PLATELIA CANDIDA Ag PLUS TESTÓW TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA ANTYGENU MANNANOWEGO CANDIDA W LUDZKIEJ SUROWICY LUB OSOCZU

Transkrypt

1 PLATELIA CANDIDA Ag PLUS TESTÓW TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA ANTYGENU MANNANOWEGO CANDIDA W LUDZKIEJ SUROWICY LUB OSOCZU 1- PRZEZNACZENIE TESTU Platelia Candida Ag jest mikropłytkowym, kanapkowym testem immunoenzymatycznym do oznaczania krążącego antygenu mannanowego Candida w ludzkiej surowicy lub osoczu. 2- ZALECENIA DO STOSOWANIA TESTU Rozpoznanie inwazyjnej kandydozy musi być oparte na łącznej detekcji przeciwciał i krążącego antygenu 13. Test Platelia Candida Plus Ag nr kat stosowany razem z testem Platelia Candida Ab Plus, nr kat , pozwala na wcześniejsze diagnozowanie 11 i podnosi czułość procedury rozpoznania inwazyjnej kandydozy w procesie pełnego podejścia diagnostycznego, łączącego dane kliniczne z mykologicznymi oraz ewaluację endogennych i jatrogennych czynników ryzyka 10,13,14. Badanie serologiczne jest integralnym elementem klinicznego i laboratoryjnego monitorowania pacjentów jako pomoc w podjęciu decyzji o przebiegu leczenia WARTOŚĆ KLINICZNA Zakażenia wywołane przez Candida są najczęstszą formą zakażeń szpitalnych wywoływanych przez grzyby; kandydemie są czwartym, co do częstości czynnikiem etiologicznym szpitalnych zakażeń krwi 12, 15,16. Zakażenia układowe stanowią najcięższą postać infekcji Candida, z 30-70% śmiertelnością u pacjentów w immunosupresji. Diagnostykę tych zakażeń utrudnia brak swoistych dla zakażenia grzybiczego objawów oraz niska czułość wykrywania metodą hodowli krwi, mimo postępów poczynionych na tym polu. Inwazyjną kandydozę, w celu wdrożenia leczenia, diagnozuje się przeważnie w oparciu o dane łączone 2. W tym kontekście, diagnostyka kandydoz układowych musi obejmować badania serologiczne, jak też i bezpośrednie badanie mykologiczne. Detekcja krążącego w surowicy antygenu mannanowego wydaje się pomagać w diagnostyce pacjentów z grup ryzyka wystąpienia inwazyjnej kandydozy 10,13,14. Podstawowymi czynnikami ryzyka są neutropenia będąca wynikiem chemioterapii lub leczenia immunosupresyjnego (rak, onkohematologia, transplantacje) 4,10, stosowanie antybiotyków o szerokim spektrum, cewniki żylne, żywienie pozajelitowe, dializa nerkowa, zaimplantowane protezy (u pacjentów hospitalizowanych w szpitalnych oddziałach ogólnej i chirurgicznej intensywnej terapii) 5,13,16. Mannan, jeden z wielu antygenów Candida, jest niekowalentnie związanym ze ścianą komórkową polisacharydem i stanowi on ponad 7% suchej masy komórek C. albicans. Antygen ten wydaje się być jednym z głównych markerów inwazyjnej kandydozy. Regularne monitorowanie pacjentów z grup ryzyka, łączenie wyników wykrywania krążącego antygenu mannanowego i przeciwciał przeciw-mannanowi, stanowią pomoc w rozpoznaniu inwazyjnej kandydozy 9,10, ZASADA OZNACZENIA Platelia Candida Ag Plus jest jednostopniowym, kanapkowym testem immunoenzymatycznym służącym do wykrywania krążącego antygenu mannanowego w osoczu lub surowicy ludzkiej. W teście wykorzystano monoklonalne przeciwciało szczura (mab) EBCA-1, skierowane przeciwko α1-5 oligomannozydom Candida, scharakteryzowane wcześniej w badaniach 13,14. Przeciwciało to zastosowano do: Opłaszczenia studzienek mikropłytki i związania antygenu mannanowego. Wykrywania związanego na mikropłytce antygenu (mab znakowane peroksydazą). Próbki surowicy ogrzewa się w obecności EDTA, w celu rozpuszczenia kompleksów immunologicznych i wytrącenia białek surowicy, które mogą interferować w reakcji immunoenzymatycznej. Do dołków mikropłytki opłaszczonych przeciwciałem monoklonalnym dodawane są ogrzane próbki oraz koniugat. Po inkubacji w 37 C paski są przepłukiwane w celu usunięcia niezwiązanego materiału. W obecności antygenu mannanowego tworzy się kompleks: przeciwciało monoklonalne mannan przeciwciało monoklonalne / peroksydaza. Następnie, dodaje się roztwór substratu, który reaguje z kompleksami związanymi z dołkiem wywołując niebieskie zabarwienie. Po dodaniu kwasu, reakcja enzymatyczna zostaje zatrzymana, a zabarwienie z niebieskiego zmienia się na żółte. Wartości absorbancji próbek i kontroli określa się spektrofotometrycznie przy długości fali 450 i 620 nm. 5- SKŁAD ZESTAWU Dostarczona ilość odczynników wystarcza do przeprowadzenia 96 testów w maksimum 9 seriach. Na opakowaniu zestawu podano informacje szczegółowe dotyczące warunków przechowywania i termin ważności odczynników. Przed użyciem wszystkie odczynniki przenieść do temperatury pokojowej (18-25 C). Natychmiast po użyciu wszystkie odczynniki powinny być przeniesione do temperatury 2-8 C. Niezużyte paski/płytki włożyć do opakowania, zamknąć szczelnie. Nie usuwać środka pochłaniającego wilgoć. 1

