Monolisa Anti-HBs PLUS 2 płytek

Transkrypt

1 Monolisa Anti-HBs PLUS 2 płytek TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO WYKRYWANIA I OZNACZANIA POZIOMU PRZECIWCIAŁ PRZECIWKO ANTYGENOWI POWIERZCHNIOWEMU WIRUSA ZAPALENIA WĄTROBY TYPU B (anty-hbs) W LUDZKIEJ SUROWICY LUB OSOCZU /01

2 SPIS TREŚCI 1. PRZEZNACZENIE 2. ZNACZENIE KLINICZNE 3. ZASADA TESTU 4. SKŁAD ZESTAWU 5. ZALECENIA DLA UśYTKOWNIKA 6. BEZPIECZEŃSTWO I HIGIENA PRACY 7. MATERIAŁY POTRZEBNE ALE NIEDOSTARCZONE W ZESTAWIE 8. PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW 9. PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ 10. PRÓBKI 11. PROCEDURA TESTU 12. WALIDACJA WYNIKÓW DLA METODY JAKOŚCIOWEJ I ILOŚCIOWEJ 13. OBLICZANIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW 14. SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBEK I ODCZYNNIKA 15. OGRANICZENIA TESTU 16. CHARAKTERYSTYKA TESTU 17. LITERATURA 2 [PL]

3 1. PRZEZNACZENIE Monolisa Anti-HBs PLUS jest immunoenzymatycznym testem przeznaczonym do jakościowego i ilościowego oznaczania całkowitego poziomu przeciwciał przeciw antygenowi powierzchniowemu wirusa zapalenia wątroby typu B (anty-hbs) w ludzkiej surowicy lub osoczu. 2. ZNACZENIE KLINICZNE Obecność przeciwciał przeciw antygenowi HBs jest ważnym czynnikiem w diagnozowaniu i rokowaniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV). W ostrym zapaleniu wątroby typu B, przeciwciała anty-hbs pojawiają się u prawie 80% pacjentów w ciągu 1 do 3 miesięcy po pojawieniu się antygenu wirusowego zapalenia wątroby typu B (HBsAg). Przeciwciała anty-hbs są wykorzystywane w badaniach epidemiologicznych do oceny narażenia w przeszłości na zapalenie wątroby typu B u potencjalnych biorców szczepionek przeciwko zapaleniu wątroby typu B, do monitorowania skuteczności szczepień i do selekcji osocza o wysokim mianie przeciwciał, stosowanego do otrzymywania specyficznych immunoglobulin. Monolisa Anti-HBs PLUS jest bezpośrednim, kanapkowym testem immunoenzymatycznym, który wykorzystuje jako fazę stałą, polistyrenowe studzienki opłaszczone natywnym HBsAg (podtypy ad i ay) i koniugat zawierający antygen HBs znakowany peroksydazą chrzanową (ludzki, podtyp ad i ay). Oznaczanie poziomu przeciwciał anty-hbs zostało ujednolicone przez stosowanie WHO Anti-HBs Reference Preparation wyrażane w mili-jednostkach międzynarodowych na mililitr (mlu/ml). Poziom wyższy lub równy 10 mlu/ml jest ogólnie uznawany jako poszczepienna ochrona przeciwko HBV. Stwierdzenie przynajmniej minimalnego miana anty-hbs 10 mlu/ml, czyli progu ochronnego, ma zasadnicze znaczenie w postępowaniu z osobami szczepionymi, które mogą być narażone na kontakt z HBsAg dodatnimi płynami i próbkami. 3. ZASADA TESTU W teście, próbki pochodzące od pacjenta oraz kontrole są inkubowane z antygenem opłaszczonym w studzienkach Jeśli przeciwciała anty-hbs są obecne w próbce lub kontroli, zostaną one związane z antygenem. Nadmiar próbki jest usuwany w fazie płukania. Następnie do studzienek dodawany jest koniugat. Koniugat wiąże się z kompleksami antygen-przeciwciało obecnymi w studzienkach. Nadmiar koniugatu jest usuwany w fazie płukania, a następnie do studzienek dodaje się roztwór chromogen/substrat i inkubuje. Jeśli próbka zawiera przeciwciała anty-hbs, związany enzym (HRP) powoduje zabarwienie tetrametylobenzydyny (TMB), roztwór chromogenu zmienia barwę na niebieską. Po dodaniu roztworu zatrzymującego reakcję, zabarwienie niebieskie zmienia się na żółte. Jeśli próbka nie zawiera przeciwciał anty-hbs, roztwór chromogen/substrat w dołku pozostaje bezbarwny podczas inkubacji substratu oraz po dodaniu roztworu zatrzymującego. Intensywność zabarwienia, mierzona spektrofotometrycznie, jest proporcjonalna do ilości anty-hbs w próbce. Odczyty wartości absorbancji dla próbek pacjentów porównuje się do wartości granicznej wyznaczonej za pomocą kalibratora 10 miu/ml. 3 [PL]

