PLATELIA TM ASPERGILLUS EIA 96 TESTÓW 62796

Transkrypt

1 PLATELIA TM ASPERGILLUS EIA 96 TESTÓW PLATELIA ASPERGILLUS EIA JEST MIKROPŁYTKOWYM, KANAPKOWYM TESTEM IMMUNOENZYMATYCZNYM DO OZNACZANIA ANTYGENU GALAKTOMANNANOWEGO ASPERGILLUS W SUROWICY 1 PRZEZNACZENIE Platelia Aspergillus EIA jest mikropłytkowym, kanapkowym testem immunoenzymatycznym do oznaczania antygenu galaktomannanowego Aspergillus w surowicy. 2 ZASTOSOWANIE Platelia Aspergillus EIA jest testem, który w połączeniu z innymi metodami diagnostycznymi, takimi jak hodowla, badanie histologiczne bioptatów i badania radiologiczne, może być pomocny w diagnozowaniu aspergilozy inwazyjnej. 3 ZASADA DZIAŁANIA Zakażenie grzybami Aspergillus rozwija się zazwyczaj w wyniku inhalacji występujących powszechnie w środowisku zarodników. Inwazyjna forma, której częstość występowania w ciągu ostatnich 10 lat znacznie wzrosła, jest najcięższą postacią zakażenia. Występuje ona głównie u pacjentów neutropenicznych (w wyniku leczenia przeciwnowotworowego) oraz u pacjentów leczonych immunosupresantami (transplantacja narządów, a zwłaszcza transplantacja szpiku kostnego) i kortykosterydami 7. Grzybnia Aspergillus jest rzadko izolowana z hodowli krwi. Diagnoza opiera się często na metodach niespecyficznych lub radiologicznych (objawy kliniczne, tomografia komputerowa, prześwietlenie klatki piersiowej itp.). Oznaczanie w surowicy rozpuszczalnego antygenu galaktomannanowego wydaje się obecnie być metodą serologiczną pomocną w diagnozowaniu aspergilozy inwazyjnej 6, 9, 14, 34, ZASADA OZNACZENIA 27 Platelia Aspergillus EIA jest jednostopniowym, mikropłytkowym, kanapkowym testem immunoenzymatycznym do oznaczania antygenu galaktomannanowego w surowicy pacjenta. W teście wykorzystano szczurze przeciwciała monoklonalne EBA-2, skierowane przeciw galaktomannanowi Aspergillus, opisane literaturze 16, 28. Przeciwciała monoklonalne używane są do (1) opłaszczenia dołków mikropłytki i wiązania antygenu (2) oraz do wykrywania związanego z uczuloną mikropłytką antygenu (koniugat: monoklonalne przeciwciała związane z peroksydazą). W celu rozpuszczenia kompleksów immunologicznych oraz precypitacji białek surowicy, które mogłyby wpływać na przebieg oznaczenia, próbki surowicy ogrzewa się w obecności EDTA 15. Przygotowane próbki i koniugat dodaje się do dołków opłaszczonych przeciwciałami monoklonalnymi i inkubuje. W obecności galaktomannanu tworzy się kompleks : przeciwciało monoklonalne galaktomannan przeciwciało monoklonalne / peroksydaza. Paski płucze się, w celu usunięcia niezwiązanego materiału. Następnie, dodaje się roztwór substratu, który reaguje z kompleksami związanymi z dołkiem wywołując niebieskie zabarwienie. Po dodaniu kwasu, reakcja enzymatyczna zostaje zatrzymana, a zabarwienie z niebieskiego zmienia się na żółte. Wartości absorbancji próbek i kontroli określa się spektrofotometrycznie przy długości fali 450 i 620 nm. 1

2 5 ODCZYNNIKI Platelia Aspergillus: nr kat (96 testów) Zestaw należy przechowywać w temperaturze 2-8 C. Przed użyciem wszystkie odczynniki przenieść do temperatury pokojowej (18-25 C). Natychmiast po użyciu wszystkie odczynniki z wyjątkiem kontroli, powinny być przeniesione do temperatury 2-8 C. Po rekonstytucji, nieużyta surowica kontrolna ujemna, surowica kalibracyjna i surowica kontrolna dodatnia muszą być zamrożone w temp. -20 C. Niezużyte paski/płytki włożyć do opakowania, zamknąć szczelnie. Nie usuwać środka pochłaniającego wilgoć. Paski powinny być zużyte w ciągu 5 tygodni od pierwszego otwarcia opakowania. Rozcieńczony bufor do płukania można przechowywać przez 14 dni w temp. 2-8 C. Wszystkie pozostałe odczynniki po otwarciu są stabilne do daty ważności podanej na opakowaniu. Dostarczona ilość odczynników wystarcza do przeprowadzenia 96 testów w maksimum 9 seriach. Składnik Zawartość Ilość R1 Mikropłytka Mikropłytka: -96 dołków (12 pasków z 8 dołkami każdy) opłaszczonych monoklonalnymi przeciwciałami antygalaktomannanowymi R2 Stężony bufor do płukania R3 R4 R5 Kontrola ujemna Surowica kalibracyjna Kontrola Dodatnia Stężony bufor do płukania (10X): - bufor Tris NaCl (ph 7.4) -1% Tween 20-0,01% tiomersal Surowica kontrolna ujemna: - Liofilizowana surowica ludzka, ujemna pod względem glaktomannanu, przeciwciał anty-hiv-1, anty-hiv-2, anty-hcv i antygenu HBs Surowica kalibracyjna: - Liofilizowana surowica ludzka, ujemna pod względem przeciwciał anty-hiv-1, anty-hiv-2, anty- HCV i antygenu HBs Surowica kontrolna dodatnia: - Liofilizowana surowica ludzka, dodatnia pod względem glaktomannanu, ujemna pod względem przeciwciał anty-hiv-1, anty-hiv-2, anty-hcv i antygenu HBs R6 Koniugat Koniugat (gotowy do użycia): -Monoklonalne przeciwciało antyantygalaktomannanowe znakowane peroksydazą. -Środek konserwujący : 0,01% tiomersal R7 Roztwór do przygotowywan ia surowicy R8 Bufor substratu TMB Roztwór do przygotowywania (gotowy do użytku): -kwaśny roztwór EDTA, bez środka konserwującego Bufor substratu TMB (gotowy do użycia): -Roztwór kwasu cytrynowego i octanu sodu ph 5.2-0,009% Nadtlenek wodoru -4% Dwumetylosulfotlenek (DMSO) 1 płytka / 12 8 dołków ml 3 qs* 1 ml 3 qs* 1 ml 3 qs* 1 ml 1 8 ml 1 10,5 ml 1 60 ml R9 Chromogen: Roztwór TMB (stężony): 1 1 ml roztwór TMB -90% roztwór dwumetylosulfotlenku (DMSO) zawierający 0,6% tetrametylobenzydynę (TMB) R10 Roztwór Roztwór zatrzymujący (gotowy do użycia): 1 12 ml zatrzymujący -1.5 N Kwas siarkowy (H 2 SO 4 ) Folia adhezyjna Folia adhezyjna do mikropłytek 8 arkuszy Uwaga: TMB (tetrametylobenzydyna) - jest nierakotwórczym i niemutagennym substratem chromogennym dla peroksydazy. *Uwaga: qs: uzupełnić do 2