2 Składnik Zawartość Ilość R1 Microplate Mikropłytka 1 96 dołków (12 pasków z 8 dołkami każdy) opłaszczonych przeciwciałem monoklonalnym EBCA-1 przeciwko mannanowi R2 Concentrated Stężony bufor do płukania (20x) 1 70 ml Washing Solution (20x) - bufor Tris NaCl (ph 7.4) - 2% Tween 20 R3 Calibrator 0 Kalibrator 0 pg/ml (gotowy do użycia): 1 x 2 ml - Bufor Tris_NaCl-trehaloza, niezawierający oczyszczonego mannanu Candida albicans R4a Calibrator 62.5 Kalibrator 62,5 pg/ml (gotowy do użycia): 1 x 2 ml - Bufor Tris_NaCl-trehaloza, - oczyszczony mannan Candida albicans R4b Calibrator 125 Kalibrator 125 pg/ml (gotowy do użycia): 1 x 2 ml - Bufor Tris_NaCl-trehaloza, - oczyszczony mannan Candida albicans R4c Calibrator 250 Kalibrator 250 pg/ml (gotowy do użycia): 1 x 2 ml - Bufor Tris_NaCl-trehaloza, - oczyszczony mannan Candida albicans R4d Calibrator 500 Kalibrator 500 pg/ml (gotowy do użycia): 1 x 2 ml - Bufor Tris_NaCl-trehaloza, - oczyszczony mannan Candida albicans R5 Positive Control Kontrola dodatnia: 2 x 1.5 ml - Ludzka surowica zawierająca mannan. R6 Conjugate Koniugat (gotowy do użycia) 1 17 ml - Monoklonalne przeciwciało anty-mannanowe znakowane peroksydazą. - purpura bromokrezolowa R7 Sample Treatment Roztwór do przygotowywania surowicy (gotowy do użycia) 1 10,5 ml Solution - kwaśny roztwór EDTA, bez środka konserwującego R9 Chromogen TMB Chromogen roztwór TMB (gotowy do użycia) 1 28 ml - roztwór 3,3 5,5 - tetrametylobenzydyny (< 0.1%), H 2 O 2 (< 1.0%) R10 Stopping Solution Roztwór zatrzymujący (gotowy do użycia) 1 28 ml - 1 N Kwas siarkowy (H 2 SO 4 ) Folia adhezyjna do mikropłytek 4 arkusze 6- HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY 1. Wyrób do diagnostyki in vitro. 2. Tylko do użytku profesjonalnego. 3. Nie zaleca się stosowania próbek innych niż ludzka surowica lub osocze. 4. Surowica kontrolna dodatnia R5 jest przygotowywana z wykorzystaniem surowicy ludzkiej, która została przebadana z użyciem oznakowanych CE testów i uznana za ujemną w kierunku: przeciwciał anty-hiv -1/2 i anty-hcv, jak również antygenu HBs. Ponieważ żadna ze znanych metod badawczych nie może dać całkowitej pewności, co do nieobecności czynników zakaźnych, z odczynnikami jak i z próbkami pacjentów należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym. Oznaczenia należy prowadzić z zastosowaniem środków ochrony właściwych dla patogenów przenoszonych drogą krwi. 5. W trakcie pracy używać odzieży i okularów ochronnych oraz jednorazowych rękawiczek (rekomendowane są nielateksowe rękawiczki syntetyczne), operując odczynnikami i próbkami pacjentów postępować zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Po wykonaniu testu umyć dokładnie ręce. 6. Nie pipetować ustami. 7. Nie palić, nie pić i nie jeść w miejscu pracy z próbkami i odczynnikami zestawu. 8. Unikać rozlania próbek i roztworów zawierających próbki 9. Niezawierające kwasów rozlane płyny zawierające materiały biologiczne, należy wytrzeć dokładnie z stosując środek dezynfekujący. Jako środka dezynfekującego można użyć między innymi: 10% wybielacza (0.5% roztwór podchlorynu sodu), 70% etanolu lub 0.5% Wescodyne. W przypadku rozlania kwaśnych cieczy, należy je dokładnie wytrzeć bibułą lub zobojętnić dwuwęglanem sodu, a następnie przemyć środkiem dezynfekującym. Materiały użyte do wycierania rozlanych cieczy należy wyrzucić do pojemnika na odpady biologiczne. UWAGA: Nie wstawiać roztworów zawierających wybielacz do autoklawu. 10. Rozlane płyny zawierające kwasy należy dokładnie osuszyć (wytrzeć) lub zneutralizować dwuwęglanem sodu, spłukać i wytrzeć. Jeżeli zawierają materiał biologiczny, przetrzeć powierzchnię jednym z dezynfektantów chemicznych. 2

3 11. Wszystkie próbki i materiały używane do wykonania testu należy traktować jak materiał potencjalnie zakaźny. Należy przestrzegać wszelkich wymagań odnośnie usuwania odpadów tego rodzaju. 12. UWAGA: Poniżej podano listę potencjalnych zagrożeń chemicznych właściwych dla substancji zawartych w odczynnikach zestawu (patrz rozdział 5 - Odczynniki): Xi - drażniący Niektóre odczynniki zawierają ProClin 300 <1.5% R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. S : Nie wdychać oparów/aerozolu. Unikać kontaktu ze skórą. Stosować rękawice ochronne. Ten materiał oraz jego opakowanie muszą być usuwane jako odpady niebezpieczne. 13. Karta charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) jest dostępna na żądanie. 7- ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA 1. ZAMROŻONE PRÓBKI, PRZECHOWYWANE W NIEZNANYCH WARUNKACH MOGĄ DAWAĆ WYNIKI FAŁSZYWE DODATNIE Z POWODU ZANIECZYSZCZENIA GRZYBAMI I/LUB BAKTERIAMI. 2. Nie używać odczynników po upływie terminu ważności. 3. Nie mieszać odczynników z różnych zestawów posiadających odmienny numer serii z, wyjątkiem stężonego buforu do płukania (R2, na etykiecie opis 20x w kolorze zielonym), chromogenu (R9, na etykiecie opis TMB w kolorze turkusowym) oraz roztworu zatrzymującego reakcję (R10, na etykiecie opis 1N w kolorze czerwonym), przy założeniu, iż używane są dokładne ekwiwalenty i ten sam numer partii odczynnika jest używany w serii oznaczeń. UWAGA: Stężony bufor do płukania (R2, na etykiecie opis 20x w kolorze zielonym), chromogen (R9, na etykiecie opis TMB w kolorze turkusowym) oraz roztwór zatrzymujący reakcję (R10, na etykiecie opis 1N w kolorze czerwonym), przy założeniu, iż używane są dokładne ekwiwalenty i ten sam numer partii odczynnika jest używany w serii oznaczeń. UWAGA: Stężony bufor do płukania (R2, na etykiecie opis 20x w kolorze zielonym) nie może być mieszany z roztworem do płukania R2, na etykiecie opis 10x w kolorze niebieskim dostarczanym w innych zestawach firmy Bio-Rad. 4. Przynajmniej 30 minut przed użyciem przenieść wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej ( C). 5. W przypadku stosowania naczyń szklanych, należy dokładnie je umyć, a następnie wypłukać wodą destylowaną, rekomendowana jest praca z naczyniami jednorazowego użytku. 6. Sprawdzać pipety i inny sprzęt laboratoryjny pod kątem dokładności i poprawności działania. 7. Starannie rekonstytuować roztwór R2, unikać zanieczyszczenia. 8. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na obecność metali i jonów metali. Konsekwentnie, nie dopuszczać do kontaktu jakichkolwiek elementów metalowych z roztworami zawierającymi koniugat lub substrat. 