4 4. SKŁAD ZESTAWU Wszystkie odczynniki są przeznaczone wyłącznie do użytku in vitro. R1 Etykieta Microplate Rodzaj Odczynnika Mikropłytka 12 pasków po 8 dołków, opłaszczonych mieszaniną HBsAg - podtypy ad i ay, pochodzenia ludzkiego Ilość mikropłytki R2 Concentrated washing solution (20X) Bufor Płuczący (20X) Bufor Tris NaCl, ph 7.4 Konserwant : Proclin 300 (0,04%) 235 ml C0 Negative control Anti-HBs Kontrola Ujemna Bufor z płodową surowicą cielęcą i stabilizatorami białek Środek konserwujący : ProClin 300 (0,5%) (2,2 ml) C1 10 mlu/ml calibrator 10 miu/ml Kalibrator* Bufor z przeciwciałami anty-hbs pochodzenia ludzkiego, płodowa surowica cielęca, stabilizatory białek i wskaźnik Środek konserwujący : ProClin 300 (0,5%) (3 ml) C2 100 mlu/ml calibrator positive control 100 miu/ml Kalibrator - Kontrola Dodatnia Bufor z przeciwciałami anty-hbs pochodzenia ludzkiego, płodowa surowica cielęca, stabilizatory białek i wskaźnik barwny Środek konserwujący : ProClin 300 (0,5%) (2,2 ml) C3 400 mlu/ml calibrator 400 miu/ml Kalibrator Bufor z przeciwciałami anty-hbs pochodzenia ludzkiego, płodowa surowica cielęca, stabilizatory białek i wskaźnik barwny Środek konserwujący : ProClin 300 (0,5%) (2,2 ml) C mlu/ml calibrator 1000 miu/ml Kalibrator Bufor z przeciwciałami anty-hbs pochodzenia ludzkiego, płodowa surowica cielęca, stabilizatory białek i wskaźnik barwny Środek konserwujący : ProClin 300 (0,5%) (2,2 ml) R6 Specimen diluent R7a Conjugate (11X) R7b Conjugate diluent R8 R9 Substrate buffer Chromogen: TMB solution (11X) R10 Stopping solution Rozcieńczalnik Próbek Bufor z surowicą płodu cielęcego, stabilizatory białek i wskaźnik barwny Środek konserwujący : ProClin 300 (0,1%) Skoncentrowany Koniugat (11X) Bufor z HBsAg (podtyp ad i ay) opłaszczony peroksydazą i stabilizatory białek Środek konserwujący : ProClin 300 (0,5%) Rozcieńczalnik Koniugatu Bufor z surowicą płodu cielęcego i stabilizatorami białek Środek konserwujący : ProClin 300 (0,1%) Bufor Substratu Roztwór kwasu cytrynowego i octanu sodu, ph 4.0 Zawiera H 2 O 2 (0,015 %) i DMSO (4%) Chromogen Roztwór zawierający tetrametylobenzydynę (TMB) Roztwór Zatrzymujący Reakcję 1 N kwas siarkowy (27 ml) (2,5 ml) (25 ml) (60 ml) (5 ml) (28 ml) * Kontrole kalibrowane są z użyciem standardów wewnętrznych, skalibrowanych według 1 st IRP WHO [PL]

5 Zestaw należy przechowywać w temperaturze +2-8 C. Odczynniki, z wyjątkiem skoncentrowanego koniugatu, przed użyciem należy przenieść do temperatury pokojowej (18-30 C). Natychmiast po użyciu, odczynniki powinny być przeniesione do temperatury +2-8 C. Niewykorzystane paski/płytki należy włożyć do pojemników i zamknąć szczelnie. Nie usuwać środka odwadniającego. Paski / płytki przechowywać w temperaturze +2-8 C. 5. ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania następujących zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nazwa testu oraz specjalny numer identyfikacyjny danego testu są podane na obramowaniu każdej mikropłytki. Ten sam numer identyfikacyjny znajduje się również na każdym pasku. Monolisa Anti-HBs PLUS: Specific ID number = 63. Sprawdź specjalny numer identyfikacyjny przed każdym użyciem testu, jeżeli numeru identyfikacyjnego brak lub różni się od podanego powyżej, paska nie należy używać. Nie używać odczynników przeterminowanych. Podczas przeprowadzania testu nie mieszać odczynników pochodzących z różnych serii. UWAGA: Podczas danego oznaczenia można używać odczynników z innej ale identycznej serii w przypadku: roztworu płuczącego (R2, oznaczonego: 20X na zielono), buforu do peroksydazy (R8, oznaczonego: TMB buf na niebiesko), chromogenu (R9, oznaczonego: TMB 11X na purpurowo) oraz roztworu zatrzymującego reakcję (R10, oznaczonego: 1N na czerwono) Odczynników tych można używać w niektórych innych testach Bio-Rad. Ponadto, prawidłowo rekonstytuowany roztwór płuczący (R2, oznaczony: 20X na zielono) może być używany wymiennie z dwoma innymi roztworami płuczącymi obecnymi w zestawach testowych firmy Bio-Rad (R2, oznaczony: 10X na niebiesko lub 10X na pomarańczowo) ; pod warunkiem stosowania jednego rodzaju buforu w serii oznaczeń. Szczegółowych informacji udzieli serwis techniczny. Przed użyciem należy odczekać 30 min, aby odczynniki osiągnęły temperaturę pokojową. Odczynniki rekonstytuować ostrożnie, unikając zanieczyszczenia. Nie wykonywać testu w obecności reaktywnych par związków (zasadowych, kwasów i aldehydów) oraz kurzu mogących wpływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. Używać dokładnie umytego szkła wypłukanego w wodzie destylowanej lub, co jest wskazane, sprzętu jednorazowego. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki pomiędzy etapem płukania a dodawaniem kolejnego odczynnika. Reakcje enzymatyczne są bardzo wrażliwe na obecność metali lub jony metali. W związku z tym, nie należy dopuszczać do kontaktu roztworów, które zawierają koniugat lub substrat z żadnymi częściami metalowymi. Roztwór wywołujący (bufor substratu + chromogen) musi być różowy. Zmiana koloru w kilka minut po rekonstytucji wskazuje, że odczynnik nie może być użyty i należy go zastąpić innym. Roztwór wywołujący można przygotować w czystej, plastikowej rynience jednorazowego użytku lub szklanym naczyniu, umytym uprzednio 1N HCl, starannie wypłukanym wodą destylowaną i wysuszonym. Odczynnik należy przechowywać w ciemnym miejscu. Do każdej badanej próbki zmieniać końcówkę pipety. Płukanie studzienek jest istotnym etapem oznaczenia; należy przestrzegać przewidzianych cykli płukania, oraz zwracać uwagę, czy studzienki są prawidłowo 5 [PL]