3 6 HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY 1. Wyrób do diagnostyki in vitro. 2. Tylko do użytku profesjonalnego. 3. Nie zaleca się stosowania próbek innych niż ludzka surowica. 4. Surowica kontrolna dodatnia, surowica kalibracyjna i surowica kontrolna ujemna to inaktywowana termicznie surowica ludzka. Próbki zostały przebadane z użyciem zatwierdzonych we Francji testów i uznane za ujemne w kierunku: przeciwciał anty-hiv -1/2 i anty-hcv, jak również antygenu HBs. Ponieważ żadna ze znanych metod badawczych nie może dać całkowitej pewności co do nieobecności czynników zakaźnych, z odczynnikami jak i z próbkami pacjentów należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym. Oznaczenia należy prowadzić zgodnie z OSHA Standard for Blood Borne Pathogens, w laboratorium 2 poziomu bezpieczeństwa lub z zastosowaniem innych środków ochrony właściwych dla zagrożeń biologicznych. 5. Stosować się do zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej, w trakcie pracy z odczynnikami i próbkami używać środków ochrony osobistej, w tym fartucha, osłony oczu/twarzy i rękawiczek jednorazowych (zalecane są syntetyczne rękawice nielateksowe). Po wykonaniu testu umyć dokładnie ręce. 6. Nie pipetować ustami. 7. Nie palić, nie pić i nie jeść w miejscu pracy z próbkami i odczynnikami zestawu. 8. Unikać rozlania próbek i roztworów zawierających próbki. 9. Niezawierające kwasów rozlane płyny zawierające materiały biologiczne, należy wytrzeć dokładnie z stosując środek dezynfekujący. Jako środka dezynfekującego można użyć między innymi: 10% wybielacza (0.5% roztwór podchlorynu sodu), 70% etanolu lub 0.5% Wescodyne Plus. W przypadku rozlania kwaśnych cieczy, należy je dokładnie wytrzeć bibułą lub zobojętnić dwuwęglanem sodu, a następnie przemyć środkiem dezynfekującym. Materiały użyte do wycierania rozlanych cieczy należy wyrzucić do pojemnika na odpady biologiczne. UWAGA: Nie wstawiać roztworów zawierających wybielacz do autoklawu. 10. Rozlane płyny zawierające kwasy należy dokładnie osuszyć (wytrzeć) lub zneutralizować dwuwęglanem sodu, spłukać i wytrzeć. Jeżeli zawierają materiał biologiczny, przetrzeć powierzchnię jednym z dezynfektantów chemicznych. 11. Wszystkie próbki i materiały używane do wykonania testu należy traktować jak materiał potencjalnie zakaźny. Należy przestrzegać wszelkich wymagań odnośnie usuwania odpadów tego rodzaju. 12. UWAGA: Poniżej podano listę potencjalnych zagrożeń chemicznych właściwych dla substancji zawartych w odczynnikach zestawu (patrz rozdział 5 - Odczynniki) 1.5N Kwas siarkowy (7,2% H 2 SO 4 ) jest żrący, może powodować oparzenia oczu i skóry; może być szkodliwy w przypadku połknięcia lub kontaktu ze skórą; może powodować poważne uszkodzenia oczu, w tym trwałe upośledzenie widzenia lub ślepotę. C - żrący Trzymać z dala od silnych zasad oraz czynników redukujących. R34-41 Wywołuje oparzenia. Ryzyko poważnego uszkodzenia oczu. S24/ / Unikać kontaktu ze skóra i oczami. W razie kontaktu z oczami natychmiast przemyć dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza. Nosić odpowiednią odzież ochronną, rękawice oraz osłonę oczu/twarzy. Odczynnik oraz opakowanie muszą być usuwane jako odpady niebezpieczne. Odpady tego odczynnika są klasyfikowane jako niebezpieczne odpady kwaśne; jednakże, jeżeli pozwalają na to przepisy lokalne, regionalne i krajowe, mogą być zneutralizowane do ph 6-9, przez przeszkolony i posiadający odpowiednie środki personel, w celu usuwania jako środek nie-niebezpieczny 3

4 0.01% tiomersal (mertiolan sodu) jest organiczno-rtęciowym środkiem konserwującym o właściwościach biobójczych, działającym na centralny układ nerwowy (CUN), środkiem działającym toksycznie na układ rozrodczy oraz środkiem silnie uczulającym; długotrwała lub częsta ekspozycja u niektórych wrażliwych osób może wywołać reakcję alergiczną. Liczne są przypadki uczuleń będących wynikiem ekspozycji na rozcieńczone roztwory tiomersalu. Unikać uwalniania do środowiska, ryzyko kumulacji. Roztwory zawierające powyżej 0.2 ppm rtęci, muszą być usuwane jako odpady niebezpieczne, zgodnie z US Federal RCRA (D009); jednakże, wszystkie odpady musza być usuwane zgodnie z lokalnymi, regionalnymi i krajowymi przepisami. (Informacja : rtęć (Hg) stanowi 49.55% cząsteczki tiomersalu, tak więc odczynniki z 0.01% tiomersalu zawierają 0.005% w/v (~50ppm) rtęci). W razie kontaktu ze skórą przemyć natychmiast wodą. Uwaga: tiomersal jest zaklasyfikowany w stanie Kalifornia jako środek działający toksycznie na układ rozrodczy. 13. Karta charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) jest dostępna na żądanie. 7 ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA 1. ZAMROŻONE PRÓBKI, PRZECHOWYWANE W NIEZNANYCH WARUNKACH MOGĄ DAWAĆ WYNIKI FAŁSZYWE DODATNIE Z POWODU ZANIECZYSZCZENIA GRZYBAMI I/LUB BAKTERIAMI. 2. Nie używać odczynników po upływie terminu ważności. 3. Z wyjątkiem stężonego buforu do płukania (R2) oraz roztworu zatrzymującego (R10), nie mieszać odczynników z różnych zestawów posiadających odmienny numer serii. 4. Przynajmniej 15 minut przed użyciem przenieść wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej. 5. Starannie mieszać odczynniki w trakcie rekonstytucji, unikając ich zanieczyszczenia. 6. Nie wykonywać testu w obecności reaktywnych par związków (kwasów, zasad, aldehydów) lub kurzu, które mogą pływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. 7. Do przygotowywania roztworu substrat-chromogen używać czystych, jednorazowych, polipropylenowych pojemników. W przypadku stosowania naczyń szklanych, należy przemyć je 1N kwasem solnym, a następnie wypłukać wodą destylowaną i wysuszyć. 8. Podczas ręcznego pipetowania kontroli i próbek, w celu uniknięcia zanieczyszczania materiałem pochodzącym z próbek, za każdym razem zmieniać jednorazową końcówkę. 9. W celu zapewnienia dokładnego przemycia dołków, należy przestrzegać zalecanej ilości cykli płukania oraz zwracać uwagę, czy studzienki są całkowicie napełniane a następnie opróżniane. Do przemywania nie należy stosować tryskawki. 10. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki między etapem płukania a dodawaniem kolejnego odczynnika. 11. Nigdy nie używać tych samych pojemników dla roztworów koniugatu i substratu. 12. Nie dopuszczać do kontaktu koniugatu i roztworu substrat-chromogen z metalami i jonami metali. 13. Przechowując odczynniki i wykonując oznaczenie, unikać ekspozycji koniugatu i roztworu substrat-chromogen na silne światło. Nie dopuszczać do kontaktu roztworów chromogenu z utleniaczami. 14. Unikać kontaktu roztworu zatrzymującego z utleniaczami. Nie dopuszczać do kontaktu roztworu zatrzymującego z metalami i jonami metali. 15. W celu zminimalizowania prawdopodobieństwa zanieczyszczenia sporami Aspergillus z otoczenia, używać czystych, nie zakurzonych materiałów (probówki, końcówki do pipet, pojemniki itp.). Ponieważ galaktomannan jest odporny na działanie wysokiej temperatury, sterylizacja nie gwarantuje jego usunięcia. Optymalnym jest korzystanie z materiałów apirogennech, lecz także stosowanie standardowych materiałów przy zachowaniu czystości i ostrożności pozwala uzyskać prawidłowe wyniki. 16. Ograniczyć do minimum kontakt roztworów (próbek, roztworu do przygotowywania próbek, koniugatu) oraz otwartych pojemników (mikropłytek, próbówek i pipet) z powietrzem. 17. Nie zlewać niezużytego koniugatu do oryginalnego opakowania. 4