9. Podczas ręcznego pipetowania kontroli i próbek, w celu uniknięcia zanieczyszczania materiałem pochodzącym z próbek, za każdym razem zmieniać jednorazową końcówkę. 10. W celu zapewnienia dokładnego przemycia dołków, należy przestrzegać zalecanej ilości cykli płukania oraz zwracać uwagę, czy studzienki są całkowicie napełniane a następnie opróżniane. Płukanie musi być wykonywane z użyciem płuczki mikropłytek. 11. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki między etapem płukania a dodawaniem kolejnego odczynnika. 12. Nigdy nie używać tych samych pojemników dla roztworów koniugatu i substratu. 13. Przechowując odczynniki i wykonując oznaczenie, unikać ekspozycji koniugatu i roztworu substrat-chromogen na silne światło. Nie dopuszczać do kontaktu roztworów chromogenu z utleniaczami. 14. Roztwór chromogenu R9 musi być bezbarwny. Pojawienie się niebieskiego zabarwienia, wskazuje na zanieczyszczenie odczynnika i oznacza, iż nie może być on stosowany 15. Unikać kontaktu roztworu zatrzymującego reakcję z czynnikami utleniającymi, metalami lub jonami metali. 16. Nie zlewać niezużytego koniugatu do oryginalnego opakowania. 8- PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW I WARUNKI PRZECHOWYWANIA Mikropłytka (R1) Każda ramka zawierająca dwanaście pasków zapakowana jest w torebkę. Otwórz torebkę używając nożyczek, tnij tuż poniżej zgrzewu. Wyjmij ramkę z torby, niezużyte paski umieść ponownie w torbie. Uważnie zamknij torbę i umieść ją w temp. 2-8 C. Po otwarciu oryginalnego opakowania, studzienki mikropłytek zachowują zdolność reakcyjną przez 8 tygodni, o ile są przechowywane w temp. 2-8 C, w szczelnie zamkniętej torebce, w obecności pochłaniacza wilgoci. Stężony bufor do płukania (R2) Przygotować roboczy bufor do płukania dodając 50 ml R2 do 950 ml wody destylowanej. Na płukanie pełnej płytki 12 pasków potrzeba 400 ml buforu (nie licząc martwej objętości stosownej dla używanego sprzętu). Roboczy bufor do płukania może być przechowywany przez 14 dni w temp C. Stężony odczynnik po otwarciu należy przechowywać w temp C, przy braku zanieczyszczenia, odczynnik jest stabilny do daty ważności podanej na opakowaniu. Kalibrator 0 (R3), Kalibrator 62.5 (R4a), Kalibrator 125 (R4b), Kalibrator 250 (R4c), Kalibrator 500 (R4d): Kalibratory są gotowe do użycia. Po otwarciu, odczynniki R3, R4a, R4b, R4c, R4d, przechowywane w temp C, przy braku zanieczyszczenia, są stabilne 8 tygodni. 3

4 Surowica kontrolna dodatnia (R5) Surowica dodatnia R5 musi być opracowana cieplnie z kwaśnym roztworem EDTA (R7), tak jak próbki pacjentów, by możliwa była kontrola etapu ogrzewania. Po otwarciu, odczynnik R5 przechowywany w temp C, przy braku zanieczyszczenia, jest stabilny 8 tygodni. Koniugat (R6), roztwór do przygotowywania surowicy (R7), chromogen (R9) Odczynniki gotowe do użycia. Po otwarciu, odczynniki R6, R7 i R9 przechowywane w temp C, przy braku zanieczyszczenia, są stabilne 8 tygodni. Roztwór zatrzymujący (R10) Po otwarciu, odczynnik R10 przechowywany w temp C, przy braku zanieczyszczenia, jest stabilny do daty ważności podanej na opakowaniu. 9- PRÓBKI 1. Oznaczenie należy wykonywać z użyciem surowicy lub osocza pobranego na EDTA, cytrynian lub heparynę. 2. Postępuj zgodnie z poniższymi wytycznymi dotyczącymi ogrzewania, obróbki i przechowywania próbek krwi: - Pobrać krew zgodnie z rutynową procedurą, - Dla próbek surowicy, pozwolić na pełne wykrzepienie przed zwirowaniem, - Probówki przez cały czas przechowywać szczelnie zamknięte, - Po zwirowaniu, oddzielić surowicę lub osocze i przechowywać w szczelnie zamkniętej probówce - Próbki mogą być przechowywane w temp. w temp. 2-8 C, jeżeli oznaczenie będzie wykonane w ciągu 5 dni - Jeżeli oznaczenie będzie wykonane w ciągu 5 dni, próbki należy zamrozić w temp. -20 C (lub -80 C). - Próbki surowicy lub osocza, mogą być zamrażane/rozmrażane najwyżej 5 razy. Rozmrożone próbki przez oznaczeniem należy dokładnie wymieszać 3. Na oznaczenie nie wywiera wpływu obecność w surowicy 90 g/l albuminy lub 120 g/l białka całkowitego, 200 mg/l bilirubiny wolnej lub 200 mg/l bilirubiny związanej, poziom lipemii 30 g/l trioleiny (trójglicerydów), lub 5 g/l cholesterolu, ani hemoliza wynosząca do 2 g/l hemoglobiny. 4. Nie ogrzewać surowicy lub osocza. 10- PROCEDURA Materiały dostarczone Patrz rozdział ODCZYNNIKI. Materiały potrzebne, ale niedostarczone w zestawie 1. Jałowa woda destylowana lub dejonizowana, do rozcieńczania buforu do płukania. 2. Bibuła. 3. Rękawice jednorazowego użytku. 4. Okulary ochronne. 5. Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu. 6. Pipety lub pipety wielokanałowe, nastawne lub stało-objętościowe, pozwalające odmierzać i dozować 10 µl do 1000 µl oraz 1 ml, 2 ml i 10 ml. 7. Polipropylenowe mikroprobówki na 1.5ml ze szczelnymi korkami, odporne na temperaturę 120 C (bloki grzewcze) i 100 C (łaźnie wodne). Probówki z nakrętkami: 1.5 ml probówki stożkowe, Bio-Rad nr kat lub zamiennik. Probówki z wieczkiem: EZ Micro Test Tubes, 1.5 ml, Bio-Rad nr kat lub zamiennik. 8. Blokada do wieczek mikroprobówek (VWR nr kat lub zamiennik). Blokada ma na celu zabezpieczenie probówki przed otwarciem w wyniku zmian temperatury i ciśnienia. Niewielki uchwyt ułatwia także wyjmowanie probówek z bloków grzewczych i łaźni wodnych zapobiegający tym samym ryzyku poparzenia. 9. Wirówka laboratoryjna do mikroprobówek 1.5 ml osiągająca przyspieszenie g. 10. Jeżeli do ogrzewania próbek używany będzie termoblok: Termoblok. Polecane są następujące bloki grzejne: - model z jednym blokiem: Grant nr kat. QBD1 (VWR nr kat ) - model z dwoma blokami: Grant nr kat. QBD2 (VWR nr kat ) Wkład do termobloku: obydwu bloków grzewczych należy używać z Grant block nr kat. QB-E1 (VWR nr kat ). Jeżeli do ogrzewania próbek używana będzie łaźnia wodna: Okrągły, pływający statyw pasujący do zlewki o pojemności 1 l. Łaźnia wodna nastawiona na 100 C 11. Cylindry miarowe do odmierzania 25 ml, 50 ml, 100 ml, 1000ml. 12. Pojemnik na odpady zakaźne. 13. Wortex. 14. Inkubator mikropłytek nastawiony na temp. 37 ± 1 C*. 15. Półautomatyczna lub automatyczna płuczka mikropłytek.* 16. Czytnik mikropłytek wyposażony w filtry 450nm i 620 nm.* *W celu uzyskania szczegółowych informacji o polecanym sprzęcie skontaktuj się z serwisem technicznym firmy Bio-Rad. 4