6 napełniane i całkowicie opróżniane. Niewłaściwe płukanie może być przyczyną błędnych wyników. Nigdy nie używać tego samego pojemnika na koniugat i roztwór substratu. 6. BEZPIECZEŃSTWO I HIGIENA PRACY Monolisa Anti-HBs PLUS zawiera składniki ludzkiej krwi, materiał ten został zbadany i był ujemny pod względem HBsAg, przeciwciał przeciwko wirusowi hepatitis C oraz przeciwciał przeciwko ludzkim wirusom niedoboru odporności (anty-hiv1 i anty-hiv2). Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki oraz badane próbki powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny. Materiały mające kontakt z próbkami lub odczynnikami pochodzenia ludzkiego, a także zużyty roztwór płuczący, należy traktować jako materiał zakaźny. Unikać rozlania próbek i odczynników je zawierających. Podczas pracy z odczynnikami i próbkami należy nosić rękawice jednorazowego użytku, po pracy należy starannie umyć ręce. Nie pipetować ustami. Próbki, odczynniki zawierające materiał pochodzenia ludzkiego, jak również skażone materiały należy wyrzucić po odkażeniu: - albo poprzez moczenie w wybielaczu o stężeniu końcowym 5% podchlorynu sodu (1 objętość wybielacza na 10 objętości skażonej cieczy lub wody) przez 30 minut, - lub przez autoklawowanie w 121 C przez minimum 2 godz. Autoklawowanie w 121 C przez minimum godzinę jest najlepszą metodą inaktywacji wirusów HIV i HBV. UWAGA: NIE WSTAWIAĆ ROZTWORÓW ZAWIERAJĄCYCH PODCHLORYN SODU DO AUTOKLAWU. Zanieczyszczone powierzchnie czyścić 10% roztworem podchlorynu. Jeśli nastąpiło zanieczyszczenie kwasem, należy go najpierw zneutralizować dwuwęglanem sodu i osuszyć bibułą. Materiał używany do czyszczenia wyrzucić do pojemnika na zanieczyszczone odpady. Nigdy nie zapominać o neutralizacji i/lub autoklawowaniu roztworów i innych płynów zawierających materiał biologiczny przed wylaniem do zlewu. Karta charakterystyki substancji jest dostępna na życzenie. W celu zapoznania się z zaleceniami dotyczącymi zagrożeń i środków ostrożności związanych z niektórymi substancjami chemicznymi zawartymi w niniejszym zestawie należy skorzystać z piktogramów wskazujących rodzaj zagrożenia znajdujących się na etykietach i w informacjach zamieszczonych na końcu instrukcji obsługi. Karta charakterystyki jest dostępna na stronie internetowej 7. MATERIAŁY POTRZEBNE ALE NIEDOSTARCZONE W ZESTAWIE Woda destylowana lub całkowicie dejonizowana. Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu. Pipety ręczne lub półautomatyczne, z możliwością regulowania lub bez, pozwalające odmierzać i dozować od 10 µl do 200 µl, 1 ml, 5 ml i 10 ml. Cylindry miarowe: 25 ml, 100 ml i 1000 ml. Pojemnik na materiał zakaźny. Łaźnia wodna lub suchy inkubator z termostatem ustawionym na 37 C ± 1 C. Automatyczne, półautomatyczne lub ręczne urządzenie do płukania mikropłytek. Czytnik mikropłytek (wyposażony w filtry 490, 450 i 620 nm). Bibuła. Rękawice jednorazowego użytku. Czyste polipropylenowe pojemniki do przygotowywania TMB. 6 [PL]

7 8. PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW Przed użyciem, odczynniki zestawu Monolisa Anti-HBs PLUS należy wystawić na 30 min, aby osiągnęły temperaturę pokojową. 1) Odczynniki gotowe do użycia Mikropłytka (R1) Każda ramka zawierająca 12 pasków zapakowana jest w torebkę z zamknięciem strunowym. Torebkę należy przeciąć nożyczkami lub skalpelem cm powyżej zamknięcia. Otworzyć opakowanie, wyjąć potrzebną liczbę pasków. Pozostałe paski umieścić w torebce. Torebkę należy szczelnie zamknąć i przechowywać w temperaturze +2-8 C. Rozcieńczalnik próbki (R6) Kontrola ujemna anty-hbs (C0) Kalibrator 10 miu/ml (C1) Kalibrator 100 miu/ml - Kontrola dodatnia (C2) Kalibrator 400 miu/ml (C3) Kalibrator 1000 miu/ml (C4) Przed użyciem wymieszać odczynniki na vorteksie lub odwracając delikatnie pojemniki. 2) Odczynniki do rekonstytucji Skoncentrowany roztwór do płukania R2 (20X) Rozcieńcz roztwór do płukania R2 w stosunku 1:20 wodą destylowaną. Wymieszaj. Przygotować 800 ml na jedną płytkę zawierającą 12 pasków. Roztwór koniugatu (R7a + R7b) Przenieś rozcieńczalnik koniugatu (R7b) do temperatury pokojowej. Wymieszaj rozcieńczalnik koniugatu (R7b, bezbarwny lub jasnosłomkowy) i skoncentrowany koniugat (R7a, zielony) przed użyciem. Przygotuj rozcieńczenie 1:11 dla każdego używanego paska (np.: dodaj 100 µl koncentratu koniugatu (R7a) do każdego 1 ml rozcieńczalnika koniugatu (R7b) w czystej, polipropylenowej probówce). Rozcieńczenia wykonaj według poniższej tabeli. Wymieszaj dobrze, ale delikatnie aby uniknąć spienienia. Roboczy roztwór koniugatu należy chronić od światła, zarówno w temperaturze pokojowej jak i w temperaturze +2-8 C. Roboczy roztwór koniugatu powinien mieć zabarwienie zielone. W pokojowej temperaturze jest on stabilny przez 8 godz., a przechowywany w temp C - przez 2 tygodnie. Roztwór koniugatu można przygotować poprzez odpipetowanie całej zawartości fiolki koncentratu koniugatu (R7a) do rozcieńczalnika koniugatu (R7b). Zawsze mieszaj przez odwracanie roboczy roztwór koniugatu tuż przed użyciem. Niewykorzystany koncentrat koniugatu (R7a) wstaw natychmiast do lodówki. Aby uniknąć zanieczyszczenia koniugatu, stosuj czyste rękawiczki i nie dotykaj końcówek pipet. 7 [PL]

