PLATELIA CANDIDA Ag 96 TESTÓW 62798 TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA ANTYGENU MANNANOWEGO CANDIDA W SUROWICY 1
1- PRZEZNACZENIE TESTU Platelia Candida Ag jest mikropłytkowym, kanapkowym testem immunoenzymatycznym do oznaczania krążącego antygenu mannanowego Candida w surowicy 2- ZALECENIA DO STOSOWANIA TESTU Test Platelia Candida Ag nr kat. 62798 stosowany razem z testem Platelia Candida Ab/Ac/Ak, nr kat. 62799, pozwala na wcześniejsze diagnozowania i podnosi czułość procedury rozpoznania inwazyjnej kandydozy w procesie pełnego podejścia diagnostycznego, łączącego dane kliniczne z mykologicznymi oraz ewaluację endogennych i jatrogennych czynników ryzyka 12. Badanie serologiczne jest integralnym elementem klinicznego i laboratoryjnego monitorowania pacjentów jako pomoc w podjęciu decyzji o przebiegu leczenia. 3- ZASADA DZIAŁANIA Zakażenia wywołane przez Candida są najczęstszą formą zakażeń szpitalnych wywoływanych przez grzyby 2. Zakażenia układowe stanowią najcięższą postać z 30-70% śmiertelnością u pacjentów w immunosupresji 10. Diagnostykę tych zakażeń utrudnia brak swoistych dla zakażenia grzybiczego objawów oraz niska czułość wykrywania metodą hodowli, mimo postępów poczynionych na tym polu. Inwazyjną kandydozę w celu wdrożenia leczenia, diagnozuje się przeważnie na podstawie połączenia danych klinicznych, mykologicznych i wiedzy o istniejących czynnikach ryzyka 7. W tym kontekście, diagnostyka kandydoz układowych musi obejmować badania serologiczne jak też i bezpośrednie badanie mykologiczne. Detekcja krążącego w surowicy antygenu mannanowego wydaje się pomagać w skutecznym diagnozowaniu zakażeń Candida, zwłaszcza u pacjentów z immunosupresją. Mannan, jeden z wielu antygenów Candida, jest niekowalentnie związanym ze ścianą komórkową polisacharydem i stanowi on ponad 7% suchej masy komórek C. albicans 3. Antygen ten wydaje się być jednym z głównych markerów inwazyjnej kandydozy 6. 4- ZASADA OZNACZENIA Test Platelia Candida Ag jest jednostopniowym, kanapkowym oznaczeniem immunoenzymatycznym do jakościowego lub ilościowego wykrywania krążącego antygenu mannanowego w surowicy ludzkiej. W teście wykorzystano monoklonalne przeciwciało szczura (mab) EBCA-1, skierowane przeciwko α1-5 oligomannozydom Candida, scharakteryzowane wcześniej w badaniach 1, 5, 11. Przeciwciało to zastosowano do: Opłaszczenia studzienek mikropłytki i związania antygenu mannanowego. Wykrywania związanego na mikropłytce antygenu (mab znakowane peroksydazą). Próbki surowicy ogrzewa się w obecności EDTA, w celu rozpuszczenia kompleksów immunologicznych i wytrącenia białek surowicy, które mogą interferować w reakcji immunoenzymatycznej. Do dołków mikropłytki opłaszczonych przeciwciałem monoklonalnym dodawane są ogrzane próbki oraz koniugat. W obecności antygenu mannanowego tworzy się kompleks : przeciwciało monoklonalne mannan przeciwciało monoklonalne / peroksydaza. Paski płucze się, w celu usunięcia niezwiązanego materiału. Następnie, dodaje się roztwór substratu, który reaguje z kompleksami związanymi z dołkiem wywołując niebieskie zabarwienie. Po dodaniu kwasu, reakcja enzymatyczna zostaje zatrzymana, a zabarwienie z niebieskiego zmienia się na żółte. Wartości absorbancji próbek i kontroli określa się spektrofotometrycznie przy długości fali 450 i 620 nm. Test można wykonać dwiema metodami: Metoda ilościowa: Wykreślając krzywą wzorcową dla 4 standardów: 2.0, 1.0, 0.5 i 0.25 ng/ml. Wyniki zostaną wyrażone jako ilość mannanu w ng/ml badanej surowicy. Metoda jakościowa: Porównując OD próbek i OD tylko dwóch standardów 0.25 ng/ml i 0.5 ng/ml próbki zostają określone jako ujemne, pośrednie lub dodatnie. 2
5- SKŁAD ZESTAWU Test Platelia Candida Ag nr kat. 62798 Zestaw należy przechowywać w temperaturze 2-8 C. Przed użyciem wszystkie odczynniki przenieść do temperatury pokojowej (18-25 C). Natychmiast po użyciu wszystkie odczynniki powinny być przeniesione do temperatury 2-8 C. Niezużyte paski/płytki włożyć do opakowania, zamknąć szczelnie. Nie usuwać środka pochłaniającego wilgoć. Paski powinny być zużyte w ciągu 5 tygodni od pierwszego otwarcia opakowania. Rozcieńczony bufor do płukania można przechowywać przez 14 dni w temp. 2-8 C. Wszystkie pozostałe odczynniki po otwarciu są stabilne do daty ważności podanej na opakowaniu. Dostarczona ilość odczynników wystarcza do przeprowadzenia 96 testów w maksimum 