5 Przygotowanie próbek W ten sam sposób w tym samym czasie co próbki pacjentów, należy opracować surowicę dodatnią (R5). Kalibratory R3, R4a, R4b, R4c, R4d są gotowe do użycia i nie należy ich poddawać poniższej procedurze. 1. Pobrać 300 μl surowicy badanej oraz kontroli R5 do próbówki Eppendorfa na 1.5 ml. 2. Dodać 100 μl roztworu do przygotowania surowicy (R7). 3. Intensywnie wymieszać na worteksie. Szczelnie zamknąć próbówki, aby się nie otworzyły podczas ogrzewania. Nie nakłuwać wieczka. 4. Praca z blokiem grzejnym: Ogrzewać probówki przez 6 minut w termobloku ustawionym na 120 C. Probówki umieścić w bloku dopiero po osiągnięciu zalecanej temperatury. (*) Praca z łaźnią wodną: W przypadku korzystania z łaźni wodnej: ogrzewać probówki przez 3 minuty w 100 C. Probówki umieścić w bloku dopiero po osiągnięciu zalecanej temperatury. (*) 5. Wyjąć ostrożnie gorące probówki z bloku lub łaźni wodnej i umieścić je w wirówce. Odwirować przy g przez 10 minut. 6. Do oznaczenia zebrać supernatant. Oznaczenie wykonać zgodnie z poniższą procedurą. Po opracowaniu surowicy, oznaczenie wykonać w ciągu 2 godzin od opracowania cieplnego próbek. (*) Ścisłe przestrzeganie podanej temperatury, procedury oznaczenia oraz stosowanych materiałów ma istotne znaczenie dla powodzenia w wykonaniu testu. Nie polegaj na temperaturze podanej na wyświetlaczu, sprawdź wartość faktyczną sondą temperaturową (wykalibrowany termometr umieszczony w parafinie w eppendorfie): temperatura wewnątrz probówki, musi osiągnąć 120 C w bloku grzewczym, a w łaźni wodnej 100 C. UWAGI: Ponieważ procedura przygotowania próbek jest identyczna, próbki surowicy przygotowane w ten sposób mogą być wykorzystane do wykonania testu Platelia Aspergillus EIA. Nie przechowywać próbek (kontroli dodatniej ani próbek badanych) po ogrzaniu. Procedura testu EIA Oznaczenie należy wykonać ściśle wg opisanej procedury. Stosować się do zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. - Wszystkie odczynniki przenieść do temperatury pokojowej (18-30 C) przynajmniej 30 min. przed użyciem. - W celu walidacji każdej serii oznaczeń, zawsze stosować należy wszystkie kalibratory i surowicę kontrolną dodatnią. - Przygotować bufor do płukania, roztwór substrat-chromogen oraz surowice kontrolne: dodatnią, ujemną i standardy. Oznaczenie: 1. Należy ustalić rozkład używanych dołków dla badanych surowic, kalibratorów i kontroli wg planu: - A1: surowica kontrolna dodatnia R5 (supernatant ogrzanej kontroli) - B1: kalibrator 500 pg/ml (R4d) - C1: kalibrator 250 pg/ml (R4c) - D1: kalibrator 125 pg/ml (R4b) - E1: kalibrator 62.5 pg/ml (R4a) - F1: kalibrator 0 (R3) A R5 S3 S11 B R4d S4 C R4c S5 D R4b S6 E R4a S7 F R3 S8 G S1 S9 H S2 S10 2. Wyjąć ramkę i paski (R1) z opakowania. Paski, które nie będą używane schować do opakowania z pochłaniaczem wilgoci i szczelnie zamknąć. 3. Dodać po 100 µl supernatantu próbek i 100 µl kontroli R5 do odpowiednich dołków. 4. Następnie dodać po 100 μl kalibratorów R4d, R4c, R4b, R4a, zgodnie z układem płytki. Uwaga: można kontrolować dodawanie kalibratorów na tym etapie: odpowiednie dołki będą przyjmowały różne odcienie od pomarańczowego (R4d) do jasno żółtego (R3). 5. Przed użyciem wymieszać zawartość fiolki R6 przez odwracanie. Jeżeli używa się pipety wielokanałowej, należy odmierzyć jedynie objętość konieczną do wykonania serii oznaczeń: na każde 2 paski po 8 studzienek konieczne jest 2.5 ml koniugatu. 6. Dodaj po 100 μl koniugatu R6 do dołków. 7. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną lub podobnym materiałem, tak by zapewnić ochronę przed odparowaniem płynu z dołków. Upewnić się, iż zamknięcie jest wodoszczelne i przykryta jest cała powierzchnia. 8. Inkubować płytkę w suchym inkubatorze mikropłytek przez 90 ± 10 min. w temp. 37 C (± 1 C). 5

6 9. Przygotować roboczy roztwór buforu do płukania (patrz punkt 8). 10. Zdjąć przykrycie. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika na odpady z podchlorynem sodu). Wykonać 5 cykli płukania korzystając z płuczki mikropłytek (używając co najmniej 800 µl buforu do płukania). Po ostatnim płukaniu, odwracając i ostukując na bibule, osuszyć mikropłytkę z resztek płynu. 11. Unikając ostrego światła, szybko nanieść do studzienek po 200 ul roztworu chromogenu (R9). 12. Inkubować mikropłytkę w ciemności, przez 30 ± 5 min, w temp. pokojowej (19-25 C). Nie zakrywać folią adhezyjną. 13. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 ul roztworu zatrzymującego (R10). Roztwór ten dodawać w tej samej kolejności i tempie jak roztwór substratu. Wymieszać dokładnie. 14. Wytrzeć starannie spód każdej mikropłytki. 15. Odczytać gęstość optyczną dla każdego dołka przy 450 nm (z filtrem referencyjnym 620 nm). Wyniki odczytać w ciągu 30 min. od zatrzymania reakcji. Przed odczytem paski muszą być trzymane z dala od do światła. 