8 Przygotowywanie roztworu koniugatu w przeliczeniu na paski Ilość używanych pasków Objętość skoncentrowanego koniugatu R7a (µl) Objętość rozcieńczalnika koniugatu R7b (ml) * 1 Cała płytka ** 2 Całe płytki * 24** Roboczy roztwór substratu (R8 + R9) Przenieś chromogen (R9) i bufor substratu (R8) do temperatury pokojowej. Chromogen i bufor substratu (R8) wymieszaj przed użyciem. Rozcieńcz chromogen (R9) buforem substratu (R8) w stosunku 1:11 dla każdego używanego paska (np.: dodaj 1 ml odczynnika R9 do 10 ml odczynnika R8). Homogenizuj. Rozcieńczony roztwór substratu wymieszaj delikatnie przed użyciem. Odczekaj 5 min. Przed użyciem. Rozcieńczony roztwór substratu powinien być zużyty w ciągu 8 godz. po przygotowaniu i przechowywany w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej. Chromogen (R9) powinien mieć zabarwienie różowe. Inne zabarwienie wskazuje na zanieczyszczenie odczynnika: w takiej sytuacji chromogen nie może być używany. Przygotuj tylko taką ilość odczynników, która będzie zużyta w ciągu 6 godz., a objętość rozcieńczonych odczynników wystarczająca dla całego testu. Rozcieńczenia wykonaj według poniższej tabeli. Przygotowanie roztworu rozcieńczonego substratu w przeliczeniu paski. Ilość używanych pasków Objętość chromogenu R9 (µl) Objętość buforu substratu R8 (ml) * 24** * 1 Cała płytka ** 2 Całe płytki 9. PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ Zestaw przechowywać w temperaturze +2-8 C. Każdy z odczynników, przechowywany w tej temperaturze, może być wykorzystywany do daty ważności podanej na opakowaniu (z wyjątkiem specjalnych zaleceń). R1: Po otwarciu torby, paski mikropłytki przechowywane w szczelnie zamkniętej torbie, w temperaturze +2-8 C, mogą być wykorzystywane przez 1 miesiące. R2: Rozcieńczony bufor płuczący może być przechowywany w temperaturze C przez dwa tygodnie. Stężony bufor płuczący (R2) może być przechowywany w temperaturze C. R7a +R7b : Roboczy roztwór koniugatu należy chronić od światła, zarówno w temperaturze pokojowej jak i w temperaturze +2-8 C. Roztwór koniugatu w pokojowej temperaturze jest stabilny przez 8 godz. (18-30 C), a przechowywany w temp C - przez 2 tygodnie. 8 [PL]

9 R8+R9: Po rekonstytucji, odczynnik przechowywany w ciemności, w temperaturze pokojowej (18-30 C) może być używany przez 6 godzin. Po otwarciu wszystkie pozostałe odczynniki przechowywane w temperaturze +2-8 C pozostają stabilne aż do upływu terminu przydatności podanego na opakowaniu. 10. PRÓBKI Pobrać krew zgodnie ze rutynową procedurą. Oznaczenie powinno być wykonywane na próbkach surowicy lub osocza. Tylko następujące próbki zostały przetestowane: surowica pobrana do standardowej probówki zawierającej żel separujący, osocze pobrane na EDTA lub heparynę. W przypadku pobierania osocza na cytrynian lub ACD, wyniki w porównaniu z surowicą są niższe o 20%. Próbki zawierające agregaty należy odwirować przed badaniem. Agregaty fibryny lub inne cząstki mogą prowadzić do uzyskanie wyników fałszywie dodatnich. Próbki przechowywać w +2-8 C jeżeli badanie będzie przeprowadzane w ciągu 7 dni, lub zamrożone w -20 C. Unikać wielokrotnego zamrażania/rozmrażania. Unikać powtarzającego się zamrażania/rozmrażania próbek. Do transportu próbki należy zapakować zgodnie z przepisami określającymi zasady przewożenia materiałów zakaźnych, preferencyjnie zamrozić. UWAGA: Na oznaczenie nie wpływa do 90 g/l albuminy i 100 mg/l bilirubiny, poziom lipemii do zawartości równoważnika odpowiadającego 36 g/l trójglicerydów i hemoliza do 2,55 g/l hemoglobiny. Nie używać próbek po obróbce w 56 C przez 30 minut. 11. PROCEDURA TESTU Przestrzegaj ściśle protokołu. Stosuj surowice kontrolne dodatnie i ujemne dla każdej serii oznaczeń w celu walidacji jakości testu. Stosuj się do zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Metody 1. Przygotuj rozkład próbek i plan identyfikacji. 2. Przed wykonaniem oznaczenia, przenieś wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej. 3. Przygotuj roztwór koniugatu (R7a + R7b), rozcieńczony roztwór substratu (R8 + R9) i rozcieńczony roztwór do płukania (rozcieńczony R2). 4. Wyjmij ramkę i paski (R1) z opakowania. Niewykorzystane paski zastąp oznakowanymi ślepymi paskami. 5. Rozcieńcz próbki, kalibratory i próby kontrolne w stosunku 3:4 rozcieńczalnikiem próbek R6, zgodnie z jedną z poniższych procedur: a. Próbki, kalibratory i kontrole mogą być rozcieńczane w dołkach (dodaj 25 µl rozcieńczalnika próbek R6 do każdego dołka, a następnie w ciągu 15 min. 75 µl próbki lub kontroli, wymieszaj delikatnie, zasysając minimum 2 razy, unikając spienienia). b. Próbki, kalibratory i kontrole mogą być rozcieńczone w stosunku 3:4 rozcieńczalnikiem próbek R6 przed dodaniem ich do dołków (np. rozcieńcz 150 µl próbki w 50 µl rozcieńczalnika próbek R6, wymieszaj delikatnie unikając spienienia, a następnie przenieś 100 µl do dołka. UWAGA : Po dodaniu próbki, rozcieńczalnik zmieni barwę z purpurowej na niebieską. Możliwe jest potwierdzenie obecności próbek w dołkach poprzez spektrofotometryczny odczyt przy długości fali 620 nm (Patrz rozdział 14: SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBEK I ODCZYNNIKA). 9 [PL]