6 seriach. Składnik Zawartość Ilość R1 Mikropłytka -96 dołków (12 pasków z 8 dołkami każdy) opłaszczonych przeciwciałem monoklonalnym EBCA-1 przeciwko mannanowi 1 płytka / 12 8 dołków R2 Stężony bufor do - bufor Tris NaCl (ph 7.4) 1 100 ml płukania (10x) - 1% Tween 20-0,01% tiomersal R3 Kontrola ujemna - Ludzka surowica nie zawierająca mannanu, używana jako kontrola ujemna oraz jako rozcieńczalnik surowicy wzorcowej do przygotowania standardów 1.0, 0.5 0.25 ng/ml do oznaczenia ilościowego, a także surowicy kalibracyjnej do oznaczenia jakościowego (patrz p.10 Procedura). - Jest ona ujemna pod względem przeciwciał anty-hiv-1 i anty-hiv-2 oraz antygenów HBs i przeciwciał anty-hcv. - Konserwant: < 0.1% azydek sodu 1 10 ml R4 Surowica kalibracyjna - Ludzka surowica zawierająca 2.0 ng/ml mannanu, używana do przygotowania standardów 1.0, 0.5 0.25 ng/ml do oznaczenia ilościowego, a także surowicy kalibracyjnej do oznaczenia jakościowego (patrz p.10 Procedura). - Jest ona ujemna pod względem przeciwciał anty-hiv-1 i anty-hiv-2 oraz antygenów HBs i przeciwciał anty-hcv. - Konserwant: < 0.1% azydek sodu R5 Kontrola Dodatnia - Ludzka surowica zawierająca mannan w ilości 0.5-1.5 ng/ml. - Jest ona ujemna pod względem przeciwciał anty-hiv-1 i anty-hiv-2 oraz antygenów HBs i przeciwciał anty-hcv. - Konserwant: < 0.1% azydek sodu R6 Koniugat (gotowy do użycia) R7 Roztwór do przygotowywania surowicy (gotowy do użycia) R8 Bufor substratu TMB (gotowy do użycia) R9 Chromogen: roztwór TMB R10 (stężony) Roztwór zatrzymujący(goto wy do użycia) -Monoklonalne przeciwciało anty-mannanowe znakowane peroksydazą. -Środek konserwujący: 0,01% tiomersal -kwaśny roztwór EDTA, bez środka konserwującego -Roztwór kwasu cytrynowego i octanu sodu ph 5.2-0,009% Nadtlenek wodoru -4% Dwumetylosulfotlenek (DMSO) -90% roztwór dwumetylosulfotlenku (DMSO) zawierający 0,6% tetrametylobenzydynę (TMB) * 2 x 2 ml 1 x 2 ml 1 8 ml 1 10,5 ml 1 60 ml 1 1 ml -1.5 N Kwas siarkowy (H 2 SO 4 ) 1 12 ml Folia adhezyjna Folia adhezyjna do mikropłytek 4 arkusze * Uwaga: TMB (tetrametylobenzydyna) - jest nierakotwórczym i niemutagennym substratem chromogennym dla peroksydazy. 3
6- HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY 1. Wyrób do diagnostyki in vitro. 2. Tylko do użytku profesjonalnego. 3. Nie zaleca się stosowania próbek innych niż ludzka surowica. 4. Surowica kontrolna dodatnia, surowica kalibracyjna i surowica kontrolna ujemna to inaktywowana termicznie surowica ludzka. Próbki zostały przebadane z użyciem zatwierdzonych we Francji testów i uznane za ujemne w kierunku: przeciwciał anty-hiv -1/2 i anty-hcv, jak również antygenu HBs. Ponieważ żadna ze znanych metod badawczych nie może dać całkowitej pewności, co do nieobecności czynników zakaźnych, z odczynnikami jak i z próbkami pacjentów należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym. Oznaczenia należy prowadzić z zastosowaniem środków ochrony właściwych dla patogenów przenoszonych drogą krwi. 5. W trakcie pracy z odczynnikami i próbkami używać rękawiczek i okularów ochronnych. Po wykonaniu testu umyć dokładnie ręce. 6. Nie pipetować ustami. 7. Nie palić, nie pić i nie jeść w miejscu pracy z próbkami i odczynnikami zestawu. 8. Unikać rozlania próbek i roztworów zawierających próbki. 9. Niezawierające kwasów rozlane płyny zawierające materiały biologiczne, należy wytrzeć dokładnie z stosując środek dezynfekujący. Jako środka dezynfekującego można użyć między innymi: 10% wybielacza (0.5% roztwór podchlorynu sodu), 70% etanolu lub 0.5% Wescodyne. W przypadku rozlania kwaśnych cieczy, należy je dokładnie wytrzeć bibułą lub zobojętnić dwuwęglanem sodu, a następnie przemyć środkiem dezynfekującym. Materiały użyte do wycierania rozlanych cieczy należy wyrzucić do pojemnika na odpady biologiczne. UWAGA: Nie wstawiać roztworów zawierających wybielacz do autoklawu. 10. Wszystkie próbki i materiały używane do wykonania testu należy traktować jak materiał potencjalnie zakaźny. Należy przestrzegać wszelkich wymagań odnośnie usuwania odpadów tego rodzaju. 11. Niektóre z odczynników zestawu zawierają jako konserwant azydek sodu. W połączeniu z ołowiem lub miedzią, azydek sodu może w kanalizacji tworzyć wybuchowe azydki metali. Usuwając do kanalizacji inaktywowane roztwory zawierające azydki należy spłukać zlew dużą ilością wody, aby zapobiec ich kumulacji. 