16. Sprawdź zgodność uzyskanego w czytniku odczytu z planem mikropłytki przed przeliczeniem wyników. 11- KONTROLA JAKOŚCI (KRYTERIA WAŻNOŚCI) Podczas każdego testu, dla każdej mikropłytki należy oznaczyć kalibratory. Następujące kryteria musza być spełnione: Wartość gęstości optycznej: OD R4a > Proporcje: OD R4a / OD R3 >1.80 OD R4b / OD R4a > 1.25 OD 44c / OD R4b > 1.20 OD R4d / OD R4c >1.20 Stężenie mannanu w kontroli dodatniej R5: Stężenie R5: stężenie podane na fiolce ± 30%. 12- INTERPRETACJA WYNIKÓW Krzywa wzorcowa Krzywą wzorcową wyznacza 5 punktów, odpowiadających wartościom OD uzyskanym dla kalibratorów 0 pg/ml, 62.5 pg/ml, 125 pg/ml, 250 pg/ml, 500 pg/ml. Aby uzyskać najwyższą precyzję, należy ekstrapolując wykreślić krzywą sigmoidalną na osi X zaznaczając stężenie antygenu w pg/ml, na osi Y wartości odczytu OD (skala liniowa). Jeśli czytnik nie posiada opcji definiowania skali, należy wykreślić krzywą łączącą punkty odpowiadające wartościom standardów. Oznaczenie stężenia mannanu w badanej surowicy Dla każdej badanej surowicy wartość stężenia mannanu w pg/ml należy odczytać z krzywej wzorcowej. Interpretacja wyników Próbki o stężeniu mannanu poniżej 62.5 pg/ml (C < 62.5): wynik ujemny w kierunku antygenu mannanowego. Próbki o stężeniu mannanu pomiędzy 62.5 pg/ml a 125 pg/ml (62.5 C < 125): wynik pośredni w kierunku antygenu mannanowego. Próbki o stężeniu mannanu powyżej lub równy 125 pg/ml (C 125): wynik dodatni w kierunku antygenu mannanowego. Wartości standardów użytych do wykreślenia krzywej wzorcowej nie pozwalają na dokładne oznaczenie stężenia mannanu powyżej 500 pg/ml. Aby dokładnie oznaczyć stężenie antygenu w wysoce dodatniej surowicy należy powtórzyć oznaczenie po rozcieńczeniu badanej próbki 1:5 w roboczym buforze do płukania (R2) i jej cieplnym opracowaniu. Stężenie mannanu dla próbek wysoko dodatnich będzie oznaczone po pomnożeniu uzyskanego w odczycie wyniku przez 5. Wyniki pośrednie mogą być potwierdzone poprzez oznaczenie wykonane na nowych próbkach pobranych kilka tygodni po od daty pierwszego pobrania dla którego uzyskano wynik pośredni. 13- OGRANICZENIA TESTU 1. Wynik ujemny nie wyklucza rozpoznania inwazyjnej kandydozy ze względu na bardzo niskie stężenie i szybkie eliminowanie mannanu w toku zakażenia. Rozpoznanie inwazyjnej kandydozy jest możliwe jedynie w oparciu o łączną analizę danych klinicznych, terapeutycznych, radiologicznych, cytologicznych, bezpośredniego badania mykologicznego i danych serologicznych, z uważna interpretacją każdego z badań. 2. Ujemny wynik w teście wykrywającym antygen należy interpretować jednocześnie z wynikiem testu wykrywającego przeciwciała anty-mannanowe: u pacjentów dodatnich w kierunku przeciwciał anty-mannanowych trudniej jest wykryć antygen mannanowy (patrz p. 15 Charakterystyka testu). 3. Na wykrywanie antygenu mannanowego w surowicy/osoczu ma wpływ ilość testów wykonanych dla danego pacjenta. Regularne monitorowanie pacjentów wysokiego ryzyka oraz wykonywanie testu na obecność przeciwciał antymannanowych podnosi czułość procedury i pozwala uchwycić wczesną konwersję na wynik dodatni. 6

7 4. Wykonując oznaczenie na obecność antygenu mannanowego należy przestrzegać procedury wykonania testu oraz zasad interpretacji wyników testu Platelia Candida Ag Plus. Przed przystąpieniem do wykonania testu użytkownik powinien dokładnie zapoznać się z instrukcją obsługi. W szczególności dokładnie przestrzegana musi być procedura pipetowania próbek i odczynników, płukania płytki oraz czasy inkubacji. 5. Dodanie próbki lub odczynnika niezgodnie z procedurą może prowadzić do uzyskania wyników fałszywie ujemnych. Należy rozważyć powtórzenie badania dla kolejnej próbki w przypadku podejrzenia inwazyjnej kandydozy w oparciu o dane kliniczne lub wystąpienia błędu proceduralnego. 6. W przypadku nieostrożnego obchodzenia się z mikropłytkami lub technicznie nieprawidłowego pipetowania odczynników, możliwe jest zanieczyszczenie dołków z ujemną próbką pacjenta na skutek przelania się do nich zawartości dołka z kontrolą lub próbką dodatnią. 7. Nie wykonano ewaluacji testu Platelia Candida Ag Plus dla próbek osocza/surowicy neonatologicznych i pediatrycznych. 8. Nie wykonano ewaluacji testu Platelia Candida Ag Plus dla odczytu manualnego i/lub manualnej interpretacji wyniku. 9. Raportowano wystąpienie reakcji krzyżowych u pacjentów przyjmujących infuzje niektórych serii plazmy hydroksyetyloskrobiowej (jak np. 6% Hesteril), stosowanej w leczeniu zaburzeń krążenia takich, jak hipowolemia, wstrząs krwotoczny czy wstrząs septyczny. 10. Fałszywie dodatnie reakcje uzyskano dla próbek zawierających 60g/l ludzkich gammaglobulin oraz dla niektórych próbek, które przebadano i oznaczono jako dodatnie w kierunku przeciwciał przeciwko T. gondii. 