10 6. Dodawaj bezpośrednio, bez wcześniejszego płukania płytki, w zależności od wybranej metody: Oznaczenie jakościowe - Anty-HBs kontrola ujemna (C0) do dołka A1, - Kalibrator 10 miu/ml (C1) do dołka B1, C1 i D1, - Kalibrator 100 miu/ml Kontrola dodatnia (C2) do dołka E1, - Próbki do dołków F1, G1, itd. Oznaczenie ilościowe - Anty-HBs kontrola ujemna (C0) do dołka A1, - Kalibrator 10 miu/ml (C1) do dołków B1 i C1, - Kalibrator 100 miu/ml Kontrola dodatnia (C2) do dołka D1, - Kalibrator 400 miu/ml (C3) do dołka E1, - Kalibrator 1000 miu/ml (C4) do dołka F1, - Próbki do dołków G1, H1, itd. Zależnie od wykorzystywanego systemu, możliwe jest modyfikowanie pozycji kontroli i rozkładu nanoszonych odczynników. 7. O ile to możliwe, zaklej szczelnie płytkę folią adhezyjną. 8. Inkubuj płytki przez 60 ± 5 min. w temp. 37 ± 1 C. 9. Usuń folię adhezyjną. Zaaspiruj zawartość dołków do pojemnika na odpady ciekłe i dodaj natychmiast min. 375 µl roztworu płuczącego do każdego dołka. Namaczaj studzienki cyklami płukania przez 30 do 60 sek. Usuń zawartość dołków ponownie. Powtórz płukanie 4 razy (minimum 5 płukań). Pozostająca objętość płynu musi być mniejsza niż 10 µl (w razie potrzeby osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule). 10. Podczas płukania automatycznego stosuj tę samą procedurę. 11. Dodaj szybko 100 µl roztworu koniugatu (R7a + R7b) do każdego dołka. O ile to możliwe, przykryj szczelnie dołki nową folią i inkubuj 60 ± 5 min. w temp. 37 C ± 1 C. UWAGA: Koniugat ma kolor zielony. Możliwe jest potwierdzenie obecności koniugatu w dołkach poprzez spektrofotometryczny odczyt przy długości fali 620 nm (Patrz rozdział 14 : SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBEK I ODCZYNNIKA). 12. Usuń folię adhezyjną. Zaaspiruj zawartość dołków do pojemnika na odpady ciekłe i dodaj natychmiast min. 375 µl roztworu płuczącego do każdego dołka. Namaczaj studzienki cyklami płukania przez 30 do 60 sek. Usuń zawartość dołków ponownie. Powtórz płukanie 4 razy (minimum 5 płukań). Pozostająca objętość płynu musi być mniejsza niż 10 µl (w razie potrzeby osuszyć odwróconą mikropłytkę na bibule). 13. Podczas płukania automatycznego stosuj tę samą procedurę. 14. Dodaj szybko 100 µl rozcieńczonego roztworu substratu (R8 + R9) do każdego dołka. Pozostaw na 30 ± 5 min. w temperaturze pokojowej (18-30 C) w ciemności. Nie używaj folii adhezyjnej podczas tej inkubacji. UWAGA: Rozcieńczony roztwór substratu ma kolor różowy. Możliwe jest potwierdzenie obecności koniugatu w dołkach poprzez spektrofotometryczny odczyt przy długości fali 490 nm (Patrz rozdział 14: SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBKI I ODCZYNNIKA). 15. Dodaj 100µl roztworu zatrzymującego (R10) stosując tę samą kolejność i tempo dystrybucji jak dla rozcieńczonego roztworu substratu. Homogenizuj mieszaninę reakcyjną. 10 [PL]