5 18. Roztwór substrat-chromogen musi być bezbarwny. Pojawienie się wkrótce po rozcieńczeniu niebieskiego zabarwienia, wskazuje na zanieczyszczenie odczynnika i oznacza, iż nie może być on stosowany. Należy przygotować nowy odczynnik. 8 PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW I WARUNKI PRZECHOWYWANIA Mikropłytka (R1) Po otwarciu oryginalnego opakowania, studzienki mikropłytek zachowują zdolność reakcyjną przez 5 tygodni, o ile są przechowywane w temp. 2-8 C, w szczelnie zamkniętej torebce, w obecności pochłaniacza wilgoci. Stężony bufor do płukania (R2) Przygotować roboczy bufor do płukania dodając jedną część stężonego buforu do płukania do dziewięciu części jałowej wody dejonizowanej lub destylowanej. Roboczy bufor do płukania może być przechowywany przez 14 dni w temp. 2-8 C. Przygotowywać odpowiednią ilość buforu na całe badanie (80 ml buforu wystarcza na jeden pasek : 8 ml R ml wody destylowanej). Stężony odczynnik po otwarciu należy przechowywać w temp C, przy braku zanieczyszczenia, odczynnik jest stabilny do daty ważności podanej na opakowaniu. Surowica kontrolna ujemna (R3) Zawartość fiolki rozpuścić w 1 ml super czystej, jałowej wody (najlepiej wody apirogennej). Surowice uwodnić bezpośrednio przed wykonaniem testu. Pozwolić na uwodnienie się surowicy przez 2-3 minuty, a następnie dokładnie wymieszać. Zawartość fiolki rozporcjować po 300 µl do trzech polipropylenowych mikroprobówek. Niewykorzystane probówki z uwodnioną surowicą natychmiast zamrozić w -20 C. Uwaga: Uwodnione, zamrożone surowice kontrolne mogą po rozmrożeniu być używane bez ponownej rehydratacji. Zamrożone, uwodnione surowice kontrolne można przechowywać w -20 C przez pięć tygodni. Z surowicami kontrolnymi postępować w taki sam sposób jak z próbkami pacjentów (300 µl surowicy µl roztworu badanego, itd.). Surowica kalibracyjna (R4) i Surowica kontrolna dodatnia (R5) Przygotować jak opisano powyżej dla surowicy kontrolnej ujemnej (R3). Roztwór roboczy substrat-chromogen (R8 + R9) Przygotować roztwór substrat-chromogen, dodając jedną część stężonego roztworu chromogenu TMB (R9) do 50 części buforu substratu TMB (R8). Przygotować 2 ml roztworu substratchromogen na każdy pasek: 40 µl (R9) + 2 ml (R8). Roztwór zachowuje trwałość przez 6 godz. przechowywany w ciemności, w temperaturze pokojowej ( C). Po otwarciu, odczynniki R8 i R9 przechowywane w temp C, przy braku zanieczyszczenia, są stabilne do daty ważności podanej na opakowaniu. Koniugat (R6), roztwór do przygotowywania surowicy (R7) i roztwór zatrzymujący (R10) Po otwarciu, odczynniki R6, R7 i R10 przechowywane w temp C przy braku zanieczyszczenia, są stabilne do daty ważności podanej na opakowaniu. 9 POBIERANIE PRÓBEK Pobrać krew zgodnie z rutynową procedurą. Oznaczenie należy wykonywać z użyciem surowicy. Próbki surowicy muszą być wolne od spor grzybiczych i/lub bakterii. Próbówki z próbkami podczas przechowywania i transportu powinny być szczelnie zamknięte, bez dostępu powietrza. Przechowywane przed oznaczeniem próbki w zamkniętej probówce, w temp. 2-8 C zachowują trwałość przez 5 dni. Po otwarciu, próbki mogą być przechowywane przed oznaczeniem w temp. 2-8 C przez 48 godzin. W celu dłuższego przechowywania surowicę należy zamrozić w -70 C. Próbki surowicy można maksymalnie 4 razy zamrozić i rozmrozić. Przed wykonaniem oznaczenia rozmrażane próbki należy dobrze wymieszać. 5

6 Na oznaczenie nie wywiera wpływu obecność w surowicy 20 mg/l bilirubiny, poziom lipemii odpowiadający 2 g/l trójglicerydów (trioleiny), ani hemoliza wynosząca 165 mg/l hemoglobiny. Nie badano wpływu nadmiaru albumin. Nie używać surowicy pozbawionej dopełniacza. 10 PROCEDURA Materiały dostarczone Patrz rozdział ODCZYNNIKI. Materiały potrzebne ale niedostarczone w zestawie 1. Jałowa woda destylowana lub dejonizowana, do rozcieńczania buforu do płukania. 2. Jałowa woda oczyszczona do rekonstytucji surowic kontrolnych. 3. Bibuła. 4. Rękawice jednorazowego użytku. 5. Okulary ochronne. 6. Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu. 7. Pipety lub pipety wielokanałowe, nastawne lub stało-objętościowe, pozwalające odmierzać i dozować 50 µl, 100 µl, 300 µl i 1000 µl. 8. polipropylenowe mikroprobówki na 1.5ml ze szczelnymi korkami, odporne na temperaturę 120 C (bloki grzewcze) i 100 C (łaźnie wodne). a. Probówki z nakrętkami: 1.5 ml probówki stożkowe, Bio-Rad nr kat lub zamiennik. b. Probówki z wieczkiem: EZ Micro Test Tubes, 1.5 ml, Bio-Rad nr kat lub zamiennik. 9. Blokada do wieczek mikroprobówek (VWR nr kat lub zamiennik). Blokada ma na celu zabezpieczenie probówki przed otwarciem w wyniku zmian temperatury i ciśnienia. Ułatwia także wyjmowanie probówek z bloków grzewczych i łaźni wodnych. 10. Wirówka laboratoryjna do mikroprobówek osiągająca przyspieszenie g. 11. Okrągły, pływający statyw pasujący do zlewki o pojemności 1 l. 12. Wortex. 13. Termoblok. Polecane są następujące bloki grzejne: a. model z jednym blokiem: Grant nr kat. QBD1 (VWR nr kat ) b. model z dwoma blokami: Grant nr kat. QBD2 (VWR nr kat ) 14. Wkład do termobloku: obydwu bloków grzewczych należy używać z Grant block nr kat. QB-E1 (VWR nr kat ). 15. Łaźnia wodna nastawiona na 100 C. 16. Inkubator mikropłytek nastawiony na temp. 37 ± 1 C. 17. Półautomatyczna lub automatyczna płuczka mikropłytek. 18. Czytnik mikropłytek wyposażony w filtry 450nm i 620 nm. Uwagi proceduralne W celu walidacji każdej serii oznaczeń należy zawsze stosować surowice kontrolne: ujemną dodatnią i cut-off. Obróbka surowic Z surowicami kontrolnymi: ujemną (R3), dodatnią (R5) i kalibracyjną (R4) należy równocześnie postępować w ten sam sposób, jak z surowicami badanymi. 1. Dodać po 300 µl kontroli i próbek do próbówki Eppendorfa na 1.5 ml. 2. Dodać 100 μl roztworu do przygotowywania surowicy (R7) do każdej probówki. 3. Wymieszać dokładnie zawartość probówek, wstrząsając je, korzystając z worteksu lub pipetując. Zamknąć szczelnie probówki, probówki z wieczkiem zabezpieczyć blokadami. Nie przekłuwać wieczek. 6