12. UWAGA: Xi - drażniący 1.5 N kwas siarkowy (H 2 SO 4 ) i 90% DMSO (dwumetylosulfotlenek) R36/38: Substancja drażniąca dla oczu i skóry. S26-30: W razie kontaktu z oczami natychmiast przemyć dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza. Nigdy nie dodawać wody do tego produktu. 13. Należy unikać kontaktu skóry i błon śluzowych z buforem do substratu, chromogenem i roztworem zatrzymującym (możliwość zatrucia, podrażnienia i poparzenia). 14. Karta charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) jest dostępna na żądanie. 7- ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA 1. ZAMROŻONE PRÓBKI, PRZECHOWYWANE W NIEZNANYCH WARUNKACH MOGĄ DAWAĆ WYNIKI FAŁSZYWE DODATNIE Z POWODU ZANIECZYSZCZENIA GRZYBAMI I/LUB BAKTERIAMI. 2. Nie używać odczynników po upływie terminu ważności. 3. Z wyjątkiem stężonego buforu do płukania (R2) oraz roztworu zatrzymującego (R10), nie mieszać odczynników z różnych zestawów posiadających odmienny numer serii. 4. Przynajmniej 15 minut przed użyciem przenieść wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej. 5. Starannie mieszać odczynniki w trakcie rekonstytucji, unikając ich zanieczyszczenia. 6. Nie wykonywać testu w obecności reaktywnych par związków (kwasów, zasad, aldehydów) lub kurzu, które mogą pływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. 7. Do przygotowywania roztworu substrat-chromogen używać czystych, jednorazowych, polipropylenowych pojemników. W przypadku stosowania naczyń szklanych, należy przemyć je 1N kwasem solnym, a następnie wypłukać wodą destylowaną i wysuszyć. 4
8. Podczas ręcznego pipetowania kontroli i próbek, w celu uniknięcia zanieczyszczania materiałem pochodzącym z próbek, za każdym razem zmieniać jednorazową końcówkę. 9. W celu zapewnienia dokładnego przemycia dołków, należy przestrzegać zalecanej ilości cykli płukania oraz zwracać uwagę, czy studzienki są całkowicie napełniane a następnie opróżniane. Do przemywania nie należy stosować tryskawki. 10. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki między etapem płukania a dodawaniem kolejnego odczynnika. 11. Nigdy nie używać tych samych pojemników dla roztworów koniugatu i substratu. 12. Nie dopuszczać do kontaktu koniugatu i roztworu substrat-chromogen z metalami i jonami metali. 13. Przechowując odczynniki i wykonując oznaczenie, unikać ekspozycji koniugatu i roztworu substrat-chromogen na silne światło. Nie dopuszczać do kontaktu roztworów chromogenu z utleniaczami. 14. Unikać kontaktu roztworu zatrzymującego z utleniaczami. Nie dopuszczać do kontaktu roztworu zatrzymującego z metalami i jonami metali. 15. Ograniczyć do minimum kontakt roztworów (próbek, roztworu do przygotowywania próbek, koniugatu) oraz otwartych pojemników (mikropłytek, próbówek i pipet) z powietrzem. 16. Nie zlewać niezużytego koniugatu do oryginalnego opakowania. 17. Roztwór substrat-chromogen musi być bezbarwny. Pojawienie się wkrótce po rozcieńczeniu niebieskiego zabarwienia, wskazuje na zanieczyszczenie odczynnika i oznacza, iż nie może być on stosowany. Należy przygotować nowy odczynnik. 8- PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW I WARUNKI PRZECHOWYWANIA Mikropłytka (R1) Po otwarciu oryginalnego opakowania, studzienki mikropłytek zachowują zdolność reakcyjną przez 5 tygodni, o ile są przechowywane w temp. 2-8 C, w szczelnie zamkniętej torebce, w obecności pochłaniacza wilgoci. Stężony bufor do płukania (R2) Przygotować roboczy bufor do płukania dodając jedną część stężonego buforu do płukania do dziewięciu części jałowej wody dejonizowanej lub destylowanej. Roboczy bufor do płukania może być przechowywany przez 14 dni w temp. 2-8 C. Przygotowywać odpowiednią ilość buforu na całe badanie (80 ml buforu wystarcza na jeden pasek : 8 ml R2 + 72 ml wody destylowanej). Stężony odczynnik po otwarciu należy przechowywać w temp. +2-25 C, przy braku zanieczyszczenia, odczynnik jest stabilny do daty ważności podanej na opakowaniu. Roztwór roboczy substrat-chromogen (R8 + R9) Przygotować roztwór substrat-chromogen, dodając jedną część stężonego roztworu chromogenu TMB (R9) do 50 części buforu substratu TMB (R8). Przygotować 2 ml roztworu substrat-chromogen na każdy pasek: 40 µl (R9) + 2 ml (R8). Roztwór zachowuje trwałość przez 6 godz. przechowywany w ciemności, w temperaturze pokojowej (+18-25 C). Po otwarciu, odczynniki R8 i R9 przechowywane w temp. +2-8 C, przy braku zanieczyszczenia, są stabilne do daty ważności podanej na opakowaniu. Surowica kontrolna ujemna (R3), Surowica kalibracyjna (R4), Surowica kontrolna dodatnia (R5) Koniugat (R6), roztwór do przygotowywania surowicy (R7) i roztwór zatrzymujący (R10) Po otwarciu, odczynniki R3, R4, R5, R6, R7 i R10 przechowywane w temp. +2-8 C przy braku zanieczyszczenia, są stabilne do daty ważności podanej na opakowaniu. 9- POBIERANIE PRÓBEK Pobrać krew zgodnie z rutynową procedurą. Oznaczenie należy wykonywać z użyciem surowicy. Próbki surowicy muszą być wolne od spor grzybiczych i/lub bakterii. Próbówki z próbkami podczas przechowywania i transportu powinny być szczelnie zamknięte, bez dostępu powietrza. Przed oznaczeniem próbki w zamkniętej probówce, w temp. 2-8 C mogą być przechowywane przez 24 godziny. W celu dłuższego przechowywania surowicę należy zamrozić w -70 C. Próbki surowicy mogą być zamrażane/rozmrażane najwyżej 3 razy. Rozmrożone próbki przez oznaczeniem należy dokładnie wymieszać. Na oznaczenie nie wywiera wpływu obecność w surowicy 90 g/l albuminy, 200 mg/l bilirubiny, poziom lipemii 360 g/l trioleiny (trójglicerydów), ani hemoliza wynosząca do 200 g/l hemoglobiny. Nie używać surowicy pozbawionej dopełniacza 5
10- PROCEDURA Materiały dostarczone Patrz rozdział ODCZYNNIKI. Materiały potrzebne, ale niedostarczone w zestawie 1. Jałowa woda destylowana lub dejonizowana, do rozcieńczania buforu do płukania. 2. Bibuła. 3. Rękawice jednorazowego użytku. 4. Okulary ochronne. 5. Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu. 6. Pipety lub pipety wielokanałowe, nastawne lub stało-objętościowe, pozwalające odmierzać i dozować 50 µl, 100 µl, 300 µl i 1000 µl. 7. polipropylenowe mikroprobówki na 1.5ml ze szczelnymi korkami, odporne na temperaturę 120 C (bloki grzewcze) i 100 C (łaźnie wodne). Probówki z nakrętkami: 1.5 ml probówki stożkowe, Bio-Rad nr kat. 224-0100 lub zamiennik. Probówki z wieczkiem: EZ Micro Test Tubes, 1.5 ml, Bio-Rad nr kat. 223-9480 lub zamiennik. Blokada do wieczek mikroprobówek (VWR nr kat. 6054001 lub zamiennik). Blokada ma na celu zabezpieczenie probówki przed otwarciem w wyniku zmian temperatury i ciśnienia. Ułatwia także wyjmowanie probówek z bloków grzewczych i łaźni wodnych. 8. Wirówka laboratoryjna do mikroprobówek osiągająca przyspieszenie 10.000 g. 9. Jeżeli do ogrzewania próbek używany będzie termoblok: Termoblok. Polecane są następujące bloki grzejne: - model z jednym blokiem: Grant nr kat. QBD1 (VWR nr kat. 460-0074) - model z dwoma blokami: Grant nr kat. QBD2 (VWR nr kat. 460-0076) Wkład do termobloku: obydwu bloków grzewczych należy używać z Grant block nr kat. QB- E1 (VWR nr kat. 460-8517). Jeżeli do ogrzewania próbek używana będzie łaźnia wodna: Okrągły, pływający statyw pasujący do zlewki o pojemności 1 l. Łaźnia wodna nastawiona na 100 C 10. Wortex. 11. Inkubator mikropłytek nastawiony na temp. 37 ± 1 C. 12. Półautomatyczna lub automatyczna płuczka mikropłytek. 13. Czytnik mikropłytek wyposażony w filtry 450nm i 620 nm. 14. Pojemnik na odpady zakaźne. Uwagi proceduralne W celu walidacji każdej serii oznaczeń należy zawsze stosować surowice kontrolne: ujemną, dodatnią oraz standardy. Przygotowanie standardów Metoda ilościowa: R3 Surowica kontrolna ujemna Dla 1 serii R4 2 ng/ml surowica kalibracyjna R3 Surowica kontrolna ujemna Dla 6 serii(*) R4 2 ng/ml surowica kalibracyjna Standard 2 ng/ml - 300 μl - 2000 μl Standard 1 ng/ml 150 μl 150 μl 1000 μl 1000 μl Standard 0.5 ng/ml 225 μl 75 μl 1500 μl 500 μl Standard 0.25 ng/ml 262.5 μl 37.5 μl 1750 μl 250 μl (*) Objętości odczynników potrzebnych do oznaczenia 6 serii można przygotować uprzednio: Podzielić je na 300 μl dla każdego punktu i zamrozić w temp. -20 C. Przed użyciem rozmrozić w temp. pokojowej. Metoda jakościowa: Przygotować stężenia wzorcowe 0.5 ng/ml (surowica kalibracyjna) i 0.25 ng/ml, podobnie jak w powyższej tabeli. 6