14- WARTOŚCI OCZEKIWANE Prewalencję antygenu mannanowego Candida oznaczanego z użyciem Platelia Candia Ag Plus ewaluowano na panelu 613 próbek od pacjentów holenderskich (Miejsce 1 Holandia) hospitalizowanych w celu leczenia raka (49 pacjentów onkohematologicznych i 2 nie-hematologicznych) metodą intensywnej chemioterapii. Spośród 613 próbek, 88 było potwierdzonych pozytywnie, a 51 dało wynik pośredni z prewalencją 88/613 = 14.4% [95% Przedział ufności: %] z wynikami pośrednimi uznanymi za ujemne oraz prewalencją 139/613 = 22.7% [95% Przedział ufności: %] z wynikami pośrednimi uznanymi za dodatnie. W odniesieniu do pacjentów, z 51 przebadanych, dla 23 uzyskano przynajmniej jeden wynik dodatni a dla 14 przynajmniej jeden wynik pośredni bez żadnego wyniku dodatniego, prewalencja 23/51 = 45.1% [95% przedział ufności %] z wynikami pośrednimi uznanymi za ujemne oraz prewalencją 37/51 = 72.6% [95% Przedział ufności: %] z wynikami pośrednimi uznanymi za dodatnie. Spośród 51 pacjentów, u 30 (388 próbek) nie stwierdzono obecności udokumentowanej inwazyjnej kandydozy. Pacjenci pozostali: 20 było skolonizowanych przez drożdże (12 przez Candida albicans, 7 przez Candida albicans w połączeniu z innym gatunkiem Candida, i 1 skolonizowanych przynajmniej jednym gatunkiem Candida nie-albicans. Czterech spośród tych pacjentów prezentowało objawy kliniczne i uzyskano dla nich mikrobiologiczne potwierdzenie powierzchownej infekcji o etiologii Candida. Ciężkie uszkodzenie bariery śluzówkowej stwierdzono u 24 z tych pacjentów. Z korespondujących 388 próbek, dodatnich było 41 i 43 pośrednie, z prewalencją 41/388 = 10.6% [95% przedział ufności %] przy uznaniu wyników pośrednich za ujemne oraz prewalencją 84/388 = 21.7% [95% przedział ufności %]. przy uznaniu wyników pośrednich za dodatnie. W odniesieniu do pacjentów, spośród 30 przebadanych, dla 10 uzyskano przynajmniej jeden wynik dodatni, a dla 11 przynajmniej jeden wynik pośredni bez żadnego wyniku dodatniego, prewalencja 10/30 = 33.3% [95% przedział ufności %] z wynikami pośrednimi uznanymi za ujemne oraz prewalencją 21/30 = 70.0% [95% Przedział ufności: %] z wynikami pośrednimi uznanymi za dodatnie 15- CHARAKTERYSTYKA TESTU A. Powtarzalność Powtarzalność wewnątrz-testowa (powtarzalność): W celu oznaczenia powtarzalności dla uzyskiwanych wyników, 5 surowic (2 ujemne i 3 dodatnie) oznaczono w 32 powtórzeniach w tej samej serii oznaczeń. Dla każdej próbki wyznaczono stężenie mannanu w pg/ml. Średnie stężenie, odchylenie standardowe (SD) i współczynnik zmienności (CV) dla każdej próbki pokazano w tabeli poniżej: Powtarzalność wewnątrz-testowa (powtarzalność) N=32 Próbka ujemna Próbka wysoko Próbka słabo Próbka średni Próbka wysoko ujemna dodatnia dodatnia dodatnia Średnie stężenie (pg/ml) SD CV% 16.3% 9.5% 6.7% 5.2% 6.5% Powtarzalność pomiędzy-testowa (odtwarzalność): W celu oznaczenia odtwarzalności dla uzyskiwanych wyników, 5 surowic (2 ujemne i 3 dodatnie) oznaczano w duplikacie, w dwóch seriach na dzień, przez 20 dni. Dla każdej próbki wyznaczono stężenie mannanu w pg/ml. Średnie stężenie, odchylenie standardowe (SD) i współczynnik zmienności (CV) dla każdej próbki pokazano w tabeli poniżej: 7

8 Powtarzalność pomiędzy-testowa (odtwarzalność) N=80 Próbka ujemna Próbka wysoko Próbka słabo Próbka średni Próbka wysoko ujemna dodatnia dodatnia dodatnia Średnie stężenie (pg/ml) SD CV% 29.0% 20.8% 20.7% 18.6% 14.6% B. Reaktywność krzyżowa Patologia Liczba przebadanych Liczba próbek Liczba próbek próbek dodatnich pośrednich Aspergillus Przeciwciała anty-dsdna Dodatnie przeciwciała ANA Szpiczak (IgG i IgM) Anty-T. gondii IgG Ludzkie przeciwciała anty-mysie Czynnik reumatoidalny C. Liniowość Zakres liniowości testu Platelia Candida Ag Plus ustalono na pg/ml w oparciu o badania rozcieńczeń seryjnych dla 4 próbek dodatnich. D. Oznaczenia kliniczne Własności testu Platelia Candida Ag Plus ewaluowano w 3 miejscach, z użyciem w sumie 852 próbek, od 505 pacjentów. CZUŁOŚĆ W celu oceny czułości testu Platelia Candida Ag Plus przeprowadzono badania z użyciem 436 próbek od 89 pacjentów hospitalizowanych w 2 miejscach (w Holandii i we Francji). Rozkład próbek: Miejsce 1 (Holandia): 225 próbek od 21 pacjentów holenderskich przyjętych do oddziału hematologii onkologicznej w celu leczenia złośliwych nowotworów krwi (19 przypadków) oraz nowotworów nie-hematologicznych (2 przypadki) metodą intensywnej chemioterapii, po której stosownie do potrzeb, wykonano przeszczep komórek hematopoetycznych szpiku kostnego. U wszystkich pacjentów stwierdzono inwazyjną kandydozę potwierdzoną mikrobiologicznie wyhodowaniem przynajmniej jednokrotnie Candida (hodowla krwi lub hodowla z fizjologicznie jałowej tkanki). 17 Miejsce 2 (Francja): 21 próbek od 68 pacjentów francuskich, hospitalizowanych na różnych oddziałach intensywnej terapii lub hematologii onkologicznej, z inwazyjną kandydozą potwierdzoną mikrobiologicznie uzyskaniem przynajmniej jednokrotnie dodatniej hodowli krwi z wyhodowaniem Candida spp. Uwaga: panele próbek używanych w tych badaniach pochodziły od pacjentów, których próbki zebrano w latach Relatywna stabilność antygenu mannanowego i przeciwciał anty-mannanowych w okresie zamrożenia, oraz po każdym cyklu zamrażania i rozmrażania, wpływa na zależność uzyskiwanych wyników od warunków przechowywania danego panelu. Wyniki czułości testu uzyskane dla badań retrospektywnych mogą być w związku z tym niższe, niż wyniki uzyskiwane dla próbek zebranych ostatnio. Wyniki dla miejsca 1 21 pacjentów holenderskich przyjęto do szpitala w celu terapii złośliwego raka krwi (ostra białaczka szpikowa, ostra białaczka limfatyczna, przewlekła białaczka limfatyczna, szpiczak, zespół mielodysplastyczny, anemia aplastyczna, oraz złośliwy chłoniak nieziarniczy) lub nowotworów niehematologicznych metoda intensywnej chemioterapii, po której stosownie do potrzeb, wykonano przeszczep komórek hematopoetycznych szpiku kostnego. U pacjentów tych wystąpiła inwazyjna kandydoza, potwierdzona mikrobiologicznie wyhodowaniem przynajmniej jednokrotnie Candida (hodowla krwi lub hodowla z fizjologicznie jałowej tkanki). Status pacjentów w kierunku obecności antygenu mannanowego, wykrywanego z użyciem testu Platelia Candida Ag Plus, był uznany za dodatni jeżeli przynajmniej jedna z próbek pacjentów była dodatnia. W przypadku braku wyniku dodatniego, status pacjenta był uznany za pośredni jeżeli dla przynajmniej jednej próbki uzyskano wynik pośredni i za ujemny jeżeli wszystkie próbki dały wynik ujemny. 17 Kategoria pacjentów 21 pacjentów (225 próbek) z przynajmniej jednym wyhodowaniem Candida spp. Wyniki dla testu Platelia Candida Ag Plus Liczba pacjentów (liczba próbek) Czułość (próbki pośrednie uznane za dodatnie pośrednie ujemne dodatnie) 13 (47) 3 (8) 5 (170) 61.9% 95% IC [ %] Czułość (próbki pośrednie uznane za ujemne) 76.2% 95% IC [ %] 8