7 4. Ogrzewać probówki przez 6 minut w termobloku ustawionym na 120 C. Probówki umieścić w bloku dopiero po osiągnięciu zalecanej temperatury. (*) (*) W przypadku korzystania z łaźni wodnej: ogrzewać probówki przez 3 minuty w 100 C. 5. Wyjąć ostrożnie gorące probówki z bloku lub łaźni wodnej i umieścić je w wirówce. Wirować probówki przy g przez 10minut. 6. Do oznaczania antygenu galaktomannanowego używany jest supernatant. 7. Oznaczenie wykonać zgodnie z poniższą procedurą. Supernatant może być przechowywany przed oznaczeniem w temp. 2-8 C przez 48 godz. Jeżeli wskazane jest powtórzenia badania, należy opracować kolejną próbkę surowicy. (*) Ścisłe przestrzeganie podanej temperatury, procedury oznaczenia oraz stosowanych materiałów ma istotne znaczenie dla powodzenia w wykonaniu testu. Nie polegaj na temperaturze podanej na wyświetlaczu, sprawdź wartość faktyczną sondą temperaturową (wykalibrowany termometr umieszczony w parafinie w eppendorfie): temperatura wewnątrz probówki, musi osiągnąć 120 C w bloku grzewczym, a w łaźni wodnej 100 C. Procedura testu EIA Oznaczenie należy wykonać ściśle wg opisanej procedury. Stosować się do zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. 1. Wszystkie odczynniki przenieść do temperatury pokojowej (18-25 C) przynajmniej 15 min. przed użyciem. 2. Przygotować bufor do płukania, roztwór substrat-chromogen oraz surowice kontrolne: dodatnią, ujemną i kalibracyjną. 3. Należy ustalić rozkład używanych dołków dla badanych surowic i kontroli. Zaplanować jeden dołek dla surowicy kontrolnej ujemnej (R3), dwa dołki dla surowicy kalibracyjnej (R4) i jeden dołek dla surowicy kontrolnej dodatniej (R5). 4. Wyjąć ramkę i paski (R1) z opakowania. Paski, które nie będą używane schować do opakowania z pochłaniaczem wilgoci i szczelnie zamknąć. 5. Przed użyciem koniugat (R6) wymieszać przez odwracanie. Dodać po 50 µl koniugatu (R6) do każdego dołka. Następnie, zgodnie z przygotowanym planem, do każdego dołka dodać po 50 µl supernatantu próbek. Nie dodawać próbek surowicy do dołków przed dodaniem koniugatu. 6. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną lub podobnym materiałem, tak by zapewnić ochronę przed odparowaniem płynu z dołków. Upewnić się, iż zamknięcie jest wodoszczelne i przykryta jest cała powierzchnia. 7. Inkubować płytkę w suchym inkubatorze mikropłytek przez 90 ± 5 min. w temp. 37 C (± 1 C). 8. Zdjąć przykrycie. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika na odpady z podchlorynem sodu). Wykonać 5 cykli płukania używając co najmniej 370 µl buforu do płukania. Po ostatnim płukaniu, odwracając i ostukując, osuszyć mikropłytkę z resztek płynu na bibule. 9. Unikając ostrego światła, szybko nanieść do studzienek po 200 ul roztworu substratchromogen (R8+R9). 10. Inkubować mikropłytkę w ciemności, przez 30 ± 5 min, w temp. pokojowej (18-30 C). Nie zakrywać folią adhezyjną. 11. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 ul roztworu zatrzymującego (R10). Roztwór ten dodawać w tej samej kolejności jak roztwór substratu. Wymieszać dokładnie. 12. Wytrzeć starannie spód każdej mikropłytki. 13. Odczytać gęstość optyczną dla każdego dołka przy 450 nm (z filtrem referencyjnym 620 nm). Wyniki odczytać w ciągu 30 min. Od zatrzymania reakcji. 11 KONTROLA JAKOŚCI (KRYTERIA WAŻNOŚCI) Surowica kalibracyjna: Wartość O.D. każdej surowicy kalibracyjnej musi zawierać się w zakresie 0.3 i 0.8 7

8 Kontrola dodatnia: Indeks dla surowicy kontrolnej dodatniej musi być większy niż 2. OD kontroli dodatniej (R5) I = > 2 Wartość średnia OD surowicy kalibracyjnej Kontrola ujemna: Indeks dla surowicy kontrolnej ujemnej musi być mniejszy niż 0,4. OD kontroli ujemnej (R3) I = < 0,4 Wartość średnia OD surowicy kalibracyjnej Jeżeli którekolwiek z powyższych kryteriów nie zostało spełnione, test należy uznać za nieważny i nie należy wydawać wyników analizy. Osoba wykonująca badanie po sprawdzeniu procedury może podjąć decyzję o powtórzeniu badania lub poprosić o pomoc producenta. Do powtórnego badania należy przygotować nową porcję surowicy z tej samej próbki pacjenta. Przykład obliczeń: Próbka Absorbancja (OD) OD surowicy kontrolnej ujemnej (R3) OD surowicy kalibracyjnej (R4) OD surowicy kontrolnej dodatniej (R5) Obliczenia Wartość średnia OD surowicy kalibracyjnej Aby obliczyć wartość średnią OD surowicy kalibracyjnej (R4), należy dodać odczytane wartości OD dla obu powtórzeń i sumę podzielić przez 2. ( ) 2 = Indeks surowicy kontrolnej ujemnej Aby obliczyć indeks surowicy kontrolnej ujemnej, należy podzielić odczytaną wartość OD surowicy kontrolnej ujemnej przez wartość średnią OD surowicy kalibracyjnej: I = = Indeks surowicy kontrolnej dodatniej Aby obliczyć indeks surowicy kontrolnej dodatniej, należy podzielić odczytaną wartość OD surowicy kontrolnej dodatniej przez wartość średnią OD surowicy kalibracyjnej: I = = Walidacja Na powyższym przykładzie: Każda z wartości OD surowicy kalibracyjnej zawiera się w przedziale 0.3 i 0.8, co oznacza, że test dla surowicy kalibracyjnej spełnia kryteria ważności. Wartość indeksu surowicy kontrolnej ujemnej jest < 0.4, co oznacza, że test dla surowicy kontrolnej ujemnej spełnia kryteria ważności. Wartość indeksu surowicy kontrolnej dodatniej jest > 2, co oznacza, że test dla surowicy kontrolnej dodatniej spełnia kryteria ważności. Przykładowy test należy uznać za ważny gdyż zostały spełnione wszystkie z kryteriów walidacji dla surowic kontrolnych. 12 INTERPRETACJA WYNIKÓW Obecność lub brak antygenu galaktomannanowego ocenia się w oparciu o wyliczoną dla każdej próbki wartość indeksu. Indeks (I) jest to wartość uzyskana w wyniku podzielenia OD próbki pacjenta przez średnią wartość OD surowicy kalibracyjnej. 8

