer Wstęp Rak piersi charakteryzuje się dużą inwazyjnością oraz zdolnością rozsiewu komórek rakowych do odległych tkanek i narządów, takich jak płuca, kości, wątroba i mózg [30]. Badania naukowe ostatnich lat wykazały, iż jednym z czynników warunkujących wzrost guzów nowotworowych litych jest proces angiogenezy [11]. Powstawanie unaczynienia guzów nowotworowych litych związane jest z obecnością czynników angiogennych wytwarzanych przez komórki guza [14, 18]. Jednym z nich jest naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu VEGF. Cytokina ta działa stymulująco na proliferację i migrację komórek śródbłonka oraz zwiększa przepuszczalność naczyń, dzięki czemu ułatwia komórkom nowotworowym przechodzenie do przestrzeni pozanaczyniowej i zapoczątkowuje tworzenie przerzutów nawet w odległych narządach [1, 8, 25]. Białko VEGF występuje w postaci izoform: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D i VEGF-E. Dotychczasowe badania wykazały, że poszczególne izoformy wywierają swoje działanie na komórki śródbłonka naczyniowego poprzez oddziaływanie ze swoistymi receptorami błonowymi występującymi na powierzchni endotelium [6, 7]. Ligandem dla receptora VEGFR-1 są VEGF-A, VEGF-B oraz łożyskowy czynnik wzrostu PIGF. Z receptorem VEGFR-2 oddziałują VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, natomiast VEGFR-3 wiąże się z izoformami VEGF-C i VEGF-D, i VEGF-E [6, 7]. Receptory VEGFR-1 i VEGFR-2 należą do rodziny kinaz tyrozynowych, enzymów uczestniczących w przekazywaniu sygnałów związanych z podstawowymi funkcjami komórki, tj. regulacją wzrostu i różnicowania, kontrolą cyklu komórkowego i aktywnością wielu szlaków metabolicznych [3, 29]. Receptory VEGFR-3 uczestniczą w przekazywaniu sygnałów limfangiogennych, prowadzących do podziału komórek śródbłonka naczyń limfatycznych [3, 11]. Receptory VEGFR-1 (Flt-1 fms-like tyrosine kinase-1) występują głównie na powierzchni komórek śródbłonka naczyniowego oraz na powierzchni monocytów i makrofagów [2, 10]. Z kolei receptory VEGFR-2 (Flk-1/KDR fetal liver kinase-1/ kinase domain receptor) są obecne przede wszystkim na powierzchni komórek endotelium, jak również megakariocytów, płytek krwi, komórek hematopoetycznych, osteoblastów oraz komórek macierzystych siatkówki. Receptory VEGFR-1 uczestniczą we wczesnych stadiach organogenezy, w procesie neowaskularyzacji oraz gojeniu się ran [10]. Odgrywają także istotną rolę w procesach wzrostu i różnicowania komórek śródbłonka oraz w mechanizmach naprawczych naczyń. Z kolei VEGFR-2 jest czynnikiem niezbędnym dla fizjologicznego rozwoju naczyń [25]. Stanowi on nie tylko główny regulator waskulogenezy podczas rozwoju embrionalnego, ale także podczas procesu angiogenezy u osobników dojrzałych. Receptor VEGFR-2 uważany jest za marker angiogenicznego fenotypu komórek śródbłonka we wczesnych etapach ich rozwoju [25]. Receptor ten, przenosząc sygnał mitogenny do wnętrza komórek śródbłonka naczyniowego, odgrywa decydującą rolę w proliferacji, migracji i różnicowaniu tych komórek. Przypuszcza się, że w wyniku jego aktywacji dochodzi także do zwiększenia przepuszczalności ścian naczyń krwionośnych. Dotychczasowe badania naukowe wykazały, że receptory dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu oprócz postaci błonowych mogą występować także w formie rozpuszczalnej [12, 15]. Pierwsza rozpuszczalna forma receptora svegfr-1 wykryta została w latach 90. w medium hodowlanym komórek HUVEC oraz w płynie owodniowym [15]. Dokładna budowa biochemiczna svegfr-1 nie została jeszcze do końca poznana. Wiadomo jednak, że cząsteczka tego receptora pozbawiona jest siódmej domeny immunoglobulinopodobnej oraz domeny śródbłonkowej i wewnątrzkomórkowej domeny kinazy tyrozynowej charakterystycznych dla receptorów VEGFR-1 i VEGFR-2 [15]. Przypuszcza się, że właśnie ta specyficzna budowa powoduje, że receptor VEGFR-1, łącząc się z każdą izoformą VEGF działa jak negatywny regulator procesu angiogenezy i zmniejsza dostępność tych izoform do śródbłonka naczyniowego [16]. W ten sposób hamowany jest efekt mitogenny naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu na komórki endotelium, co może prowadzić do hamowania powstawania nowych naczyń krwionośnych w guzach nowotworowych litych i powstawania przerzutów [22]. W ostatnich latach zidentyfikowano w ludzkim i mysim osoczu drugą rozpuszczalną postać receptora dla naczyniowośródbłonkowego czynnika wzrostu (svegfr-2) [20]. Biologiczna funkcja rozpuszczalnego receptora svegfr-2, podobnie jak receptora svegfr-1, nie została do tej pory w pełni wyjaśniona [20]. Przypuszcza się, iż forma ta może być naturalnym antagonistą naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu [20]. Rozpuszczalne receptory svegfr-2, przyłączając cząsteczkę VEGF prawdopodobnie hamują jej angiogenne działanie na komórki śródbłonka. Związanie czynnika wzrostu przed jego dotarciem do receptora zlokalizowanego na powierzchni komórek endotelialnych hamuje ich migrację i proliferację oraz ogranicza tworzenie nowych naczyń krwionośnych [15, 22]. Receptory svegfr-1 i svegfr-2 uważane są za fizjologiczne inhibitory procesów angiogenezy i waskulogenezy [15]. Celem pracy była ocena stężenia rozpuszczalnej formy receptora dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (svegfr-2) w surowicy kobiet chorych na pierwotnego raka 294

A. Thielemann i inni piersi w zależności od wybranych czynników rokowniczych, takich jak: wiek badanych kobiet, stopień zaawansowania klinicznego choroby, stopień złośliwości histologicznej nowotworu, stan okolicznych węzłów chłonnych pachowych i wielkość guza pierwotnego. Materiał i metody Stężenie rozpuszczalnej formy receptora dla naczyniowośródbłonkowego czynnika wzrostu (svegfr-2) oznaczono w surowicy 103 kobiet chorych na pierwotnego raka gruczołu piersiowego przed zabiegiem chirurgicznym, w wieku od 29 do 89 lat (średnia wieku 56 lat) leczonych w Oddziale Chirurgii Onkologicznej Katedry Onkologii Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. W każdym przypadku rozpoznanie kliniczne było ostatecznie potwierdzone badaniem histopatologicznym wykonanym w Zakładzie Patologii Nowotworów Katedry Onkologii Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu.* Grupę kontrolną stanowiły surowice 40 zdrowych kobiet w przedziale wiekowym od 24 do 75 lat (średnia wieku 47 lat). Na prowadzenie badań doświadczalnych autorzy pracy uzyskali zgodę Komisji Bioetycznej przy Uniwersytecie Medycznym im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu nr 135/09. Charakterystykę kliniczną chorych na raka piersi przedstawia tabela I. Krew do badań o objętości około 5 ml pobierano od pacjentek z żyły promieniowej na skrzep i po około 30 minutach zawartość probówki wirowano z szybkością 1000 x g w ciągu 10 minut. Po odwirowaniu surowicę zbierano do probówek w ilości 0,5 ml i zamrażano w temp. 20 0 C. Tak przygotowane próbki przechowywano w tej temperaturze do czasu wykonania badania, jednak nie dłużej niż 6 miesięcy. Stężenie rozpuszczalnej formy receptora dla naczyniowośródbłonkowego czynnika wzrostu (svegfr-2) w surowicy oznaczono metodą immunoenzymatyczną (ELISA) w oparciu o test Quantikine firmy R@D Systems. Analizę statystyczną przeprowadzono, stosując nieparametryczne testy U Manna-Whitneya i Kruskala-Wallisa. Hipotezy statystyczne przyjmowano na poziomie istotności statystycznej p <0,05. Obliczenia wykonano, korzystając z programu Statistica for Windows (StatSoft, Inc.2001). Wyniki W grupie referencyjnej średnie stężenie receptora svegfr-2 w surowicy wynosiło 5086 pg/ml, a w grupie 103 chorych na raka gruczołu piersiowego średni poziom svegfr-2 wyrażał się wartością rzędu 9452 pg/ml (tab. II). Mediana stężeń badanego receptora w grupie chorych na nowotwór złośliwy piersi była prawie 2-krotnie wyższa aniżeli w surowicy kontrolnej i różnice te cechowały się znamiennością statystyczną (tab. II). Analiza wyników wykazała, że podwyższone stężenia svegfr-2 występowały u 92 kobiet (89,3%), przy czym najwyższy odsetek podwyższonych wyników stężenia svegfr-2 otrzymano u 65 chorych w zakresie stężeń 6249-7411 pg/ml (tab. III). Dalsze wyniki badań wykazały, że wraz ze wzrostem złośliwości histologicznej raka wzrastała bez cech znamienności statystycznej mediana stężeń svegfr-2. Wykazano natomiast istotną różnicę pomiędzy wartościami svegfr-2 u kobiet zdrowych a poziomem tego receptora w grupie chorych niezależnie od stopnia złośliwości histologicznej (tab. II ). * Autorzy składają podziękowanie prof. dr. hab. med. Janowi Bręborowiczowi, Kierownikowi Zakładu Patologii Nowotworów i Katedry Onkologii Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu za ocenę histologiczną preparatów. Tabela I. Charakterystyka kliniczna pacjentek. CHARAKTERYSTYKA KLINICZNA ILOŚĆ PACJENTEK ODSETEK BADANYCH PACJENTEK [%] STOPIEŃ ZAAWANSOWANIA KLINICZNEGO CHOROBY WG TNM I 47 45,6 II 38 36,9 III 18 17,5 STAN OKOLICZNYCH WĘZŁÓW CHŁONNYCH PACHOWYCH pn0 51 49,5 pn1 52 50,5 WIELKOŚĆ GUZA PIERWOTNEGO pt <20 mm 54 52,4 20<50 mm 40 38,9 50 mm 9 8,7 STOPIEŃ ZŁOŚLIWOŚCI HISTOLOGICZNEJ G1 11 10,7 G2 50 48,5 G3 42 40,8 295

Ocena stężenia rozpuszczalnego receptora dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (svegfr-2)... Tabela II. Wartości receptora svegfr-2 u chorych na raka piersi w zależności od zaawansowania klinicznego choroby, stanu okolicznych węzłów chłonnych pachowych, wielkości guza i stopnia złośliwości histologicznej. Receptor svegfr-2 Charakterystyka kobiet chorych na raka piersi Średnie stężenie svegfr-2 Mediana stężenia svegfr-2 Zakres wartości stężeń svegfr-2 [ pg/ml ] Kontrola n=40 Chore na raka piersi n=103 Stopień zaawansowania klinicznego wg klasyfikacji TNM I n=47 II n=38 III n=18 Stan okolicznych węzłów chłonnych pn0 n=51 pn1 n=52 Wielkość guza pt < 20 mm n =54 pt 20< 50 mm n=40 pt 50 mm n= 9 Stopień złośliwości histologicznej G1 n= 11 G2 n= 50 G3 n= 42 5086±1162 5142 2455-6759 9452* ±4600 8758* 1006-21770 7093*±2748 6444* 1006-18820 9584*±3639 & 9380*& 1311-16721 15334*&# ± 5070 15902 *&# 2037-21770 7893*±3375 6755* 4003-19277 10983* ±51320 10174* 1006-21770 7735* ±3431 7276* 1006-19277 10705* ±4823 10731* 1311-21770 15180* ± 4583 14673* 9137-20754 7936*±2802 6755* 5274-13255 9007*±4045 8749* 1349-20315 10379*±5426 9422* 1006-21770 * różnica istotna statystycznie dla svegfr-2 w porównaniu z grupą kontrolną, przy p< 0,05 & różnica istotna statystycznie dla svegfr-2 w porównaniu z grupą kobiet w I stopniu zaawansowania choroby, przy p< 0,05 # różnica istotna statystycznie dla svegfr-2 w porównaniu z grupą kobiet w II stopniu zaawansowania choroby, przy p< 0,05 różnica istotna statystycznie dla svegfr-2 w porównaniu z grupą kobiet bez przerzutów do węzłów chłonnych pachowych, przy p< 0,05 różnica istotna statystycznie dla VEGFR-2 w porównaniu z grupą kobiet o wielkości guza<20 mm, przy p<0,05 różnica istotna statystycznie dla svegfr-2 w porównaniu z grupą kobiet o wielkości guza 20<50 mm, przy p<0,05 Mediana stężenia svegfr-2 wzrastała także wraz z zaawansowaniem procesu chorobowego u kobiet chorych na raka piersi (tab. II). Najwyższą medianę stężenia svegfr-2 zaobserwowano w surowicy kobiet w III stopniu zaawansowania klinicznego choroby i była ona istotnie wyższa aniżeli w stopniu I i II zaawansowania procesu nowotworowego (tab. II). Najwyższy odsetek podwyższonych wartości svegfr-2 (80,9%) uzyskano w grupie kobiet w I stopniu zaawansowania choroby nowotworowej w zakresie stężeń 6249-7411 pg/ml (tab. III). Różnice statystycznie znamienne wykazano także, kiedy porównywano stężenia svegfr-2 w surowicy kobiet z przerzutami do węzłów chłonnych pachowych z wartościami stężeń svegfr-2 u pacjentek bez przerzutów (tab. II). Im większa była wielkość guza nowotworowego, tym wyższe otrzymywano stężenie receptora svegfr-2 u chorych na raka piersi (tab. II ). Wykazano dodatnią korelację pomiędzy stężeniem receptora svegfr-2 a wielkością guza pierwotnego (r s =0,4846, p<0,05) (ryc. 1). U kobiet z wielkością guza poniżej 20 mm średnie stężenie svegfr-2 wyniosło 7735 pg/ml, u pacjentek z wielkością guza pomiędzy 20 i 50 mm wzrosło do wartości 10705 pg/ml, a przy wielkości guza powyżej 50 mm poziom tego receptora wyrażał się wartością 15180 pg/ml. Różnice te wykazywały cechy znamienności statystycznej. Istotność statystyczną otrzymano także pomiędzy stężeniem svegfr-2 w grupie kontrolnej a poziomem tego receptora w grupach pacjentek o różnych wielkościach guza (tab. II). Dyskusja Rak gruczołu piersiowego jest główną przyczyną zgonów spośród chorób nowotworowych w populacji kobiet w Polsce [5, 36, 37]. Nowotwór ten charakteryzuje się wysoką inwazyjnością oraz zdolnością tworzenia przerzutów do odległych narządów [30]. Procesem umożliwiającym komórkom rakowym wzrost oraz migrację do sąsiednich tkanek jest angiogeneza [11]. Uważa się, że istotną rolę w neowaskularyzacji odgrywają angiogenne czynniki wzrostu, a zwłaszcza naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF) [25]. Białko to działa stymulująco nie tylko na proliferację i migrację komórek endotelium, ale poprzez zwiększenie przepuszczalności naczyń krwionośnych, umożliwia przechodzenie komórek rakowych do przestrzeni pozanaczyniowej, zapoczątkowu- 296

A. Thielemann i inni Rycina 1. Korelacja pomiędzy stężeniem receptora svegfr-2 a wielkością guza u chorych na raka piersi. Tabela III. Procent podwyższonych wartości rozpuszczalnego receptora dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (svegfr-2) w surowicy chorych na raka gruczołu piersiowego. % podwyższonych wartości svegfr-2 w zakresie stężeń [pg/ml] < x + 1SD < 6248 x+1sd - x+2sd 6249 7411 x +2SD - x+3sd 7412-8574 > x +3SD > 8574 Rak piersi ( n=103) =11) 63,1% (n 1 =65) 18,4% (n 1 =19) 7,8% (n 1 =8) Stopień zaawansowania klinicznego choroby I (n=47) 0,0% (n 1 =7) 80,9% (n 1 =38) 2,1% (n 1 =1) 2,1% (n 1 =1) II (n=38) 0,0% (n 1 =3) 65,8% (n 1 =25) 26,3 % (n 1 =10) =0) III (n=18) 0,0% (n 1 =1) 11,1% (n 1 44,4% (n 1 =8) 38,9% (n 1 =7) Obecność przerzutów pn0 (n=51) pn1 (n=52) =6 ) 78,4% (n 1 =40) 48,1% (n 1 =25) 7,8% (n 1 =4) 28,9% (n 1 =15) 3,9% (n 1 11,5% (n 1 =6) Wielkość guza pt< 20 mm (n=54) pt 20 < 50 mm (n=40) pt 50 mm (n= 9) =9) =0) 72,2% (n 1 =39) 60,0% (n 1 =24) 22,2% (n 1 = 2) 9,3% (n 1 27,5% (n 1 =11) 33,3% (n 1 =3) 1,8% (n 1 =1) 12,5% (n 1 22,2% (n 1 Stopień złośliwości histologicznej G1 (n= 11) G2 (n= 50) G3 (n= 42) =0) =6) 81,8 % (n 1 =9) 7 =35) 5 =21) 18,2 % (n 1 14,0 % (n 1 =7) 23,8 % (n 1 =10) 0,0% (n 1 =0) 6,0 % (n 1 =3) 11,9% (n 1 (n) liczba chorych (n 1 ) liczba pacjentek, w surowicy których stężenie svegfr-2 mieściło się w zakresie<6248 lub 6249-7411 lub 7412-8574 lub>8574 pg/ml 297

Ocena stężenia rozpuszczalnego receptora dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (svegfr-2)... jąc tym samym powstawanie odległych przerzutów [16 ]. Podwyższone stężenie VEGF, zarówno w tkance nowotworowej, jak i płynach ustrojowych wykazano w wielu nowotworach, między innymi u chorych na raka jelita grubego, trzustki, nerki, gruczołu sterczowego i drobnokomórkowego raka płuc [8, 9, 28, 31, 32]. Wyniki badań doświadczalnych przeprowadzonych w Katedrze i Zakładzie Diagnostyki Laboratoryjnej wykazały istotnie wyższe stężenia VEGF u pacjentek chorych na raka gruczołu piersiowego w porównaniu z poziomem tej cytokiny w grupie referencyjnej [34]. Naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu wywiera swój biologiczny efekt na komórki endotelium dopiero po związaniu się ze swoistymi receptorami zlokalizowanymi głównie na powierzchni śródbłonka naczyniowego: VEGFR-1/ Flt-1 i VEGFR-2 / KDR/Flk-1 [34]. Oprócz tych form receptorów związanych z błoną komórkową receptory dla VEGF występują także w formie rozpuszczalnej jako svegfr-1 i svegfr-2 [35]. Przypuszcza się, że receptory te pełnią funkcję naturalnych inhibitorów angiogenezy, zmniejszają dostępność VEGF do śródbłonka naczyniowego i hamują powstawanie nowych naczyń krwionośnych [35]. Obecnie w wielu ośrodkach onkologicznych bada się wpływ zwłaszcza rozpuszczalnej formy receptora svegfr-2 na proces powstawania przerzutów. W kontrowersyjnych i nielicznych opublikowanych do tej pory badaniach wyższą aniżeli u osób zdrowych ekspresję receptora svegfr-2 wykryto u pacjentów chorych na raka żołądka i okrężnicy [7, 32]. Analiza danych z dostępnego piśmiennictwa skłania do postawienia pytania, jakie jest stężenie rozpuszczalnej formy receptora svegfr-2 w surowicy kobiet chorych na raka piersi i jaka jest jej przydatność oznaczania w prognozowaniu chorych na ten nowotwór? Liczba doniesień dotyczących tego problemu jest dotąd niewielka. Celem niniejszej pracy była ocena stężenia rozpuszczalnej formy receptora dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (svegfr-2) w surowicy kobiet chorych na pierwotnego raka gruczołu piersiowego uwzględniająca takie czynniki prognostyczne jak: stopień zaawansowania klinicznego choroby, stopień złośliwości histologicznej guza, stan okolicznych węzłów chłonnych pachowych oraz wielkość guza pierwotnego. Przeprowadzone badania wykazały, że rozpuszczalna forma receptora svegfr-2 występuje u wszystkich kobiet chorych na raka piersi. Wykazano także, że średnie stężenie tego receptora u badanych pacjentek było istotnie wyższe w porównaniu z grupą referencyjną. Mediana stężenia receptora svegfr-2 w grupie chorych na raka piersi była 1,5-krotnie wyższa aniżeli mediana uzyskana w grupie kontrolnej. Badania Jurczyńskiej i wsp. nie wykazały różnic istotnych statystycznie pomiędzy stężeniem VEGFR-2 w osoczu 41 chorych na raka kory nadnerczy a poziomem tego receptora w grupie referencyjnej [17]. Podobnych spostrzeżeń, ale u chorych na nowotwory przewodu pokarmowego, dokonał Myśliwiec i wsp. Z kolei Korzeniewska i wsp. uzyskali niższy poziom receptora svegfr-2 u chorych na raka nadnerczy w porównaniu z grupą kontrolną. Jednak wyniki badań tych autorów można tłumaczyć małą liczebnością grupy badanej (n=8) [19]. Podobne wyniki badań, ale u chorych na raka tarczycy, uzyskali Hedayati i wsp. [13]. Z kolei Czekierdowski i wsp. uzyskali wyższe stężenie svegfr-2 w surowicy pacjentek chorych na raka jajnika po menopauzie aniżeli przed menopauzą. Różnice te były bliskie istotności statystycznej [4]. Dongping i wsp., stosując półilościową metodę RT-PCR, wykazali u 80% pacjentów ekspresję receptora svegfr-2 w tkankach rakowych żołądka [7]. Padro i wsp., dokonując immunohistochemicznej analizy biopsji szpiku chorych na ostrą białaczkę szpikową, zaobserwowali znacząco wyższe poziomy VEGFR-2 w porównaniu z grupą kontrolną [24]. Z kolei Gershtein i wsp. wykazali u chorych na raka piersi podwyższony poziom svegfr-2 w przypadku 85% guzów [12]. Rola podwyższonego stężenia svegfr-2 w przebiegu choroby nowotworowej nie została jeszcze wyjaśniona. Jednak przy założeniu, że rozpuszczalne formy receptora naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu mogą hamować proces angiogenezy nowotworowej, można przypuszczać, że zwiększona biosynteza svegfr-2 przez komórki śródbłonka stanowi efekt obronny organizmu przed rozplemem komórek nowotworowych. Brak tworzenia nowych naczyń krwionośnych hamuje wzrost guza, podziały i migrację komórek rakowych do odległych narządów. Uznanym czynnikiem w ustalaniu rokowania i w wyborze odpowiedniego sposobu leczenia jest stopień zaawansowania choroby według klasyfikacji TNM. W badaniach własnych wykazano, że im wyższy był stopień zaawansowania klinicznego choroby, tym wyższy był poziom svegfr-2 w surowicy krwi kobiet chorych na raka gruczołu piersiowego. Różnicę statystycznie istotną uzyskano pomiędzy stężeniami svegfr-2 w grupie osób zdrowych, a stężeniami tego receptora u kobiet w I, II, III stopniu zaawansowania klinicznego. Różnicę statystycznie znamienną wykazano także, kiedy porównywano stężenia svegfr-2 w surowicy u kobiet chorych uzyskane w poszczególnych grupach zaawansowania klinicznego. Podobnych obserwacji, ale u chorych na raka jelita grubego dokonali Rmali i wsp. Badania ich wykazały znacząco wyższą ekspresję receptorów VEGFR-2 w stopniu C zaawansowania choroby wg Duke a w porównaniu ze stopniem A i B [26]. Czynnikiem prognostycznym, który powinien być uwzględniany w określaniu rokowania i w planowaniu dalszego leczenia chorego jest stopień złośliwości histologicznej. Klasyfikacja według Elstona i Ellisa, będąca modyfikacją klasyfikacji wg Blooma i Richardsona, znalazła szerokie poparcie wśród onkologów opracowujących wskazania i wymogi w diagnostyce patomorfologicznej. Stopień złośliwości histologicznej nowotworu ocenia się na podstawie obrazu histologicznego uwzględniającego między innymi zdolność tworzenia struktur cewkowatych, polimorfizm komórkowy oraz liczbę podziałów mitotycznych [23]. W badaniach własnych zaobserwowano, że im wyższy był stopień złośliwości histologicznej nowotworu, tym wyższe uzyskano wartości mediany stężeń receptora 298

A. Thielemann i inni svegfr-2 w surowicy krwi kobiet chorych na raka piersi. Wykazano istotną różnicę pomiędzy poziomem svegfr-2 u kobiet zdrowych a stężeniem receptora u kobiet chorych, niezależnie od stopnia złośliwości histologicznej nowotworu. Natomiast nie stwierdzono różnicy statystycznie istotnej pomiędzy stężeniami w poszczególnych grupach złośliwości histologicznej. Ryden i wsp., stosując metodę immunochemicznego barwienia tkanek guza u chorych na raka gruczołu piersiowego, wykazali istotną zależność między zawartością receptora VEGFR-2 w tkance rakowej a stopniem złośliwości histologicznej nowotworu. Badania te jednak dotyczyły receptorów błonowych związanych z powierzchnią śródbłonka naczyń [27]. Ważnym czynnikiem rokowniczym u chorych na raka piersi jest stan okolicznych węzłów chłonnych pachowych. W chirurgii raka gruczołu piersiowego węzły chłonne dołu pachowego mają najważniejsze znaczenie, bowiem obecność przerzutów nowotworowych w ich obrębie koreluje z ryzykiem wznowy nowotworowej. U pacjentek bez przerzutów ryzyko nawrotu choroby wynosi 20-30%, natomiast u chorych z obecnymi przerzutami aż 70% [5]. Badania własne wykazały istotnie wyższą medianę stężeń svegfr-2 w surowicy krwi kobiet chorych z przerzutami w stosunku do grupy chorych bez przerzutów. Odmiennego zdania byli Meunier-Carpentier i wsp., którzy nie wykazali korelacji pomiędzy ekspresją receptora VEGFR-2 w tkance chorych na raka piersi z obecnością i brakiem przerzutów [20]. Z kolei Takahashi i wsp. wykazali wyższą ekspresję receptora KDR w przerzutowym raku okrężnicy w przeciwieństwie do pacjentów bez przerzutów [33]. Nasiloną ekspresję VEGFR-2 u chorych na raka żołądka z obecnymi przerzutami do węzłów chłonnych i limfatycznych w porównaniu z pacjentami bez przerzutów uzyskali także Dongping i wsp [7]. Parametrem prognostycznym o udokumentowanej wartości jest wielkość guza pierwotnego. Wraz z wielkością guza wzrasta ryzyko progresji choroby i zgonu. U kobiet z wielkością guza powyżej 55 mm prawdopodobieństwo wystąpienia przerzutów wynosi 60%, natomiast u pacjentek z guzem o rozmiarach poniżej 5 mm ryzyko to wynosi tylko 5% [5]. W niniejszej pracy statystycznie istotną zależność wykazano dla stężenia svegfr-2 w grupie osób zdrowych a wynikami otrzymanymi u pacjentek o różnej wielkości guza. Różnicę statystycznie znamienną stwierdzono także pomiędzy wartościami svegfr-2 uzyskanymi w poszczególnych grupach badanych. Ze względu na brak doniesień naukowych na ten temat nie porównano wyników badań własnych z wynikami prac doświadczalnych innych autorów. W próbie podsumowania badań własnych można przyjąć, że oznaczanie stężenia rozpuszczalnej formy receptora dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu svegfr-2 w surowicy krwi kobiet chorych na raka piersi jest przydatne i stanowi uzupełnienie oceny klinicznej chorego, uwzględniając stopień zaawansowania klinicznego choroby, stan okolicznych węzłów chłonnych pachowych i wielkość guza pierwotnego. Udział receptora VEGFR-2 w procesie unaczynienia guzów nowotworowych sprawił, że stał się on ważnym celem terapii antyangiogennej. Szczególnie duże nadzieje wiąże się z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko receptorom VEGFR-2 i niskocząsteczkowych inhibitorów kinaz tyrozynowych blokujących proces autofosforylacji receptorów, co w konsekwencji prowadzi do obniżenia ich aktywności i zahamowania procesu neoangiogenezy. Spostrzeżenia te wymagają jednak dalszych badań zwłaszcza w dziedzinie biologii molekularnej i inżynierii genetycznej [16, 22]. Wnioski 1. W surowicy kobiet chorych na raka gruczołu piersiowe- go wykazano obecność rozpuszczalnej formy receptora svegfr-2. Stężenie svegfr-2 dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu było znamiennie wyższe w surowicy kobiet chorych na raka piersi aniżeli w grupie referencyjnej. 2. Dodatnia zależność pomiędzy stężeniem rozpuszczalnej formy receptora dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (svegfr-2) u kobiet chorych na raka gruczołu piersiowego a zaawansowaniem klinicznym procesu chorobowego może stanowić uzupełnienie oceny klinicznej kobiet chorych na ten nowotwór. Piśmiennictwo 1. Barańska P, Jerczyńska H, Pawłowska Z. Czynnik wzrostu śródbłonka naczyń budowa i funkcje. Post Bioch 2005; 51(1): 12-21. 2. Barleon B, Reusch P, Totzke F i wsp. Soluble VEGFR-1 secreted by endothelial cells and monocytes is present in human serum and plasma from healthy donors. Angiogenesis 2001; 4: 143-154. 3. Breier G. Functions of the VEGF/VEGF receptor system in the vascular system. Semin Thromb Hemost 2000; 26(5): 553-559. 4. Czekierdowski A, Czekierdowska S. Ocena stężeń czynników angiogennych VEGF, VEGfr-2 i VCAM-1 w surowicy krwi kobiet z nowotworami złośliwymi jajnika przed i po menopauzie. Przegl Menopauz 2007; 3: 128-133. 5. Dębniak B. Schorzenia gruczołów piersiowych w świetle wybranych aspektów okresu dzieciństwa i pokwitania. Ginekol Prakt 2006; 88, 2: 2-4. 6. Dias S, Choy M, Alitalo K i wsp. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-C signaling through FLT-4 (VEGFR-3) mediates leukemic cell proliferation, survival, and resistance to chemiotherapy. Blood 2002; 99, 6: 2179-2184. 7. Dongping L, Bingyuan W, Ruolan J. Expression of VEGF and its receptors Flt and KDR in gastric cancer. Chin J Dig Dis 2001; 2: 171-173. 8. Duff SE, Jeziorska M, Rosa DD i wsp. Vascular endothelial growth factors and receptors in colorectal cancer: implications for anti-angiogenic therapy. Eur J Cancer 2006; 42: 112-117. 9. Enjoji M, Nakamuta M, Yamaguchi K i wsp. Clinical significance of serum levels of vascular endothelial growth factor and its receptor in biliary disease and carcinoma. World J Gastroenter 2005; 11, 8: 1167-1171. 10. Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med 2003; 9: 669-676. 11. Folkmann J. Angiogenesis-dependent diseases. Semin Oncol 2001; 28: 536-542. 12. Gershtein ES, Scherbakov AM, Anurova OA i wsp. Phosphory- 299

Ocena stężenia rozpuszczalnego receptora dla naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (svegfr-2)... lated Akt1 in human breast cancer measured by direct sandwich enzyme-linked immunosorbent assay: Correlation with clinicopathological features and tumor VEGF-signaling system component levels. Int J Biol Markers 2006; 21(1):12-19. 13. Hedayati M, Kołomecki K, Pasieka Z i wsp. Ocena stężeń naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF) oraz jego rozpuszczalnych receptorów (svegfr-1, svegfr-2) w surowicy krwi u chorych z łagodnymi i złośliwymi guzami tarczycy. Endokr Pol 2005; (56) 3: 252-258. 14. Hicklin DJ, Ellis LM. Role of the Vascular Endothelial Growth Factor Pathway in Tumor Growth and Angiogenesis. J Clin Oncol 2005; 23, 5: 1011-1027. 15. Horning C, Weich HA. Soluble VEGF receptors. Angiogenesis 1999; 3: 33-39. 16. Hucz J, Szala S. Receptor VEGFR-2-cel terapii kierowanej w chorobach nowotworowych. Współcz Onkol 2006; 10: 506-514. 17. Jurczyńska J, Stępień T, Ławnicka H i wsp. Stężenia naczyniowo- śródbłonkowego czynnika wzrostu i rozpuszczalnych receptorów dla VEGF (R1 i R2) w obwodowej krwi żylnej u chorych z guzami nadnerczy leczonych operacyjnie. Endokr Pol 2009; 60: 9-14. 18. Kopff A, Żebrowski A. Angiogeneza, czynniki wzrostowe naczyń. Nowa Klin 2000; 7, 10: 1036-1039. 19. Korzeniewska M, Kołomecki K, Stępień H i wsp. Ocena stężeń wybranych czynników pro- i antyangiogennych we krwi u chorych z nieczynnymi hormonalnie guzami nadnerczy. Endokr Pol 2005; 1(56): 39 44. 20. Meunier-Carpentier S, Dales JP, Djemli A i wsp. Comparison of the prognosis indication of VEGFR-1 and VEGFR-2 and Tie2 receptor expression in breast carcinoma. Int J Oncol 2005; 26: 977-984. 21. Myśliwiec P, Pawlak K, Bandurski R i wsp. Soluble angiogenesis markers in gastric tumor patients. Folia Histochem Cytobiol 2009; 47(1): 81-86. 22. Neufeld G, Cohen T, Gengrinovitch S i wsp. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and its receptor. Faseb Journal 1999; 13: 9-22. 23. Olszewski WT. Patomorfologiczne czynniki prognostyczne w raku piersi. Nowa Med 2002; 119, 6: 2-5. 24. Padro T, Bieker S, Ruiz S. Overexpressin of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its cellular receptor KDR (VEGFR-2) in the bone marrow of patients with acute myeloid leukemia. Leukemia 2002; 16: 1302-1310. 25. Rajkumar T. Growth factors and growth factor receptors in cancer. Curr Sci 2001; 81, 5: 535-541. 26. Rmali KA, Puntis MCA, Jiang WG. Level of the expression of VEGF-A, B, C, D and their receptors (FLT-1, KDR and FLT-4) and its correlation with prognosis in patients with colorectal cancer. Int Cancer Res 2006; 2(1): 31-41. 27. Ryden L, Linderholm B, Nielsen NH. Tumor specific VEGF- A and VEGFR2/KDR protein are expressed in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2003; 82: 147-154. 28. Savropoulus NE, Bouropoulos C, Joachim IE. Prognostic significance of angiogenesis in superficial bladder cancer. Int Urol Nephrol 2004; 36(2) : 45-48. 29. Shibuya M, Claesson-Welsh L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res 2006; 312: 549-560. 30. Smolarz B, Romanowicz-Makowska H, Kozłowska E i wsp. Niestabilność mikrosatelitarna w raku piersi. Przegl Menopauz 2004; 6: 40-46. 31. Swidzińska E, Naumnik W, Chyczewska E. Angiogeneza i neoangiogeneza - znaczenie w raku płuca i innych nowotworach. Pneumonol Alergol Pol 2006; 74; 414-420. 32. Takahashi Y, Celary KR, Mai M i wsp. Significance of vessel count and Vascular Endothelial Growth Factor and its receptor (KDR) in Intestinal-type gastric cancer. Clin Cancer Res 1996; 2: 1679 1684. 33. Takahashi Y, Kitadai Y, Bucana CD. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptor, KDR, correlates with vascularity, metastasis, and proliferation of human colon cancer. Cancer Res 1995; 55: 3964-3968. 34. Thielemann A, Kopczyński Z, Grodecka-Gazdecka S i wsp. Ocena stężenia VEGF u chorych na raka gruczołu piersiowego. Diagn Lab 2005; 41: 155-164. 35. Veikkola T, Karkkainen M, Claessan Kielsh L i wsp. Regulation of Angiogenesis via Vascular Endothelial Growth Factor Receptors. Cancer Res 2000; 60: 203-212. 36. Wojciechowska U, Didkowska J, Tarkowski W i wsp. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2004 r. GUS, Warszawa 2006; 47-48. 37. Wypych A., Zejda JE. Potrzeba badań przesiewowych raka piersi w Polsce. Med Środow 2005; 8, 1: 47-52. Adres Autorów: Katedra i Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu ul. Łąkowa 1/2 61-878 Poznań tel.: (061) 854 90 33 faks: (061) 855 34 96 e-mail: anna.thielemann@oncology.am.poznan.pl (Praca wpłynęła do Redakcji: 2009-08-04) (Praca przekazana do opublikowania: 2009-12-04) 300