9 Niezależnie od badania z użyciem testu Platelia Candida Ag Plus, te same próbki były badane w kierunku obecności przeciwciał anty-mannanowych z użyciem testu Platelia Candida Ab Plus 9. Status pacjentów w kierunku obecności antygenu lub przeciwciał anty-mannanowych, był uznany za dodatni, jeżeli przynajmniej jedno z tych dwóch badań dało wynik dodatni. W przypadku braku wyniku dodatniego, status pacjenta był uznany za pośredni jeżeli dla przynajmniej jednej z dwóch próbek uzyskano wynik pośredni i za ujemny jeżeli obie próbki dały wynik ujemny Kategoria pacjentów 21 pacjentów (225 próbek) z przynajmniej jednym wyhodowaniem Candida spp. Wyniki łączne dla testu Platelia Candida Ag Plus i Platelia Candida Ab Plus Liczba pacjentów (liczba próbek) Czułość (próbki Czułość (próbki pośrednie uznane za pośrednie uznane za dodatnie pośrednie ujemne dodatnie) ujemne) 15 (98) 4 (34) 2 (93) 71.4% 95% IC [ %] 90.5% 95% IC [ %] Wyniki dla miejsca 2 68 pacjentów francuskich hospitalizowano na różnych oddziałach intensywnej terapii (chirurgia, transplantologia, oparzeniowy, urazowy, płucny, itd.) lub hematologii onkologicznej (nowotwory złośliwe). U wszystkich stwierdzono z inwazyjną kandydozę potwierdzoną mikrobiologicznie, uzyskaniem przynajmniej jednokrotnie dodatniej hodowli krwi z wyhodowaniem Candida 6, 7, 14 (albicans, parapsilosis, norvegensis, glabrata, krusei lub tropicalis) w dniach bezpośrednio poprzedzających lub następujących po pobraniu próbki do badań. Próbki krwi pobierano 6 dni (średnio) po uzyskaniu pierwszej dodatniej w kierunku Candida hodowli krwi (minimum 61 dni przed, maksimum 67 dni po). Status pacjentów w kierunku obecności antygenu mannanowego, wykrywanego z użyciem testu Platelia Candida Ag Plus, był uznany za dodatni jeżeli przynajmniej jedna z próbek pacjentów była dodatnia. W przypadku braku wyniku dodatniego, status pacjenta był uznany za pośredni jeżeli dla przynajmniej jednej próbki uzyskano wynik pośredni i za ujemny jeżeli wszystkie próbki dały wynik ujemny Kategoria pacjentów Wyniki łączne dla testu Platelia Candida Ag Plus Liczba pacjentów (liczba próbek) Czułość (próbki Czułość (próbki dodatnie pośrednie ujemne pośrednie uznane za pośrednie uznane za dodatnie) ujemne) 35 (86) 7 (14) 26 (111) 51.5% 61.8% 95% IC [ %] 95% IC [ %] 68 pacjentów (211 próbek) z przynajmniej jednym wyhodowaniem Candida spp. - w tym 34 dodatnie w kierunku C. albicans 64.7% 22 (55) 6 (12) 6 (46) (113 próbek) 95% IC [ %] - w tym 34 dodatnie w kierunku 13.3% C.parapsilosis 2 (3) 1 (1) 12 (33) 95% IC [ %] (37 próbek) - w tym 34 dodatnie w kierunku C. glabrata 58.3% 7 (13) 0 (0) 5 (19) (32 próbki) 95% IC [ %] - w tym 34 dodatnie w kierunku C.tropicalis (19 próbek) 4 (15) 0 (1) 0 (3) 100.0%* 100.0%* - w tym 34 dodatnie w kierunku C.krusei (8 próbek) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0.0%* 0.0%* - w tym 34 dodatnie w kierunku C.norvegensis 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0.0%* 0.0%* (2 próbki) * 95% przedział ufności nie został wyliczony z uwagi na zbyt małą liczbę próbek 82.5% 95% IC [ %] 20.0% 95% IC [ %] 66.7% 95% IC [ %] Niezależnie od badania z użyciem testu Platelia Candida Ag Plus, te same próbki były badane w kierunku obecności przeciwciał anty-mannanowych z użyciem testu Platelia Candida Ab Plus 9. Status pacjentów w kierunku obecności antygenu lub przeciwciał anty-mannanowych, był uznany za dodatni, jeżeli przynajmniej jedno z tych dwóch badań dało wynik dodatni. W przypadku braku wyniku dodatniego, status pacjenta był uznany za pośredni jeżeli dla przynajmniej jednej z dwóch próbek uzyskano wynik pośredni i za ujemny jeżeli obie próbki dały wynik ujemny. 9

10 Kategoria pacjentów Wyniki łączne dla testu Platelia Candida Ag Plus i Platelia Candida Ab Plus Liczba pacjentów (liczba próbek) Czułość (próbki Czułość (próbki dodatnie pośrednie ujemne pośrednie uznane za pośrednie uznane za dodatnie) ujemne) 48 (122) 8 (40) 12 (49) 70.6% 82.4% 95% IC [ %] 95% IC [ %] 68 pacjentów (211 próbek) z przynajmniej jednym wyhodowaniem Candida spp. - w tym 34 dodatnie w kierunku C. albicans 82.4% 28 (74) 2 (22) 4 (17) (113 próbek) 95% IC [ %] - w tym 34 dodatnie w kierunku 33.3% C.parapsilosis 5 (7) 6 (15) 4 (15) 95% IC [ %] (37 próbek) - w tym 34 dodatnie w kierunku C. glabrata 91.7% 11(24) 0 (3) 1 (5) (32 próbki) 95% IC [ %] - w tym 34 dodatnie w kierunku C.tropicalis (19 próbek) 4 (17) 0 (0) 0 (2) 100.0%* 100.0%* - w tym 34 dodatnie w kierunku C.krusei (8 próbek) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0.0%* 0.0%* - w tym 34 dodatnie w kierunku C.norvegensis 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0.0%* 0.0%* (2 próbki) * 95% przedział ufności nie został wyliczony z uwagi na zbyt małą liczbę próbek 88.2% 95% IC [ %] 73.3% 95% IC [ %] 91.7% 95% IC [ %] SWOISTOŚĆ Swoistość testu określono z użyciem panelu 416 próbek z dwóch miejsc we Francji, rozkład próbek: Miejsce 1: 200 próbek od 200 kobiet francuskich monitorowanych w kierunku obecności serologicznych markerów zakażenia Toxoplasma gondii w czasie ciąży, bez objawów klinicznych