9 Obliczanie średniej wartości OD surowicy kalibracyjnej: Aby obliczyć wartość średnią OD surowicy kalibracyjnej (R4), należy dodać odczytane wartości OD dla obu powtórzeń i sumę podzielić przez 2. Obliczanie indeksu (I) dla każdej surowicy badanej: Dla każdej badanej próbki surowicy wykonaj następujące obliczenie: OD próbki I = Wartość średnia OD surowicy kalibracyjnej Surowice o indeksie < 0.5 uznawane są za ujemne pod względem obecności antygenu galaktomannanowego. Uwaga: Wynik ujemny może oznaczać, że ilość antygenu w materiale od pacjenta jest niższa niż próg czułości testu. Uwaga: Wynik ujemny nie wyklucza rozpoznania inwazyjnej aspergilozy. Jeżeli podejrzewa się zakażenie a wynik testu jest ujemny, zaleca się powtórzenie badania. Surowice o indeksie 0.5 uznawane są za dodatnie pod względem obecności antygenu galaktomannanowego. Zaleca się wykonanie powtórnego oznaczenia z nowej porcji opracowanej surowicy pochodzącej tej samej próbki dla wszystkich surowic uznanych za dodatnie, a także w celu monitorowania, pobranie kolejnej próbki od pacjenta. Uwaga: Wartość absorpcji mniejsza od 0,000 może wskazywać na błędy w wykonaniu oznaczenia lub pomiaru, co należy wyjaśnić. Wynik takiego badania jest nieważny i test należy powtórzyć. W celu podniesienia czułości i jak najwcześniejszego stwierdzenia dodatniego wyniku badania, rekomendowane jest regularne (dwa razy w tygodniu) oznaczanie próbek od pacjentów z grupy wysokiego ryzyka. Uwaga: Platelia Aspergillus EIA jest testem pomocniczym w diagnozowaniu aspergilozy inwazyjnej. Wyniki dodatnie w teście Platelia Aspergillus EIA należy interpretować w połączeniu z wynikami innymi badań diagnostycznych, takich jak: posiewy bakteriologiczne, badanie histologiczne bioptatów i badania radiologiczne. Przykład obliczeń: Próbka Absorpcja (OD) OD surowicy kontrolnej ujemnej (R3) OD surowicy kalibracyjnej (R4) OD surowicy kontrolnej dodatniej (R5) Próbka pacjenta # Próbka pacjenta # Próbka pacjenta # Obliczenia Sprawdź w rozdziale Kontrola jakości (Kryteria Ważności) przykłady obliczeń wykonywanych w celu walidacji oznaczenia. Wartość średnia OD surowicy kalibracyjnej Aby obliczyć wartość średnią OD surowicy kalibracyjnej (R4), należy dodać odczytane wartości OD dla obu powtórzeń i sumę podzielić przez 2: ( ) 2 =

10 Próbka pacjenta #1 Aby obliczyć indeks próbki pacjenta #1, należy podzielić wartość OD Próbki Pacjenta #1 przez wartość średnią OD surowicy kalibracyjnej: I = = W powyższym przykładzie wynik badania jest ujemny, gdyż wartość indeksu równa 0.23 jest < 0.5. Próbka pacjenta #2 Aby obliczyć indeks próbki pacjenta #2, należy podzielić wartość OD próbki pacjenta #2 przez wartość średnią OD surowicy kalibracyjnej: I = = W powyższym przykładzie wynik badania jest dodatni, gdyż wartość indeksu równa 0.74 jest 0.5. Próbka pacjenta #3 Aby obliczyć indeks próbki pacjenta #3, należy podzielić wartość OD próbki pacjenta #3 przez wartość średnią OD surowicy kalibracyjnej: I = = W powyższym przykładzie wynik badania jest dodatni, gdyż wartość indeksu równa 2.04 jest OGRANICZENIA TESTU 1. Wynik ujemny nie wyklucza rozpoznania aspergilozy inwazyjnej. Pacjentom zagrożonym wystąpieniem aspergilozy inwazyjnej badanie należy wykonywać dwa razy w tygodniu. 2. Wykonując oznaczenie na obecność antygenu galaktomannanowego należy przestrzegać procedury wykonania testu oraz zasad interpretacji wyników testu Platelia Aspergillus. Przed przystąpieniem do wykonania testu użytkownik powinien dokładnie zapoznać się z instrukcją obsługi. W szczególności dokładnie przestrzegana musi być procedura pipetowania próbek i odczynników, płukania płytki i oraz czasy inkubacji. 3. Dodanie próbki lub odczynnika niezgodnie z procedurą może prowadzić do uzyskania wyników fałszywie ujemnych. W przypadku podejrzenia aspergilozy inwazyjnej w oparciu o dane kliniczne lub wystąpienia błędu proceduralnego, należy rozważyć powtórzenie badania. 4. W przypadku nieostrożnego obchodzenia się z mikropłytkami lub technicznie nieprawidłowego pipetowania odczynników, możliwe jest zanieczyszczenie dołków z ujemną próbką pacjenta na skutek przelania się do nich zawartości dołka z kontrolą lub próbką dodatnią. 5. Nie przeprowadzono ewaluacji testu Platelia Aspergillus EIA na próbkach surowicy od niemowląt i dzieci. 6. U pacjentów z przewlekłą chorobą ziarniniakową (CGD) i zespołem Hioba zdolność wykrywania galaktomannanu w teście Platelia Aspergillus EIA może być ograniczona 36, U niektórych pacjentów z aspergilozą inwazyjną celowana kuracja przeciwgrzybicza może spowodować obniżenie czułości testu Platelia Aspergillus EIA Nie przeprowadzono ewaluacji testu Platelia Aspergillus EIA na próbkach osocza oraz dla materiałów takich jak: mocz, popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe (BAL) i PMR. 9. Nie przeprowadzono ewaluacji testu Platelia Aspergillus EIA dla odczytu manualnego i/lub wzrokowej oceny wyniku analizy. 10. Dla stosowanych w tym teście do wykrywania galaktomannanu, szczurzych przeciwciał monoklonalnych EBA-2, wykazano powinowactwo do grzybów należących do rodzajów Penicillium, Alternaria, Paecilomyces, Geotrichum i Histoplasma. W niektórych rejonach endemicznych, włącznie z częścią terenów USA, należy rozważyć możliwość występowania histoplazmozy 23,32,38. 10