11 16. Ostrożnie wytrzyj spód płytki. Odczytywać gęstość optyczną przy długości fali 450/ nm oraz 405/ nm, stosując czytnik mikropłytek, co najmniej 4 minuty ale nie dłużej niż 30 minut po zatrzymaniu reakcji. Przed zapisaniem wyników, sprawdź zgodność pomiędzy odczytem, mikropłytką, rozkładem próbek i planem identyfikacyjnym. 12. WALIDACJA WYNIKÓW DLA METODY JAKOŚCIOWEJ I ILOŚCIOWEJ Średnia absorbancja Kalibratora 10 miu/ml (C1) jest wartością cut-off dla testu. Dla kontroli ujemnej Anti-HBs (C0) Zmierzona wartość absorbancji musi być większa niż i mniejsza lub równa (0,000 < OD C0 0,070). Dla kontroli dodatniej (C2) Zmierzona wartość absorbancji musi być większa lub równa 0,400 (OD C2 0,400). Jeśli dla kontroli ujemnej (C0) i kontroli dodatniej (C2), któryś z powyższych warunków dla metody jakościowej i ilościowej nie jest spełniony, test jest nieważny i musi być powtórzony. Dla Kalibratora 10 miu/ml (C1) Zmierzona wartość absorbancji musi być większa lub równa 0,050 i mniejsza lub równa 0,200 (0,050 OD C1 0,200). Każda zmierzona wartość absorbancji musi być większa lub równa 1,5 OD wartości absorbancji dla negatywnej kontroli (C0) : OD C1 (1,5 x OD C0 ). W przypadku metody jakościowej Jeśli jedna z wartości dla Kalibratora 10 miu/ml nie mieści się w podanym zakresie (zmierzona wartość absorbancji musi być większa lub równa 0,050 i mniejsza lub równa 0,200), wówczas średnia absorbancja powinna być obliczona z pozostałych wartości absorbancji. Test jest ważny. Jeśli kilka zmierzonych wartości OD C1 nie mieści się w podanym zakresie, test jest nieważny i musi być powtórzony. W przypadku metody ilościowej Jeśli jedna z dwóch zmierzonych wartości OD C1 nie mieści się w podanym zakresie (zmierzona wartość absorbancji musi być większa lub równa 0,050 i mniejsza lub równa 0,200), wówczas test jest nieważny i musi być powtórzony. 13. OBLICZANIE I INTERPRETACJA WYNIKÓW Dla każdej próbki, porównanie zmierzonej wartości absorbancji z obliczoną wartością cut-off pozwala stwierdzić obecność lub brak przeciwciał anty-hbs. 1. Metoda jakościowa Obliczyć wartość średnią zmierzonej absorbancji dla Kalibratora 10 miu/ml (C1). Przykład : Kalibrator 10 miu/ml (C1) B1 0,078 C1 0,079 D1 0,089 Całkowita = 0,246 Średnia OD C1 = 0,246 / 3 = 0, [PL]

12 Jeśli jedna z wartości zmierzonej absorbancji nie mieści się w podanym zakresie, (zmierzona wartość absorbancji musi być większa lub równa 0,050 i mniejsza lub równa 0,200), wówczas średnia absorbancja powinna być obliczona z pozostałych dwóch wartości absorbancji. Obliczanie wartości cut-off (CO) Wartością graniczną dla tego testu jest średnia absorbancja 10 miu/ml Kalibratora (C1) : CO = Średnia OD C1 Interpretacja wyników Próbki o wartościach absorbancji większych lub równych wartości cut-off są uważane za reaktywne. Próbki o wartościach absorbancji mniejszych od wartości cut-off są uważane za niereaktywne. Próbki o wartościach większych niż górna granica liniowości powinny być raportowane jako reaktywne. UWAGA: Z powodu różnorodności przeciwciał i antygenów stosowanych w każdym teście, wyniki mogą być różne dla poszczególnych testów. Strategie szczepień : zalecenia zróżnicowane w zależności od regionu i kraju. W przypadku zmiany metod analitycznych w trakcie oceny skuteczności szczepień, w okresie przejściowym, poziom przeciwciał anty-hbs musi być oznaczany obiema metodami. 2. Metoda ilościowa Do oznaczenia poziomu przeciwciał anty-hbs w próbkach surowicy i osocza, należy użyć następującego kalibratora anty-hbs : C0 (0 miu/ml), C1 (10 miu/ml), C2 (100 miu/ml), C3 (400 miu/ml) i C4 (1000 miu/ml). Kalibratory dodaje się bezpośrednio do każdego dołka, bez wcześniejszego płukania i w kolejności opisanej w procedurze testu (Patrz rozdział 11 : PROCEDURA TESTU). Odczytaj gęstość optyczną przy 450/ nm stosując czytnik mikropłytek (A450). Dla próbek o wartościach absorbancji (A450) większych lub równych zmierzonej wartości absorbancji C3 : A450 OD C3 ), odczytaj gęstość optyczną przy 405/ nm. A450 dla kalibratorów C0, C1, C2 i C3 przedstawia się na wykresie względem ich przypisanego stężenia za pomocą regresji wielomianowej (kwadratowej). Zauważ, że wartość A450 dla Kalibratora 1000 miu/ml (C4) nie może być umieszczona na tym wykresie, gdyż powinna znajdować się ona poza zakresem odczytu spektrofotometru, a więc istnieje konieczność zrobienia drugiego wykresu. Próbki o zmierzonych wartościach absorbancji niższych niż OD C3 interpretuje się za pomocą wykresu otrzymanego dla A450 czterech kalibratorów. A405 dla kalibratorów C3 (400 miu/ml) i C4 (1000 miu/ml) przedstawia się na wykresie względem ich przypisanego stężenia metodą punkt do punktu. Przez te punkty przeprowadza się linię prostą. Następnie, wartości stężeń anty-hbs (miu/ml) dla każdej próbki odczytuje się na przecięciu odpowiednich wartości absorbancji. Krzywej A405 używa się do oznaczania stężeń w próbkach surowicy i osocza, których stężenia są wyższe niż 400 miu/ml i niższe lub równe 1000 miu/ml. Próbki o stężeniach anty-hbs wyższych niż 1000 miu/ml można rozcieńczyć rozcieńczonym roztworem do płukania (rozcieńczony R2) i ponownie oznaczyć. 12 [PL]

13 14. SPEKTROFOTOMETRYCZNA WERYFIKACJA PIPETOWANIA PRÓBKI I ODCZYNNIKA (NIEOBOWIĄZKOWE) WERYFIKACJA PIPETOWANIA ROZCIEŃCZALNIKA PRÓBEK (R6) I PRÓBKI Po dodaniu próbki, rozcieńczalnik próbek R6 zmienia barwę z purpurowej na niebieską. Możliwe jest potwierdzenie obecności próbki i rozcieńczalnika próbek (R6) w dołkach poprzez spektrofotometryczny odczyt przy długości fali 620 nm: wartość OD dla każdego dołka zawierającego próbkę lub rozcieńczoną rozcieńczalnikiem próbek kontrolę musi być większa lub równa 0,150 (wartość niższa wskazuje na złe odpipetowanie próbki lub kontroli). WERYFIKACJA PIPETOWANIA ROZTWORU KONIUGATU (R7a + R7b) Roztwór koniugatu (R7a + R7b) ma kolor zielony. Możliwe jest potwierdzenie obecności roztworu koniugatu w dołku poprzez spektrofotometryczny odczyt przy długości fali 620 nm: wartość OD dla każdego dołka musi być większa lub równa 0,070 (wartość niższa wskazuje na złe odpipetowanie roztworu koniugatu). WERYFIKACJA PIPETOWANIA ROZCIEŃCZONEGO ROZTWORU SUBSTRATU (R8+ R9) Rozcieńczony roztwór substratu (R8 + R9) ma kolor różowy. Możliwe jest potwierdzenie obecności różowego roztworu wywołującego w dołku poprzez automatyczny odczyt przy długości fali 490 nm: dołek z roztworem wywołującym musi mieć wartość gęstości optycznej większą niż 0,100 (niższa wartość OD wskazuje na złe odpipetowanie roztworu wywołującego). Po dodaniu rozcieńczonego roztworu substratu następuje wyraźna zmiana bezbarwnego, pustego dołka na kolor różowy. 15. OGRANICZENIA TESTU Podczas badania i interpretacji wyników należy przestrzegać procedury analizowania próbek surowicy i osocza na obecność przeciwciał przeciw HBs. Użytkownik tego zestawu powinien przeczytać dokładnie załączone instrukcje przed przystąpieniem do testu. W szczególności musi być dokładnie przestrzegana procedura odnośnie pipetowania próbki i odczynnika, płukania płytki i czasów inkubacji. Dodanie próbki lub odczynnika niezgodnie z procedurą może prowadzić do wyników fałszywie ujemnych. W przypadku podejrzenia błędu związanego z procedurą, zaleca się powtórzenie testu. Czynniki, które mogą wpływać na ważność wyników to nieprawidłowe dodanie próbki do dołka, niedokładne wypłukanie mikropłytki, złe czasy i temperatury inkubacji, dodanie złych odczynników do dołków, obecność metali lub wybielacza w dołkach. Z powodu zmiennej reakcji immunologicznej u różnych pacjentów, jak również po infekcji HBV w wyniku szczepienia lub terapeutycznej iniekcji immunoglobuliny, zaleca się ostrożność podczas interpretacji wyników w zakresie niskich wartości. 13 [PL]

14 16. CHARAKTERYSTYKA TESTU Wyniki własności analitycznych zamieszczone poniżej otrzymano podczas ewaluacji testu Monolisa Anti-HBs PLUS. Wyniki otrzymane w laboratorium mogą różnić się od podanych poniżej. 1. Powtarzalność wewnątrz-testowa Pięć próbek dodatnich i jedną próbkę ujemną badano 10 razy w tryplikacie w tej samej serii oznaczenia. Próbka Średnia stosunku SD CV% Anti-HBs ujemna 0,023 0,003 13,6 Anti-HBs dodatnia 0,143 0,005 3,4 ~20 mlu/ml Anti-HBs dodatnia 0,358 0,012 3,3 ~50 mlu/ml Anti-HBs dodatnia 0,715 0,019 2,6 ~100 mlu/ml Anti-HBs dodatnia 1,231 0,037 3,0 ~150 mlu/ml Anti-HBs dodatnia ~300 mlu/ml 1,982 0,048 2,4 2. Powtarzalność między-testowa 3 próbki dodatnie i jedną próbkę ujemną badano przez 20 dni, 2 razy dziennie, w duplikacie, zgodnie z procedurą EP5 NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards). Próbka Średnia stosunku SD CV% Anti-HBs ujemna 0,023 0,004 15,5 Anti-HBs dodatnia 0,146 0,008 5,5 ~20 mlu/ml Anti-HBs dodatnia 1,284 0,060 4,9 ~150 mlu/ml Anti-HBs dodatnia ~300 mlu/ml 2,015 0,067 3,6 3. Dokładność Wyniki ilościowe podano w miu/ml i skalibrowano z użyciem standardów wewnętrznych, według 1 st IRP WHO Badania korelacji przeprowadzono testując próbki o stężeniach 0, 10, 100, 400 i 1000 miu/ml otrzymane ze standardu WHO względem kalibratorów z zestawu. Współczynnik korelacji i nachylenie otrzymanej krzywej korelacji są następujące: R2 = 0,99 i a = 0, Czułość analityczna była niższa niż 2 miu/ml zgodnie z procedurą NCCLS. UWAGA: Czułość analityczna odpowiada niższej granicy detekcji, która odpowiada niższemu mierzalnemu stężeniu różnemu od zera, obliczonemu ze średnich i odchyleń standardowych dla punktów 0 i 10 miu/ml. 14 [PL]