zakażenia Candida. Miejsce 2: 219 próbek od 216 francuskich krwiodawców. Kategoria pacjentów 200 ciężarnych (200 próbek) monitorowanych w kierunku toksoplazmozy 216 krwiodawców (216 próbek) Wyniki dla testu Platelia Candida Ag Plus Liczba pacjentów (liczba próbek) Czułość (próbki pośrednie uznane za dodatnie pośrednie ujemne dodatnie) % 95% IC [ %] 99.1% 95% IC [ %] Czułość (próbki pośrednie uznane za ujemne) 98.5% 95% IC [ %] 99.5% 95% IC [ %] 16- KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Wszystkie produkty Bio-Rad są przygotowane zgodnie z naszym systemem jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Każda seria ostatecznego produktu podlega oznaczeniu kontrolnemu i jest dopuszczona do użytku, jeśli spełnia wymagane kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii. 17- BIBLIOGRAFIA 1- Alam, F.F., Mustafa, A.S., Khan, Z.U Comparative evaluation of (1,3)- beta-d-glucan, mannan and anti-mannan antibodies, and Candida species specific snpcr in patients with candidemia. BMC Infectious Diseases 7(103): p Ascioglu, S., Rex, J.H., de Pauw, B., Bennett, J.E., Bille, J., Crokaert, F., Denning, D.W., Donnelly, J.P., Edwards, J.E., Erjavec, Z., Fiere, D., Lortholary, O., Maertens, J., Meis, J.F., Patterson, T.F., Ritter, J., Selleslag, D., Shah, P.M., Stevens, D.A., Walsh,T.J Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: An international consensus. Clinical Infectious Diseases 34: p Ellepola, A.N.B., Morrison, C.J Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis. Journal of Microbiology 43(No. S): p Ellis, M., Al-Ramadi, B., Bernsen, R., Kristensen, J., Alizadeh, H., Hedstrom, U Prospective evaluation of mannan and anti-mannan antibodies for diagnosis of invasive Candida infections in patients with neutropenic fever. Journal of medical microbiology 58(5): p Guery, B.P., Arendrup, M.C., Auzinger, G., Azoulay, E., Borges Sá, M., Johnson, E.M., Müller, E., Putensen, C., Rotstein, C., Sganga, G., Venditti, M., Zaragoza Crespo, R., Kullberg, B.J Management of invasive candidiasis and candidemia in adult non-neutropenic intensive care unit patients: Part I. Epidemiology and diagnosis. Intensive Care Med. 35: p Nucci, M.,, Colombo, A.L Candidemia due to Candida tropicalis: clinical, epidemiologic, and microbiologic characteristics of 188 episodes occurring in tertiary care hospitals. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 58: p Oliveri, S., Trovato, L., Betta, P., Romeo, M.G., Nicoletti, G Experience with the Platelia Candida ELISA for the diagnosis of invasive candidiosis in neonatal patients. Clinical Microbiology and Infection 14 (4): p

11 8- Pappas, P.G., Kauffman, C.A., Andes, D., Benjamin D.K.Jr., Calandra, T.F., Edwards, J.E.Jr, Filler, S.G., Fisher, J.F., Kullberg, B.J., Ostrosky-Zeichner, L., Reboli, A.C., Rex, J.H., Walsh, T.J., Sobel, J.D Clinical Practice Guidelines for the Management of Candidiasis: 2009 Update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases 48: p Persat, F., Topenot, R., Piens, M.A., Thiebaut, A., Dannaoui, E., Picot, S Evaluation of different commercial ELISA methods for the serodiagnosis of systemic candidiosis. Mycoses 45: p Prella, M., Bille, J., Pugnale, M., Duvoisin, B., Cavassini, M., Calandra, T., Marchetti, O Early diagnosis of invasive candidiasis with mannan antigenemia and antimannan antibodies. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 51: p Rentz, A.M., Halpern, M.T., Bowden, R The Impact of Candidemia on Length of Hospital Stay, Outcome, and Overall Cost of Illness. Clinical Infectious Diseases 27: p Ruan, S.-Y., Hsueh, P.-R Invasive Candidiasis: An Overview from Taiwan. J. Formos. Med. Assoc. 108(6): p Sendid, B., Poirot, J.L., Tabouret, M., Bonnin, A., Caillot, D., Camus, D., Poulain, D Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p Sendid, B., Caillot, D., Baccouch-Humbert, B., Klingspor, L., Grandjean, M., Bonnin, A., Poulain, D Contribution of the Platelia Candida-specific antibody and antigen tests to early diagnosis of systemic Candida tropicalisinfection in neutropenic adults. Journal of Clinical Microbiology 41(10): p Tortorano, A.M., Peman, J., Bernhardt, H., Klingspor, L., Kibbler, C.C., Faure, O., Biraghi, E., Canton, E., Zimmermann, K., Seaton, S., Grillot, R Epidemiology of Candidaemia in Europe: Results of 28-Month European Confederation of Medical Mycology (ECMM) Hospital-Based Surveillance Study.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 23: p Vardakas, K. Z., Michalopoulos, A., Kiriakidou, K. G., Siampli, E. P., Samonis, G., Falagas, M. E Candidaemia: incidence, risk factors, characteristics and outcomes in immunocompetent critically ill patients. Clin. Microbiol. Infect. 15: p Verduyn Lunel, F.M., Donnelly, J.P., van der Lee, H. A. L., Blijlevens, N.M. A., Verweij, P. E Circulating Candida-specific anti-mannan antibodies precede invasive candidiasis in patients undergoing myelo-ablative chemotherapy. Clin. Microbiol. Infect. 15(4): p CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) Znak CE (Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady nr 98/79/CE o wyrobach diagnozy medycznej in vitro) For in vitro diagnostic use Wyrób do diagnostyki in vitro Manufacturer Wytwórca Batch code Kod partii Storage temperature limitation Przestrzegać zakresu temperatur Catalogue number Numer katalogowy Authorised Representative Autoryzowany przedstawiciel Expiry date YYYY/MM/DD Użyć przed RRRR/MM/DD Consult Instruction for use Sprawdź w instrukcji obsługi Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /