ĆWICZENIA Z GOSPODARKI ENERGETYCZNEJ, WODNEJ I ŚCIEKOWEJ CZĘŚĆ MIKROBIOLOGICZNA Ćwiczenie 4-5 Mikrobiologiczne kryteria oceny sanitarnej wody Część teoretyczna: 1. Kryteria jakości sanitarnej wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi. 2. Charakterystyka mikroorganizmów wskaźnikowych. 3. Drobnoustroje chorobotwórcze przenoszone drogą wodną. Bakterie chorobotwórcze i potencjalnie chorobotwórcze występujące w wodach powierzchniowych. Część praktyczna: I. Oznaczanie liczby bakterii psychro- i mezofilnych Jest to metoda hodowlana, w której zakłada się, że każda kolonia rozwija się z pojedynczej komórki bakteryjnej, pozwala więc na określenie liczby żywych, zdolnych do rozmnażania komórek bakterii znajdujących się w badanym materiale. Oznaczenie wykonuje się metodą płytkową Kocha, stosując posiew głębinowy na podłoże z agarem odżywczym. podłoże agar odżywczy; jałowe płytki Petriego; probówki z płynem do rozcieńczeń (po 9ml); jałowe pipety mikrobiologiczne (1ml). 1. Posiewu bakterii na agar odżywczy dokonuje się w dwóch równoległych powtórzeniach. Wodę wodociągową należy posiewać bezpośrednio, pobierając 1 ml wody i przenosząc na jałową płytkę Petriego. Dodatkowo posiewu dokonuje się z rozcieńczenia 10-1. Wodę powierzchniową posiewa się z rozcieńczeń 10-3 i/lub 10-5. 2. Płytki z zawiesiną bakterii (1ml) zalać upłynnionym na łaźni wodnej i ostudzonym do 45 C podłożem i po dokładnym wymieszaniu pozostawić do zastygnięcia. 3. Płytki odwrócić do góry dnem i jedną z nich wstawić do cieplarki o temperaturze 22 C (oznaczenie bakterii psychrofilnych), drugą do cieplarki o temperaturze 37 C (oznaczenie bakterii mezofilnych). 4. Po okresie inkubacji (72 h dla bakterii psychrofilnych i 24 h dla bakterii mezofilnych) policzyć wyrosłe kolonie. W razie stosowania rozcieńczeń próbki, liczbę koloni należy pomnożyć przez odwrotność rozcieńczenia. 5. Wynik badań wpisać do tabeli 1. Wynik oznaczenia podać jako liczbę bakterii psychrofilnych oraz liczbę bakterii mezofilnych w 1 cm 3 wody. 1
Tabela 1. Zestawienie wyników analizy bakteriologicznej wody do celów sanitarnych liczba bakterii psychrofilnych i mezofilnych. BADANA PRÓBA: Ogólna liczba bakterii Oznaczenie psychrofilnych mezofilnych Warunki hodowli podłoże temperatura i czas hodowli Liczba kolonii w ilości badanej próby Liczba bakterii w 1 cm 3 wody Wnioski:.. II. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą filtrów membranowych Metoda filtrów membranowych zalecana jest do badania wody zawierającej małe ilości poszukiwanych bakterii, a więc wody przeznaczonej do picia i potrzeb gospodarskich, może być również wykorzystana w badaniu wód zanieczyszczonych i ścieków po uprzednim rozcieńczeniu tych próbek. Wykrywanie bakterii grupy coli metodą filtrów membranowych polega na przesączeniu określonej objętości wody lub ścieków przez jałowy filtr i inkubacji na określonym podłożu. Bakterie w trakcie sączenia zostają zatrzymane na filtrze, który umieszcza się na pożywce wybiórczej, rozwijając się w czasie inkubacji tworzą na powierzchni filtra kolonie o typowym wyglądzie. zestaw do filtracji membranowej; płytki Petriego z podłożem Endo. 1. Przed użyciem aparat filtracyjny wysterylizować w autoklawie w temperaturze 120 C przez 15 minut. 2. Zmontować aparat filtracyjny (lejek umieścić w kolbie ssawkowej, połączonej z pompą próżniową, jałową pęsetą nałożyć na porowatą płytkę filtr membranowy). 3. Wlać odpowiednią ilość badanej wody do lejka (dla wody kranowej 100 ml, dla wód powierzchniowych 1 ml z dodatkiem 30 ml roztworu soli fizjologicznej). 4. Po przefiltrowaniu ściany lejka spłukać dokładnie ok. 20 ml jałowego roztworu soli fizjologicznej. 2
5. Zamknąć kranik i wyjałowioną pęsetą przenieść filtr membranowy na płytkę Petriego z podłożem Endo (powierzchnią z bakteriami ku górze), tak aby nie było pęcherzyków powietrza pomiędzy filtrem i podłożem. 6. Płytki Petriego z filtrami umieścić w cieplarce dnem ku górze i inkubować 24 h w 37 C. 7. Po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie, tj. ciemnoczerwone z metalicznym połyskiem (tzw. połysk fuksynowy). Jeżeli nie stwierdza się obecności typowych kolonii, należy przeprowadzić badania potwierdzające. III. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjno-probówkową (FP) Metodę fermentacyjną probówkową (FP) stosuje się do wykrywania bakterii grupy coli zarówno w wodzie przeznaczonej do spożycia, do potrzeb gospodarczych, jak również w wodach powierzchniowych i ściekach. Oznaczenie oparte jest na zdolności tych bakterii do fermentowania laktozy z wytworzeniem w podłożu kwasu (zmiana zabarwienia pożywki z fioletowej na żółtą) oraz gazu (w rurkach Durhama umieszczonych w probówkach). Metoda FP pozwala na określenie najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) bakterii coli w 100 ml badanej próbki, wyznaczonej z tablic na podstawie rachunku prawdopodobieństwa, oraz miana coli najmniejszej objętości badanej wody lub ścieków wyrażonej w ml, w której stwierdza się jeszcze obecność bakterii coli. Oznaczenie bakterii grupy coli wraz z identyfikacją Escherichia coli przeprowadza się w kilku etapach, na które składają się badania wstępne, potwierdzające, uzupełniające i ostateczne. podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolową podwójnie stężone z rurkami Durhama; probówki z płynem do rozcieńczeń (po 9ml). 1. Przy pomocy jałowej pipety posiewać nie rozcieńczoną wodę wodociągową w ilościach: 1 x 50 cm 3 oraz 5 x 10 cm 3 na podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolową podwójnie stężone. W probówkach powinny znajdować się rurki Durhama, w których zbierać się będzie wytworzony CO 2. 2. W przypadku spodziewanego większego zanieczyszczenia wody posiać mniejsze jej objętości: woda z wodociągów nie dezynfekowana, woda z basenu kąpielowego 5 x 10 cm 3, 1 x 1 cm 3, 1 x 0,1 cm 3 woda z urządzeń na potrzeby własne 2 x 10 cm 3, 2 x 1 cm 3, 2 x 0,1 cm 3 woda powierzchniowa 2 x 0,1-0,0001 cm 3 (rozc. 10-1 do 10-4 ) Objętości 1 cm 3 wody oraz 1 cm 3 z rozcieńczeń od 10-1 do 10-4 posiewać na podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolową o stężeniu normalnym. 3. Posiane próbki inkubować w temperaturze 37 C przez 24-48 h. 4. Za wynik dodatni przyjmuje się obecność gazu w rurkach Durhama lub występowanie pęcherzyków gazu w podłożu przy lekkim wstrząsaniu, a także 3
zmianę barwy z fioletowej na żółtą. Zmiany te wskazują na wzrost bakterii i fermentację laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu. Za wynik ujemny przyjmuje się brak gazu i zakwaszenia podłoża. Obecność niewielkich ilości gazu przy słabym zakwaszeniu lub braku zakwaszenia uznaje się za wynik wątpliwy, wymagający dalszego potwierdzenia. Jako wynik podać miano oraz NPL bakterii coli. IV. Badania potwierdzające obecność bakterii grupy coli Badanie potwierdzające posiew na podłoże Endo dokonuje się ze wszystkich dodatnich i wątpliwych hodowli badania wstępnego, uzyskanych po 24 i 48 h. 1. Za pomocą jałowej ezy pobrać niewielką ilość materiału z hodowli na podłożu laktozowym z purpurą bromokrezolową i posiać na podłoże Endo. 2. Inkubować w temperaturze 37 C przez 24 h. 3. Za wynik dodatni uważa się wzrost gładkich, ciemnoczerwonych koloni z charakterystycznym metalicznym (fuksynowym) połyskiem. 4. Niektóre szczepy bakterii grupy coli rosną na pożywce Endo w postaci jasno lub ciemnoróżowych kolonii, z ciemniejszym środkiem bez charakterystycznego połysku. Obecność tych nietypowych kolonii, przyjmuje się za wynik wątpliwy, wymagający dalszych badań. Badania te polegają na: ponownym stwierdzeniu zdolności wyizolowanego szczepu do fermentacji laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu (tzw. wtórna fermentacja laktozy) wybarwieniu komórek metodą Grama wykonaniu testu na osydazę cytochromową (pojawienie się intensywnego niebieskiego zabarwienia po dodaniu odczynnika na oksydazę, świadczy o obecności tego enzymu i jednocześnie wyklucza obecność bakterii grupy coli, które są oksydazoujemne. Gatunki z rodzaju Aeromonas (Pseudomonas aeruginosa) mogą również wytwarzać kwas i gaz z laktozy, jedynie pozytywna reakcja na oksydazę odróżnia je od bakterii grupy coli) V. Badania identyfikujące Escherichia coli metodą szeregu IMViC W przypadku konieczności ostatecznego potwierdzenia występowania Eschericia coli w wodzie, przeprowadza się następujące testy biochemiczne: stwierdzenie zdolności bakterii do wytwarzania indolu (I) z tryptofanu (wynik dodatni), reakcja z czerwienią metylową (M) (wynik dodatni), reakcja Voges-Proskaura (V), stwierdzająca obecność acetylometylokarbinolu (wynik ujemny), zdolność wykorzystywania cytrynianu (C) jako jedynego źródła węgla (wynik ujemny). 4
Badania identyfikujące Eschericia coli rozpoczyna się od wyizolowania czystych kultur z pożywki Endo. Hodowlę prowadzi się w temp. 37 C. Reakcje na indol, z czerwienią metylową i odczyn Voges-Proskaura przeprowadza się w probówkach, w których nastąpił wzrost bakterii, objawiający się zmętnieniem pożywki. 1. Wykrywanie indolu Wytwarzanie indolu sprawdza się po 24-godzinnej inkubacji w wodzie peptonowej z tryptofanem, dodając do hodowli po ściance probówki kilka kropli odczynnika Ehrlicha. Pojawienie się czerwonego zabarwienia na granicy płynów świadczy o obecności indolu, czyli o wyniku dodatnim. 2. Reakcja z czerwienią metylową Do hodowli (3,4-dniowej) na podłożu Clarka dodaje się 2 krople czerwieni metylowej. Wystąpienie wyraźnie czerwonej barwy wskazuje na zakwaszenie pożywki w wyniku rozkładu glukozy. Świadczy to o dodatnim wyniku reakcji. Kolor żółty określa wynik ujemny, a kolor pomarańczowy lub jasnoczerwony wynik wątpliwy. 3. Reakcja Voges-Proskaura Przeprowadzenie tej reakcji pozwala stwierdzić obecność acetylometylokarbinolu. Wykonuje się ją po 24-godzinnej hodowli na pożywce Clarka, dodając do hodowli 0,6 ml roztworu 6% α-naftolu rozpuszczonego w alkoholu absolutnym. Po dokładnym wymieszaniu dodać 0,4 ml 40 % KOH oraz 2 ml roztworu kreatyny. Zawartość probówki miesza się ponownie i wstawia do cieplarki na 30-45 minut. Wystąpienie intensywnego różowego lub czerwonego zabarwienia w górnej części płynu oznacza wynik dodatni, czyli obecność acetylometylokarbinolu. W przypadku wyniku ujemnego pożywka nie zmienia barwy lub jest zabarwiona na kolor lekko różowy. 4. Zdolność wykorzystania cytrynianu jako jedynego źródła węgla. Badania to przeprowadza się na pożywce Simmonsa. Hodowle inkubuje się przez 72 h. Brak wzrostu i zmiany zabarwienia ocenia się jako wynik ujemny, co jest cechą charakterystyczną dla Eschericia coli. Natomiast wzrost na pożywce oraz alkalizacja podłoża powodująca zmianę zabarwienia na niebieską określa się jako wynik dodatni, charakterystyczny dla innych pałeczek grupy coli. 5