15 5. Liniowość metody 5 próbek silnie dodatnich w kierunku anty-hbs (924 miu/ml, 330 miu/ml, 326 miu/ml, 544 miu/ml i 857 miu/ml) rozcieńczono dwukrotnie do 1/32 lub 1/64. Zgodność wyników zawiera się między 92% i 116%. 6. Zakres pomiaru Zakres pomiarowy zawiera się pomiędzy 2 a 1000 miu/ml i jest on ograniczony z dołu progiem czułości testu oraz maksymalną wartością krzywej wzorcowej. Miana poniżej granicy wykrywania wyrażane jest w następujący sposób: < 2,00 miu/ml, zaś miano powyżej zakresu pomiarowego w sposób następujący: > 1000 miu/ml. 7. Hook effect Przebadano 4 nierozcieńczone próbki o wysokim stężeniu przeciwciał anty-hbs ( miu/ml, miu/ml, miu/ml i miu/ml). Stężenie miu/ml miu/ml miu/ml miu/ml OD 450 Odczyt przy 405 nm Odczyt przy 405 nm Odczyt przy 405 nm Odczyt przy 405 nm OD 405 1,342 1,596 1,629 1,310 Wynik >1000 miu/ml >1000 miu/ml >1000 miu/ml >1000 miu/ml Podczas oceny wyników nie stwierdzono Hook effect. 8. Swoistość a) Za pomocą testu Monolisa Anti-HBs PLUS oznaczono 179 próbek pobranych od pacjentów wykazujących różne patologie (hepatitis A, hepatitis C, HIV 1, HIV 2, HTLV, HSV, EBV, różyczka, toksoplazmoza, mieloma (IgG, IgM), RF, ANA, HAMA, żółtaczka i wielokrotne transfuzje). 21 próbek dało wynik dodatni w teście Monolisa Anti-HBs PLUS i dwóch innych testach ze znakiem CE na detekcję anty-hbs. 1 próbka ANA pozytywna dała wynik dodatni na anty-hbs Ab tylko w teście Monolisa Anti-HBs PLUS. 2 inne próbki (1 HIV 1 i 1 HIV 2) dały wynik pozytywny na anty-hbs Ab w teście Monolisa Anti- HBs PLUS oraz innym, konkurencyjnym teście. b) Swoistość testu Monolisa Anti-HBs PLUS została określona przez analizę próbek dawców krwi i losowo wybranych pacjentów klinicznych. Miejsce 1 Dawcy & hospitalizowani Miejsce 2 Dawcy Miejsce 3 Hospitalizowani Razem Próbki Dodatnie % Swoistości 99,4% 100% 98,7% 99,4% Swoistość testu wynosi 99,4% (98,8% do 99,8% przy 95% przedziale ufności). 9. Czułość 654 próbki od różnych populacji zaszczepionych lub naturalnie zainfekowanych pacjentów przebadano za pomocą testu Monolisa Anti-HBs PLUS i innego testu anty-hbs. Próbki o niezgodnych wynikach przebadano ponownie za pomocą trzeciego testu ze znakiem CE. 15 [PL]

16 Zgodność Monolisa Profil pacjenta N Test 1 ze znakiem CE Test 2 ze znakiem CE* Zaszczepieni ,8% 99,1% Z przebytym 71 95,8% 100% Hepatitis B Chroniczne % Nie badano Hepatitis B Pacjenci ,6% Nie badano hospitalizowani Razem ,5% 99,5% Wśród próbek 654 badanych pacjentów, 617 wykazało wynik dodatni w kierunku anty- HBs a 37 ujemny (pacjenci z chronicznym hepatitis) w teście 1. Dla tych 617 pacjentów zgodność wynosi 98,4% (97% do 99,2% przy 95% przedziale ufności). * Czułość testu Monolisa Anti-HBs PLUS po analizie niezgodnych próbek za pomocą testu 2 wynosi (98,1% do 99,7% przy 95% przedziale ufności) LITERATURA 1. Lai CL, Ratziu V, Yuen M-F, Poynard T: Viral hepatitis B. Lancet 362 : , Maddrey WC: Hepatitis B : an important public health issue. J Med Virol 61: , Delmonico FL, Snydman DR: Organ donor screening for infectious diseases. Transplantation 65 : , Centers for Disease Control : Recommendations for preventing transmission of infections among chronic hemodialysis patients. MMWR 50 (No. RR-5): 1-43, Tiollais P, Pourcel C, Dejean A : The hepatitis B virus. Nature 317: , Lee WM: Hepatitis B infection. New Engl J Med 337 : , Mushahwar IK, Dienstag JL, Polesky HF, McGrath LC, Decker RH, Overby LR Interpretation of various serological profiles of hepatitis B virus infection. Am J Clin Pathol 76: , McMahon BJ, Alward WLM, Hall DB, et al.: Acute hepatitis B infection: relation of age to the clinical expression of disease and subsequent development of the carrier state. J Infect Dis 151: , Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM: Serologic diagnosis of acute and chronic viral hepatitis. Semin Liver Dis 11: 73-83, Centers for Disease Control: Hepatitis B vaccination United States, MMWR 51(No. 25): , Yu AS, Cheung RC, and Keefe EB : Hepatitis B vaccines. Clin Liver Dis 8: , Bos ES, van der Doelen AA, van Rooy N, Schuurs AHWM : 3,3',5,5' - tetramethylbenzidine as an ames test negative chromogen for horseradish peroxidase in enzyme immunoassay. J Immunoassay 2 : , Garner RC, Walpole AL, Rose FL : Testing of some benzidine analogues for microsomal activation to bacterial mutagens. Cancer Letters 1 : 39-42, Bond WW, Favero MS, Petersen NJ, Ebert JW : Inactivation of hepatitis B virus by intermediate- to-high-level disinfectant chemicals. J Clin Microbiol 18: , [PL]

17 15. U.S. Environmental Protection Agency, Office of Solid Waste : EPA Guide for Infectious Waste Management, Washington D.C., (USG PO 530-SW ). 16. Sehulster LM, Hollinger FB, Dreesman GR, Melnick JL : Immunological and biophysical alteration of hepatitis B virus antigens by sodium hypochlorite disinfection. Appl and Envi Microbiol 42 : , [PL]

18 18 [PL]

19 19 [PL]

20 20 [PL]

21 21 [PL]

22 22 [PL]