11 11. Wyniki dodatnie przy braku objawów klinicznych: Reakcje dodatnie otrzymywane są zazwyczaj przed wystąpieniem objawów klinicznych i/lub zmian w obrazie radiologicznym i wynikają z wczesnego wykrywania antygenu galaktomannanowego w surowicy: odpowiadają one faktycznie dodatniemu wynikowi u pacjentów, u których postawiono następnie rozpoznanie potwierdzonej lub domniemanej aspergilozy. W niektórych szczególnych przypadkach należy jednakże podczas interpretacji testu uwzględnić również inne czynniki: a. Można uzyskać dodatnie wyniki testu bez objawów klinicznych, zwłaszcza w przypadku małych dzieci 26. Mimo iż niektóre z tych przypadków można skorelować z rzeczywistym występowaniem antygenów Aspergillus 5, w większości są to wyniki fałszywie dodatnie. b. W różnych produktach spożywczych, zwłaszcza w produktach zbożowych oraz w deserach na bazie śmietany, występuje galaktofuranoza 1,17. Mleko w proszku, w odróżnieniu od mleka ludzkiego, zawiera wysokie stężenie galaktomannanu 10. Podczas interpretacji przebiegu antygenemii u małych dzieci oraz u pacjentów ze zaburzeniami działania bariery jelitowej należy uwzględnić rodzaj diety 4, 10. W tej grupie pacjentów, każdy przypadek dodatniej antygenemii powinien być interpretowany z jeszcze większą ostrożnością 17. c. Są doniesienia literaturowe o dodatnich wynikach testu na obecność galaktomannanu u pacjentów otrzymujących piperacylinę / tazobaktam. Raportowano również, że niektóre serie lub partie piperacyliny / tazobaktamu dawały wyniki dodatnie w teście na obecność galaktomannanu. W związku z tym, dodatnie wyniki testu u pacjentów przyjmujących piperacilinę / tazobaktam powinny być interpretowane z dużą ostrożnością i potwierdzone innymi metodami diagnostycznymi. Obecność galaktomannanu stwierdzono również w niektórych partiach parenteralnych form amoksycyliny z kwasem klawulanowym. W związku z tym, interpretując wyniki testu należy uwzględnić leczenie półsyntetycznymi antybiotykami β-laktamowymi 1, 21. Z uwagi na zdolność testu Platelia Aspergillus EIA do wykrywania glaktomannanu na długo przed wystąpieniem objawów klinicznych i radiologicznych, nie można wykluczyć wystąpienia inwazyjnej aspergilozy. W związku z tym, dodatnie wyniki testu u pacjentów przyjmujących piperacylinę / tazobaktam powinny być interpretowane ostrożnie. d. Dodatnie wyniki reakcji bez współtowarzyszących objawów klinicznych zakażenia można zaobserwować u pacjentów otrzymujących produkty zawierające galaktomannan parenteralnie lub doustnie (w przypadku zaburzenia bariery jelitowej). Obecność galaktomannanu w tych produktach może być często wytłumaczona stosowaniem na etapie produkcji procesów fermentacji wykorzystujących grzyby. Dodatni wynik dla próbek pacjenta nie zostanie jednak uzyskany o ile stężenie egzogennego galaktomannanu w surowicy nie osiągnie lub nie przewyższy progu detekcji. Dlatego, przy podejrzanym, dodatnim wyniku testu i braku stosownych objawów zakażenia, zalecamy sprawdzenie przyjmowanych przez pacjenta środków oraz prześledzenie produkcyjnego procesu fermentacji i użytych materiałów wyjściowych 11, 24, WARTOŚCI SPODZIEWANE Spodziewana częstość występowania aspergilozy inwazyjnej jest zmienna w zależności od populacji pacjentów, raportowano wartości z zakresu 5-20% 7, 13. Ocenę własności testu Platelia Aspergillus EIA przeprowadzono w oparciu o badania kliniczne przeprowadzone w dwóch centrach badawczych w Europie na 4873 próbkach surowicy pobranych z 239 epizodów (203 pacjentów) zdiagnozowanego, złośliwego nowotworu krwi lub po transplantacji szpiku kostnego, z rozpoznaniem (lub bez) aspergilozy inwazyjnej. Ponieważ pacjent mógł być włączany do badań więcej niż jeden raz, analizę prowadzono w oparciu o ilość epizodów poddanych leczeniu. Za epizod uważany jest okres bezpośrednio towarzyszący procedurze klinicznej (np. transplantacja, GVHD itp.). W związku z tym, więcej niż jeden epizod może przypadać na jednego pacjenta. 11

12 Średnia prewalencja dla tych badań wyniosła 16% (38/239). Rozkład wartości indeksów dla tej populacji przedstawiono na poniższym wykresie. Pacjenci zdiagnozowani bez inwazyjnej aspergilozy (populacja kontrolna) Z użyciem testu Platelia Aspergillus EIA przebadano w sumie 3691 próbek surowic z 201 epizodów (168 pacjentów) w dwóch laboratoriach badawczych w Europie. Rozkład wartości indeksów przedstawiono na poniższym wykresie. Ilość surowic Rozkład wartości indeksów dla pacjentów grupy kontrolnej N = >1.5 Indeks Wykres punktowy przedstawia wyniki testów na obecność galaktomannanu przeprowadzonych na 3691 próbkach surowicy pochodzących z 201 epizodów (168 pacjentów kontrolnych) objętych tym badaniem (pacjenci poddawani terapii immunosupresyjnej na HSCT lub leczeni na złośliwe nowotwory krwi). Indeks 2 1,5 1 0,5 0 POPULACJA KONTROLNA: ROZKŁAD INDEKS/EPIZODÓW (N= 201 epizodów u 168 pacjentów) Liczba epizodów 12

13 Pacjenci ze zdiagnozowaną inwazyjną aspergilozą Poniższy wykres punktowy przedstawia wyniki testów na obecność galaktomannanu dla 1182 próbek surowicy pochodzących z 38 epizodów (35 pacjentów) objętych tym badaniem zdiagnozowanych jako potwierdzona lub prawdopodobna inwazyjna aspergiloza, zgodnie z definicją EORTC/NIAID. Nie dla każdej próbki od danego pacjenta spodziewany jest dodatni wynik badania. Indeks 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 POTWIERDZONA / PRAWDOPODOBNA INWAZYJNA ASPERGILOZA: ROZKŁAD INDEKS / EPIZOD (N=38 epizodów u 35 pacjentów) Numer Epizodu Cut-off 0.5 Oczekiwana częstość występowania aspergilozy inwazyjnej jest zmienna w zależności od populacji pacjentów i wynosi 5-20% 7, 13. Prewalencja dla tych badań wyniosła 16%. Poniższe wykresy przedstawiają przykłady wyników pacjentów bez objawów klinicznych lub symptomów aspergilozy inwazyjnej (ujemni w kierunku antygenu galaktomannanowego) i pacjentów z potwierdzoną aspergilozą inwazyjną (dodatni w kierunku antygenu galaktomannanowego). Pacjent Ujemny : PACJENT KONTROLNY indeks 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, dni 13

14 Pacjent Dodatni : PACJENT Z POTWIERDZONĄ INWAZYJNĄ ASPERGILOZĄ indeks 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, dni 15 CHARAKTERYSTYKA TESTU A Powtarzalność Powtarzalność wewnątrz-testowa i odtwarzalność między seriami dla testu Platelia Aspergillus EIA oceniano oznaczając panel 6 spulowanych próbek surowicy pacjentów (jedna ujemna, jedna słabo reaktywna, dwie dodatnie i dwie silnie reaktywne), otrzymanych z trzech laboratoriów klinicznych w Ameryce Północnej. Każda z 6 próbek była oznaczana w tryplikacie (x3) przez 3 dni, w jednej serii, w dwóch różnych laboratoriach (całkowita liczba replikatów oznaczonych w każdym laboratorium = 9). Każda z 6 próbek była oznaczana w duplikacie (x2) przez 3 dni, w jednej serii, w trzecim laboratorium (całkowita liczba replikatów oznaczonych w trzecim laboratorium = 6). W każdym laboratorium wszelkie operacje związane z oznaczeniami wykonywała jedna osoba. Analizę danych przeprowadzono zgodnie z zaleceniami Narodowego Komitetu d/s Standardów Laboratoryjnych (NCCLS). W poniższych tabelach przedstawiono średnie wartości gęstości optycznej (OD) oraz średnie wartości indeksu, odchylenie standardowe (SD), współczynnik zmienności (%CV) oznaczane w badaniach powtarzalności wewnątrz i między-laboratoryjnej dla każdej próby z panelu w każdym z laboratoriów. 14

15 B Reakcje krzyżowe Potencjalne interferencje czynników klinicznych niezwiązanych z aspergilozą inwazyjną zbadano dla jednej serii testu Platelia Aspergillus EIA. Reakcje krzyżowe w teście Platelia Aspergillus EIA oznaczono z użyciem podanych niżej surowic. Przebadano 151 próbek surowic. 15