Przygotowanie surowicy W ten sam sposób w tym samym czasie należy postępować ze wszystkimi surowicami, zarówno próbkami od pacjentów, jak i surowicami wzorcowymi: ujemną (R3), dodatnią (R5) i kalibracyjnymi o stężeniach mannanu 2.0, 1.0, 0.5 i 0.25 ng/ml: 1. Pobrać 300 μl surowicy badanej do próbówki Eppendorfa na 1.5 ml. 2. Dodać 100 μl roztworu do przygotowania surowicy (R7). 3. Intensywnie wymieszać na worteksie. Szczelnie zamknąć próbówki, aby się nie otworzyły podczas ogrzewania; używać próbówek z klipsem. Nie używać korków. 4. Praca z blokiem grzejnym: Ogrzewać probówki przez 6 minut w termobloku ustawionym na 120 C. Probówki umieścić w bloku dopiero po osiągnięciu zalecanej temperatury. (*) Praca z łaźnią wodną: W przypadku korzystania z łaźni wodnej: ogrzewać probówki przez 3 minuty w 100 C. Probówki umieścić w bloku dopiero po osiągnięciu zalecanej temperatury. (*) 5. Wyjąć ostrożnie gorące probówki z bloku lub łaźni wodnej i umieścić je w wirówce. Wirować probówki przy 10 000 g przez 10minut. Odwirować przy 10 000 g przez 10 minut. Do oznaczenia zebrać supernatant. 6. Oznaczenie wykonać zgodnie z poniższą procedurą. Po opracowaniu surowicy, oznaczenie wykonać tak szybko jak to jest możliwe. Jeżeli wskazane jest powtórzenia badania, należy opracować kolejną próbkę surowicy (*) Ścisłe przestrzeganie podanej temperatury, procedury oznaczenia oraz stosowanych materiałów ma istotne znaczenie dla powodzenia w wykonaniu testu. Nie polegaj na temperaturze podanej na wyświetlaczu, sprawdź wartość faktyczną sondą temperaturową (wykalibrowany termometr umieszczony w parafinie w eppendorfie): temperatura wewnątrz probówki, musi osiągnąć 120 C w bloku grzewczym, a w łaźni wodnej 100 C. UWAGI: Ponieważ procedura przygotowania próbek jest identyczna, próbki surowicy przygotowane w ten sposób mogą być wykorzystane do wykonania testu Platelia Aspergillus EIA. Nie przechowywać surowic (kontrolnych, standardów, ani próbek badanych) po ogrzaniu. Procedura testu EIA Oznaczenie należy wykonać ściśle wg opisanej procedury. Stosować się do zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. 1. Wszystkie odczynniki przenieść do temperatury pokojowej (18-25 C) przynajmniej 15 min. przed użyciem. 2. Przygotować bufor do płukania, roztwór substrat-chromogen oraz surowice kontrolne: dodatnią, ujemną i standardy. 3. Należy ustalić rozkład używanych dołków dla badanych surowic, standardów i kontroli. Metoda ilościowa: Surowice wzorcowe i roztwory standardów o stężeniach 0.25, 0.50, 1.0 i 2.0 ng/ml nanieść do studzienek wg planu: - A1: surowica kontrolna ujemna (R3) - B1: surowica kalibracyjna - standard 0.25 ng/ml - C1: surowica kalibracyjna standard 0.50 ng/ml - D1: surowica kalibracyjna standard 1.0 ng/ml - E1: surowica kalibracyjna standard 2.0 ng/ml (R4) - F1: surowica kontrolna dodatnia (R5) - G1: surowica kontrolna dodatnia (R5) Metoda jakościowa: Surowice wzorcowe i roztwory standardów o stężeniach 0.25 i 0.50 ng/ml nanieść do studzienek wg planu: - A1: surowica kontrolna ujemna (R3) - B1: surowica kalibracyjna - standard 0.25 ng/ml - C1: surowica kalibracyjna standard 0.50 ng/ml - D1: surowica kalibracyjna standard 0.50 ng/ml - E1: surowica kontrolna dodatnia (R5) 7
4. Wyjąć ramkę i paski (R1) z opakowania. Paski, które nie będą używane schować do opakowania z pochłaniaczem wilgoci i szczelnie zamknąć. 5. Przed użyciem koniugat (R6) wymieszać przez odwracanie. Dodać po 50 µl koniugatu (R6) do każdego dołka. Następnie, zgodnie z przygotowanym planem, do każdego dołka dodać po 50 µl supernatantu próbek. Nie dodawać próbek surowicy do dołków przed dodaniem koniugatu. 6. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną lub podobnym materiałem, tak by zapewnić ochronę przed odparowaniem płynu z dołków. Upewnić się, iż zamknięcie jest wodoszczelne i przykryta jest cała powierzchnia. 7. Inkubowa płytk w suchym inkubatorze mikropłytek przez 90 ± 5 min. w temp. 37 C (± 1 C). 8. Zdjąć przykrycie. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika na odpady z podchlorynem sodu). Wykonać 5 cykli płukania używając co najmniej 370 µl buforu do płukania. Po ostatnim płukaniu, odwracając i ostukując, osuszyć mikropłytkę z resztek płynu na bibule. 9. Unikając ostrego światła, szybko nanieść do studzienek po 200 ul roztworu substrat-chromogen (R8+R9). 10. Inkubować mikropłytkę w ciemności, przez 30 ± 5 min, w temp. pokojowej (18-30 C). Nie zakrywać folią adhezyjną. 11. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 ul roztworu zatrzymującego (R10). Roztwór ten dodawać w tej samej kolejności jak roztwór substratu. Wymieszać dokładnie. 12. Wytrzeć starannie spód każdej mikropłytki. 13. Odczytać gęstość optyczną dla każdego dołka przy 450 nm (z filtrem referencyjnym 620 nm). Wyniki odczytać w ciągu 30 min. od zatrzymania reakcji. 11- KONTROLA JAKOŚCI (KRYTERIA WAŻNOŚCI) Metoda ilościowa Podczas każdego testu, dla każdej mikropłytki należy oznaczyć surowice kontrolne. Na podstawie pomiaru gęstości optycznej standardów należy uzyskać następujące wyniki: Wartość gęstości optycznej: 0.300<OD dla standardu 0.5 ng/ml < 1.1000 Proporcje: OD dla standardu 2.0 ng/ml / OD dla standardu 0.5 ng/ml > 2.1 OD dla standardu 1.0 ng/ml / OD dla standardu 0.5 ng/ml > 1.25 OD dla standardu 0.25 ng/ml / OD dla standardu 0.5 ng/ml < 0.85 OD (R3) / OD dla standardu 0.25 ng/ml 0.80 Stężenie mannanu: Stężenie R5: stężenie podane na fiolce ± 20%. Metoda jakościowa Oznaczenie wartości odcięcia cut-off (CO) Zsumuj wartości OD odczytane dla studzienek z surowicą kalibracyjną 0.5 ng/ml i podziel uzyskaną wartość przez 2. Kryteria walidacji 0.300 < CO < 1.1000 OD R5 > CO OD R3 < 0.7 CO OD dla standardu 0.25 ng/ml < 0.85 CO 12- INTERPRETACJA WYNIKÓW Metoda ilościowa Krzywa wzorcowa Krzywą wzorcową wyznaczają cztery punkty, odpowiadające wartościom OD uzyskanym dla czterech standardów: 2.0, 1.0, 0.5, i 0.25 ng/ml, będących rozcieńczeniami dodatniej surowicy kalibracyjnej (R4). Do krzywej nie włącza się wartości surowic kontrolnych, dodatniej (R5) i ujemnej (R3). Aby uzyskać najwyższą precyzję, należy ekstrapolując wykreślić krzywą sigmoidalną na osi X zaznaczając stężenie antygenu w ng/ml (skala logarytmiczna), na osi Y wartości odczytu OD (skala liniowa). Jeśli czytnik nie posiada opcji definiowania skali, należy wykreślić krzywą łączącą punkty odpowiadające wartościom standardów. 8
Oznaczenie stężenia mannanu w badanej surowicy Dla każdej badanej surowicy wartość stężenia mannanu w ng/ml należy odczytać z krzywej wzorcowej. Interpretacja wyników Próbki o stężeniu mannanu dokładnie poniżej 0.25 ng/ml (C < 0.25): wynik ujemny w kierunku antygenu mannanowego. Próbki o stężeniu mannanu pomiędzy 0.25 a 0.5 ng/ml (0.25 C < 0.5): wynik pośredni w kierunku antygenu mannanowego. Próbki o stężeniu mannanu powyżej lub równy 0.5 ng/ml (C 0.5): wynik dodatni w kierunku antygenu mannanowego. Wartości standardów użytych do wykreślenia krzywej wzorcowej nie pozwalają na dokładne oznaczenie stężenia mannanu powyżej 2.5 ng/ml. Aby dokładnie oznaczyć stężenie antygenu w wysoce dodatniej surowicy należy powtórzyć oznaczenie po rozcieńczeniu badanej próbki 1:5 w surowicy ujemnej (R3). Uwaga: Platelia Candida Ag jest testem pomocniczym w diagnozowaniu aspergilozy inwazyjnej. Wyniki dodatnie w teście Platelia Candida Ag należy interpretować w połączeniu z wynikami innymi badań diagnostycznych, takich jak: posiewy bakteriologiczne, badanie histologiczne bioptatów i badania radiologiczne. Zalecane jest wykonywanie regularnych badań skryningowych u pacjentów z grupy wysokiego ryzyka aby podnieść czułość procedury i uchwycić wczesną konwersję na wynik dodatni testu. Metoda jakościowa Interpretacja wyników OD próbki < OD standardu 0.25 ng/ml: wynik ujemny w kierunku antygenu mannanowego. OD 0.25 ng/ml OD próbki < CO: wynik pośredni w kierunku antygenu mannanowego. OD próbki CO: wynik dodatni w kierunku antygenu mannanowego. Uwaga: Platelia Candida Ag jest testem pomocniczym w diagnozowaniu aspergilozy inwazyjnej. Wyniki dodatnie w teście Platelia Candida Ag należy interpretować w połączeniu z wynikami innymi badań diagnostycznych, takich jak: posiewy bakteriologiczne, badanie histologiczne bioptatów i badania radiologiczne. Uwaga: Aby wyrazić nasilenie antygenemii przy wyniku dodatnim, można obliczyć index (I): I = OD próbki dodatniej / Cut-off Indeks pozwala na pół-ilościowe wyrażenie wyniku. 13- OGRANICZENIA TESTU 1. Wynik ujemny nie wyklucza rozpoznania inwazyjnej kandydozy ze względu na bardzo niskie stężenie i szybkie eliminowanie mannanu w toku zakażenia. 2. Ujemny wynik w teście wykrywającym antygen należy interpretować jednocześnie z wynikiem testu wykrywającego przeciwciała anty-mannanowe: u pacjentów dodatnich w kierunku przeciwciał anty-mannanowych trudniej jest wykryć antygen mannanowy (patrz p. 14 Charakterystyka testu). 3. Na wykrywanie antygenu mannanowego w surowicy ma wpływ ilość testów wykonanych dla danego pacjenta 4. Regularne monitorowanie pacjentów wysokiego ryzyka oraz wykonywanie testu na obecność przeciwciał anty-mannanowych podnosi czułość procedury i pozwala uchwycić wczesną konwersję na wynik dodatni. 4. Wykonując oznaczenie na obecność antygenu mannanowego należy przestrzegać procedury wykonania testu oraz zasad interpretacji wyników testu Platelia Candida Ag. Przed przystąpieniem do wykonania testu użytkownik powinien dokładnie zapoznać się z instrukcją obsługi. W szczególności dokładnie przestrzegana musi być procedura pipetowania próbek i odczynników, płukania płytki oraz czasy inkubacji. 5. Dodanie próbki lub odczynnika niezgodnie z procedurą może prowadzić do uzyskania wyników fałszywie ujemnych. Należy rozważyć powtórzenie badania dla kolejnej próbki w przypadku podejrzenia inwazyjnej kandydozy w oparciu o dane kliniczne lub wystąpienia błędu proceduralnego. 9
6. W przypadku nieostrożnego obchodzenia się z mikropłytkami lub technicznie nieprawidłowego pipetowania odczynników, możliwe jest zanieczyszczenie dołków z ujemną próbką pacjenta na skutek przelania się do nich zawartości dołka z kontrolą lub próbką dodatnią. 7. W niezależnych badaniach, wykazano wystąpienie reakcji krzyżowych u pacjentów przyjmujących infuzje niektórych serii plazmy hydroksyetyloskrobiowej (jak np. 6% Hesteril), stosowanej w leczeniu zaburzeń krążenia takich, jak hipowolemia, wstrząs krwotoczny czy wstrząs septyczny. 14- CHARAKTERYSTYKA TESTU 14.1. Metoda ilościowa A. Powtarzalność Powtarzalność wewnątrz-testowa: 4 surowice (1 ujemna, 12 pośrednia o stężeniu antygenu 0.48 ng/ml, oraz 2 dodatnie o stężeniu 0.69 ng/ml i 1.39 ng/ml) oznaczono w 30 powtórzeniach. Współczynnik zmienności wynosił odpowiednio 3.1%, 6.9%, 9.1% i 7.0%. Powtarzalność pomiędzy-testowa: Przez 5 tygodni w 5 seriach oznaczano 8 surowic ujemnych i 4 dodatnie. Współczynnik zmienności wynosił < 20% dla wartości uzyskiwanych dla surowic dodatnich i < 13% dla surowic ujemnych. B. Oznaczenia kliniczne SWOISTOŚĆ Swoistość testu, uzyskana dla różnych populacji pacjentów, przedstawia tabela: Kategoria pacjentów Liczba pacjentów (surowic) Stężenie antygenu (ng/ml) C < 0.25 0.25 C < 0.5 C 0.5 Nie hospitalizowani 184 (184) 183 (99.5%) 1 (0.5%) Hospitalizowani, nie Skolonizowani, z: - Choroba Crohna 151 (200) 52 (52) 140 (92.8%) 49 (98.1%) 7 (4.6%) 3 (1.9%) - Wrzodziejące zapalenie jelit 43 (43) 41 (95.4%) 1 (2.3%) - Aspergiloza 26 (35) 23 (88.5%) 1 (3.8%) - Pneumocystoza 4 (4) 4 (100%) - Kryptokokoza 13 (13) 12 (92.3%) 4 (2.6%) 1 (2.3%) 2 (7.7%) 1 (7.7%) Hospitalizowani skolonizowani Candida sp. 41 (160) 35 (85.3%) 4 (9.8%) 2 (4.9%) CZUŁOŚĆ W celu oceny czułości testu Platelia Candida Ag przeprowadzono badania w trzech szpitalach akademickich na terenie Francji. Wykonano badania retrospektywne dla 106 pacjentów (366 surowic) z różnych oddziałów szpitalnych (chirurgia, hematologia, OIOM, oparzeniowy, itp.). Drożdżaki z rodzaju Candida były izolowane z krwi tych pacjentów lub z głębokich materiałów klinicznych 8, 9. Dla badanej populacji, uzyskano dla testu Platelia Candida Ag ogólną czułość 51.5% (wyłączając 6.6% pacjentów, dla których uzyskano wynik pośredni pomiędzy 0.25 i 0.5 ng/ml). Czułość testu różniła się w zależności od izolowanego gatunku Candida: Gatunek Liczba pacjentów (liczba surowic) Czułość C 0.5 C 0.5 0.25 C < 0.5 C.tropicalis 10 (72) 70.0 % 70.0 % C.glabrata 12 (31) 58.3% 58.3 % C.albicans 64 (208) 52.5 % 60.3 % C.kefyr 2 (5) 50.0 % 50.0 % C.parapsilosis 10 (29) 37.5 % 57.5 % C.krusei 8 (21) 20.0 % 20.0 % 10
Wyniki badania czułości ściśle korelują z liczbą i częstością badania próbek 13. Badania te wykazały celowość jednoczesnego wykonywania testu Platelia Candida Ag oraz testu na obecność przeciwciał anty-mannanowych Platelia Candida Ab/Ac/Ak. Pacjentów można zakwalifikować do dwóch znacznie różniących się populacji (Test Chi-kwadrat, p. < 0.0005); wyniki przedstawiono w poniższej tabeli: Pacjenci bez przeciwciał anty-mannanowych: czułość wykrywania antygenu dla testu Platelia Candida Ag wynosiła 78.8% podczas zakażenia C.albicans i 66.6% podczas zakażenia innymi gatunkami Candida. Pacjenci z dodatnim wynikiem testu na obecność przeciwciał anty-mannanowych: antygen mannanowy jest znacznie trudniejszy do wykrycia. Czułość testu Platelia Candida Ag Gatunek powodujący zakażenie Pacjenci ujemni Pacjenci dodatni Wszyscy pacjenci (liczba pacjentów) Anty-mannan Ab Anty-mannan Ab Wszystkie gatunki łącznie (106) 66.6% 17.5% 51.5% C.albicans (64) 78.8% 16.1% 52.5% Podczas interpretacji wyników testu Platelia Candida Ag należy uwzględnić status immunologiczny pacjenta w stosunku do antygenu mannanowego Candida. Połączenie dwóch testów zapewnia czułość 84.8% (wyłączając 6.6% pacjentów z pośrednią odpowiedzią). Tym niemniej, niektórzy pacjenci wykazują dodatni wynik dla obu markerów na różnych etapach tego samego epizodu zakażenia. Prognoza rozwoju infekcji może być łączona z równowagą pomiędzy antygenemią a wytwarzaniem przeciwciał anty-mannanowych (3). 14.2 Metoda jakościowa A. Powtarzalność Powtarzalność wewnątrz-testowa: 4 surowice (1 ujemna, 1 pośrednia index = 0.95, oraz 2 dodatnie index = 1.24 i 2.00) oznaczono w 30 powtórzeniach. Współczynnik zmienności wynosił odpowiednio 3.1%, 7.2%, 5.9% i 5.9%. Powtarzalność pomiędzy-testowa: W 6 seriach oznaczano 10 surowic dodatnich i 4 pośrednie. Współczynnik zmienności wynosił < 15% dla wartości uzyskiwanych dla surowic dodatnich i pośrednich. B. Oznaczenia kliniczne SWOISTOŚĆ CZUŁOŚĆ Przyjmując, iż uzyskane w metodzie ilościowej stężenia 0.5 ng/ml lub < 0.25 ng/ml, odpowiadają kolejno wynikowi dodatniemu i ujemnemu w metodzie jakościowej, własności testu dla metody jakościowej są identyczne jak dla ilościowej. 16- KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Wszystkie produkty Bio-Rad są przygotowane zgodnie z naszym systemem jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Każda seria ostatecznego produktu podlega oznaczeniu kontrolnemu i jest dopuszczona do użytku, jeśli spełnia wymagane kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii. 11
17- BIBLIOGRAFIA 1. FAILLE, C., D. W. MACKENZIE, J. C. MICHALSKI, and D. POULAIN. 1992. Evaluation of an enzyme immunoassay using neoglycolipids constructed from Candida albicans oligomannosides to define the specificity of anti- mannan antibodies. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11: p. 438-46. 2. FRIDKIN, S. K. and W. R. JARVIS. 1996. Epidemiology of nosocomial fungal infections. Clin. Microbiol. Rev. 9: p. 499-511. 3. FUKAZAWA, Y. 1989. Antigenic structure of Candida albicans. Immunochemical basis of the serologic specificity of the mannans in yeasts. Immunol. Ser. 47: p. 37-62. 4. HERENT, P., D. STYNEN, F. HERNANDO, J. FRUIT, and D. POULAIN. 1992. Retrospective evaluation of two latex agglutination tests for detection of circulating antigens during invasive candidosis. J. Clin. Microbiol. 30: p. 2158-64. 5. JACQUINOT, P. M., Y. PLANCKE, B. SENDID, G. STRECKER, and D. POULAIN. 1998. Nature of Candida albicans-derived carbohydrate antigen recognized by a monoclonal antibody in patient sera and distribution over Candida species. FEMS Microbiol. Lett. 169: p. 131-8. 6. PONTON, J., M. MORAGUES, and G. QUINDOS. 2002. Non-Culture-Based Diagnostics, p. 395-425. In R. Calderone (ed.), Candida and Candidiasis. ASM Press, Washington, D.C. 7. RUHNKE, M. and G. MASCHMEYER. 2002. Management of mycoses in patients with hematologic disease and cancer - review of the literature. Eur. J. Med. Res. 7: p. 227-235. 8. SENDID, B., J. L. POIROT, M. TABOURET, A. BONNIN, D. CAILLOT, D. CAMUS, and D. POULAIN. 2002. Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p. 433-442. 9. SENDID, B., M. TABOURET, J. L. POIROT, D. MATHIEU, J. FRUIT, and D. POULAIN. 1999. New enzyme immunoassays for sensitive detection of circulating Candida albicans mannan and antimannan antibodies: useful combined test for diagnosis of systemic candidiasis. J. Clin. Microbiol. 37: p. 1510-1517. 10. TIRABOSCHI, I. N., J. E. BENNETT, C. A. KAUFFMAN, J. H. REX, C. GIRMENIA, J. D. SOBEL, and F. MENICHETTI. 2000. Deep Candida infections in the neutropenic and nonneutropenic host: an ISHAM symposium. Med. Mycol. 38 Suppl 1: p. 199-204. 11. TRINEL, P. A., C. FAILLE, P. M. JACQUINOT, J. C. CAILLIEZ, and D. POULAIN. 1992. Mapping of Candida albicans oligomannosidic epitopes by using monoclonal antibodies. Infect. Immun. 60: p. 3845-51. 12. VERWEIJ, P. E., D. POULAIN, T. OBAYASHI, T. F. PATTERSON, D. W. DENNING, and J. PONTON. 1998. Current trends in the detection of antigenaemia, metabolites and cell wall markers for the diagnosis and therapeutic monitoring of fungal infections. Med. Mycol. 36 Suppl 1: p. 146-155. 13. YERA, H., B. SENDID, N. FRANCOIS, D. CAMUS, and D. POULAIN. 2001. Contribution of serological tests and blood culture to the early diagnosis of systemic candidiasis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 20: p. 864-870. 12
Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette Frankrike Tlf.: +33 (0) 1 47 95 60 00 03/2008 Faks: +33 (0) 1 47 41 91 33 880018 12