16 Patologia Liczba zbadanych próbek Czynnik reumatoidalny 10 0 Dodatnie ANA 10 0 IgG Hypergammaglobulinemia 10 0 IgM Hypergammaglobulinemia 10 0 Nowotwór * 11 0 Marskość wątroby o etiologii niewirusowej (żółciowa pierwotna; poalkoholowa; polekowa) Liczba próbek dodatnich 10 0 Wielokrotne transfuzje 10 0 Wieloródki 10 0 HAV 10 0 HCV 10 0 Różyczka 10 0 CMV 10 0 Kiła (RPR+) 10 0 Toksoplazmoza 10 0 Mykoplazmy 10 0 * pęcherza, sutka (2), okrężnicy, śluzówki macicy, płuca, prostaty, nerek i płaskokomórkowy (3). C Badania Kliniczne Badania kliniczne w celu określenia czułości, swoistości i wartości predykcyjnych dla testu Platelia Aspergillus wykonano w dwóch laboratoriach, w Belgii i w Holandii. Badania przeprowadzono na 4873 próbkach surowic pochodzących od 203 pacjentów z następujących grup*: pacjenci bez objawów aspergilozy inwazyjnej (grupa kontrolna) pacjenci z prawdopodobną aspergilozą inwazyjną pacjenci z potwierdzoną aspergilozą inwazyjną * Invasive Fungal Infection Cooperative Group (IFICG) działająca przy Europejskiej Organizacji na rzecz Badań i Leczenia Raka (EORTC) i oraz Mycosis Study Group (MSG przy NIAID) zdefiniowały kryteria diagnozowania inwazyjnej aspergilozy (IA) u pacjentów z nowotworami złośliwymi krwi oraz po przeszczepie szpiku kostnego 2. Potwierdzona inwazyjna aspergiloza została zdefiniowana jako potwierdzona przez dodatnią hodowlę mikrobiologiczną uzyskaną z zachowaniem aseptyki z miejsc zmienionych chorobowo, histopatologiczne potwierdzenie odpowiedniej formy morfologicznej grzyba oraz objawy kliniczne związane z infekcją grzybiczą. Prawdopodobna inwazyjna aspergiloza została zdefiniowane jako potwierdzona przez jedno kryterium mikrobiologiczne oraz przez co najmniej jedno pierwszorzędowe lub dwa drugorzędowe kryteria kliniczne związane z miejscem odpowiadającym zakażeniu. u pacjenta z objawami klinicznymi związanymi z infekcją grzybiczą. Możliwa inwazyjna aspergiloza została zdefiniowana jako potwierdzona przez jedno kryterium mikrobiologiczne lub przez co najmniej jedno pierwszorzędowe lub dwa drugorzędowe kryteria kliniczne związane z miejscem odpowiadającym zakażeniu. u pacjenta z objawami klinicznymi związanymi z infekcją grzybiczą. Z uwagi na rzadkie występowanie potwierdzonej i prawdopodobnej aspergilozy, do celów niniejszego badania przyjęliśmy następujące definicje czułości i swoistości klinicznej. 16

17 CZUŁOŚĆ Wyniki oznaczeń z użyciem omawianego testu analizowano jako czułość w odniesieniu do pacjenta. Czułość testu oznaczono dla Platelia Aspergillus EIA w dwóch niezależnych laboratoriach, na próbkach pochodzących w sumie z 38 epizodów, od pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego (BMT) i z białaczkami, z aspergilozą inwazyjną potwierdzoną lub prawdopodobną. 1. Aspergiloza potwierdzona (wg definicji IFICG / EORTC; patrz wyżej) Łącznie N = 19 epizodów u 16 pacjentów Czułość: 100% (19/19). Uwaga: Z powodu niedostatecznej ilości próbek nie można było obliczyć 95% przedziału ufności. 2. Aspergiloza prawdopodobna (wg definicji IFICG / EORTC; patrz wyżej) Łącznie N = 19 epizodów u 19 pacjentów Czułość: 94.7% (18/19). Uwaga: Z powodu niedostatecznej ilości próbek nie można było obliczyć 95% przedziału ufności. 3. Łącznie: aspergiloza potwierdzona i prawdopodobna (wg definicji IFICG / EORTC; patrz wyżej) Łącznie N = 38 epizodów u 35 pacjentów Czułość: 97.4% (37/38). 95% przedział ufności %. SWOISTOŚĆ Swoistość określono dla testu Platelia Aspergillus EIA w dwóch niezależnych laboratoriach, na 3691 próbkach pochodzących z 201 epizodów (168 pacjentów) bez objawów aspergilozy inwazyjnej (grupa kontrolna). Laboratorium 1: N = 3060 próbek, 103 epizody (70 pacjentów) Swoistość: 92.2% (95/103) 95% przedział ufności %. Laboratorium 2: N = 631 próbek, 98 epizodów (98 pacjentów) Swoistość: 88.8% (87/98) 95% przedział ufności %. Łącznie N = 3691 próbek, 201 epizodów (168 pacjentów) Swoistość: 90.5% (182/201) 95% przedział ufności %. WARTOŚĆ PREDYKCYJNA Dodatnia wartość predykcyjna i ujemna wartość predykcyjna (PPV, NPV) została określona dla badanej populacji w oparciu o średnią 16% prewalencję obserwowaną w tym badaniu. PPV: 66.1% (37/56) NPV: 99.4% (182/183) Analizy wykonywano również dla wyników dodatnich uznawanych jako 2 kolejne próbki o indeksie wyższym lub równym 0.5. Charakterystykę testu przedstawia poniższa tabela: Czułość* Swoistość PPV NPV Łącznie uwzględniając 1 próbkę % (37/38) 90.5% (182/201) 66.1% (37/56) 99.4% (182/183) Łącznie uwzględniając 2 kolejne próbki % (35/38) 97.5% (196/201) 87.5% (35/40) 98.5% (196/199) *: czułość obliczono dla potwierdzonej i prawdopodobnej aspergilozy inwazyjnej 16 KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Wszystkie produkty Bio-Rad są przygotowane zgodnie z naszym systemem jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Każda seria ostatecznego produktu podlega oznaczeniu kontrolnemu i jest dopuszczona do użytku, jeśli spełnia wymagane kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii. 17

18 17 LITERATURA 1. Ansorg, R., R. Van Den Boom, and P. M. Rath Detection of Aspergillus galactomannan antigen in foods and antibiotics. Mycoses 40: p Ascioglu, S., J. H. Rex, B. De Pauw, J. E. Bennett, J. Bille, F. Crokaert, D. W. Denning, J. P. Donnelly, J. E. Edwards, Z. Erjavec, D. Fiere, O. Lortholary, J. Maertens, J. F. Meis, T. F. Patterson, J. Ritter, D. Selleslag, P. M. Shah, D. A. Stevens and T. J. Walsh Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin. Infect. Dis. 34: p Aubry, A., R. Porcher, J. Bottero, S. Touratier, T. Leblanc, B. Brethon, P. Rousselot, E. Raffoux, J. Menotti, F. Derouin, P. Ribaud and A. Sulahian Occurrence and kinetics of false-positive Aspergillus galactomannan test results following treatment with beta-lactam antibiotics in patients with hematological disorders. J. Clin. Microbiol. 44 (2): p Blijevens, N. M., J. P. Donnelly, J. F. Meis, P. E. Verweij, and B. E. De Pauw Aspergillus galactomannan antigen levels in allogeneic haematopoietic stem cell transplant recipients given total parenteral nutrition. Transpl. Infect. Dis. 4: p Chambon-Pautas, C., J. M. Costa, M. T. Chaumette, C. Cordonnier, and S. Bretagne Galactomannan and polymerase chain reaction for the diagnosis of primary digestive aspergillosis in a patient with acute myeloid leukaemia. J. Infect. 43: p De Repentigny, L., L. Kaufman, G. T. Cole, D. Kruse, J. P. Latge, and R. C. Matthews Immunodiagnosis of Invasive Fungal Infections. J. Med. Vet. Mycol. 32: p Denning, D. W Invasive Aspergillosis. Clin. Infect. Dis. 26: p Dupont, B., M. Richardson, P. E. Verweij, and J. F. G. M. Meis Invasive Aspergillosis. Medical Mycology 38: p Erjavec, Z. and P. E. Verweij Recent progress in the diagnosis of fungal infections in the immunocompromised host. Drug Resist. Updat. 5: p Gangneux, J. P., D. Lavarde, S. Bretagne, C. Guiguen, and V. Andemer Transient Aspergillus antigenaemia: think of milk. Lancet 359: p Hage,C. A., J. M. Reynolds, M. Durkin, L. J. Wheat, K. S. Knox Plasmalyte as a Cause of false-positive results for Aspergillus galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid. J. Clin. Microbiol. 45: p Herbrecht, R., V. Letscher-Bru, C. Oprea, B. Lioure, J. Waller, F. Campos, O. Villard, K. L. Liu, S. Natarajan-Ame, P. Lutz, P.Dufour, J. P. Bergerat, and E. Candolfi Aspergillus galactomannan detectionin the diagnosis of Invasive Aspergillosis in cancer patients. J. Clin. Oncol. 20: p Herbrecht, R., D. Denning, T. Patterson, J. Bennett, R. Greene, J. Oestmann, W. Kern, K. Marr, P. Ribaud, O. Lortholary, R. Sylvester, R. Rubin, J. Wingard, P. Stark, C. Durand, D. Caillot, E. Thiel, P. Chandrasekar, M. Hodges, H. Schlamm, P. Troke, B. DePauw Voriconazole Versus Amphotericin B for Primary Therapy of Invasive Aspergillosis. N. Engl. J. Med. 347, 6: p Latge, J. P Tools and trends in the detection of Aspergillus fumigatus. Curr. Top. Med. Mycol. 6: p Latge, J. P Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Clin. Microbiol. Rev. 12[2], Latge, J. P., H. Kobayashi, J. P. Debeaupuis, M. Diaquin, J. Sarfati, J. M. Wieruszeski, E. Parra, J. P. Bouchara, and B. Fournet Chemical and immunological characterization of the extracellular galactomannan of Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 62: p Letscher-Bru, V., A. Cavalier, E. Pernot-Marino, H. Koenig, D. Eyer, J. Waller, and E. Candolfi Recherche d'antigène galactomannane aspergillaire circulant par PlateliaTM Aspergillus: antigénémies positives persistantes en l'absence d'infection. J. Med. Mycol. 8: p

19 18. Maertens, J., J. Verhaegen, H. Demuynck, P. Brock, G. Verhoef, P. Vandenberghe, J. Van Eldere, L. Verbist, and M. Boogaerts Autopsy-controlled prospective evaluation of serial screening for circulating galactomannan by a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for hematological patients at risk for Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 37: p Maertens, J., J. Verhaegen, K. Lagrou, J. Van Eldere, and M. Boogaerts Screening for circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool for Invasive Aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood 97: p Marr K. A., M. Laverdiere, A. Gugel and W. Leisenring Antifungal therapy decreases sensitivity of the Aspergillus galactomannan enzyme immunoassay. Clin. Infect. Dis. 40: p Mattei, D., D. Rapezzi, N. Mordini, F. Cuda, C. Lo Nigro, M. Musso, A. Arnelli, S. Cagnassi, and A. Gallamini False-positive Aspergillus galactomannan enzyme-linked immunosorbent assay results in vivo during amoxicillin-clavulanic acid treatment. J. Clin. Microbiol. 42: p Mennink-Kersten M. A. S. H., D. Ruegebrink, R. Klont, A. Warris, H. J. M. Op den Camp and P. Verweij Bifidobacterial Lipoglycan as a New Cause for False-Positive Platelia Aspergillus Enzyme Immunoabsorbent Assay Reactivity. J. Clin. Microbiol. 43(8): p Nareddy, S., P. H. Chandrasekar False-positive Aspergillus galactomannan (GM) assay in histoplasmosis. J. Infection 56: p Racil, Z., I. Kocmanova, M. Lengerova, J. Winterova, J. Mayer Intravenous PLASMALYTE as a Major Cause of False-Positive Results of Platelia Aspergillus EIA Test for Galactomannan Detection in Serum. J. Clin. Microbiol. 45(2): p Rimek, D., T. Zimmermann, M. Hartmann, C. Prariyachatigul, and R. Kappe Disseminated Penicillium marneffei infection in an HIV-positive female from Thailand in Germany. Mycoses 42: p Siemann, M., M. Koch-Dorfler, and M. Gaude False positive results in premature infants with the PlateliaTM Aspergillus sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Mycoses 41: p Stynen, D., A. Goris, J. Sarfati, and J. P. Latge A new sensitive sandwich enzymelinked immunosorbent assay to detect galactofuran in patients with Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 33: p Stynen, D., J. Sarfati, A. Goris, M. C. Prevost, M. Lesourd, H. Kamphuis, V. Darras, and J. P. Latge Rat monoclonal antibodies against Aspergillus galactomannan. Infect. Immun. 60: p Sulahian, A., F. Boutboul, P. Ribaud, T. Leblanc, C. Lacroix, and F. Derouin Value of antigen detection using an enzyme immunoassay in the diagnosis and prediction of Invasive Aspergillosis in two adult and pediatric hematology units during a 4-year prospective study. Cancer 91: p Sulahian, A., M. Tabouret, P. Ribaud, J. Sarfati, E. Gluckman, J. P. Latge, and F. Derouin Comparison of an enzyme immunoassay and latex agglutination test for detection of galactomannan in the diagnosis of Invasive Aspergillosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15: p Surmont,I., W. Stockman Gluconate-containing intravenous solutions: Another cause of false-positive galactomannan assay reactivity. J. Clin. Microbiol. 45: p Swanink, C. M., J. F. Meis, A. J. Rijs, J. P. Donnelly, and P. E. Verweij Specificity of a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detecting Aspergillus galactomannan. J. Clin. Microbiol. 35: p Verweij, P. E., E. C. Dompeling, J. P. Donnelly, A. V. Schattenberg, and J. F. Meis Serial monitoring of Aspergillus antigen in the early diagnosis of Invasive Aspergillosis. Preliminary investigations with two examples. Infection 25: p

20 34. Verweij, P. E. and J. F. Meis Microbiological diagnosis of Invasive Fungal Infections in transplant recipients. Transpl. Infect. Dis. 2: p Verweij, P. E., D. Stynen, A. J. Rijs, B. E. de Pauw, J. A. Hoogkamp -Korstanje, and J. F. Meis Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay compared with Pastorex latex agglutination test for diagnosing Invasive Aspergillosis in immunocompromised patients. J. Clin. Microbiol. 33: p Verweij, P. E., C. M. Weemaes, J. H. Curfs, S. Bretagne, J. F. Meis Failure to detect circulating Aspergillus markers in a patient with chronic granulomatous disease and Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 38: p Walsh T. J., R.L. Schaufele, T. Sein, J. Gea-Banacloche, M. Bishop, N. Young, R. Childs, J. Barrett, H. L. Malech, and S.M. Holland Reduced expression of galactomannan antigenemia in patients with Invasive Aspergillosis and chronic granulomatous disease or Job s syndrome. Abstracts of the 40th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America. Arlington, VA. P. 105 ; Abstr Wheat, L. J., E. Hackett, M. Durkin, P. Connolly, R. Petraitiene, T. J. Walsh, K. Knox, C. Hage Histoplasmosis-associated cross-reactivity in the Bio-Rad Platelia Aspergillus enzyme immunoassay. Clin. Vaccine Immunol. 14 (5): p Yeo, S. F. and B. Wong Current Status of Nonculture Methods for Diagnosis of Invasive Fungal Infections. Clin. Microbiol. Rev. 15: p