1- ZASTOSOWANIE TESTU

Transkrypt

1 PASTOREX CRYPTO PLUS TEST DO WYKRYWANIA ANTYGENU ROZPUSZCZALNEGO CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS W PŁYNACH FIZJOLOGICZNYCH (SUROWICY, PMR, BAL, MOCZU) /07 1- ZASTOSOWANIE TESTU Kryptokokoza jest zakażeniem oportunistycznym, występującym przeważnie u pacjentów z niedoborami odporności, np. w AIDS. Jest obecnie jednym z najczęstszych zakażeń, bezpośrednio odpowiedzialnych za śmierć tych pacjentów. Kryptokokoza występuje z częstością od 2 do 10% w krajach Europy Zachodniej i w USA i przekracza 15% w niektórych rejonach Afryki (3). U pacjentów z niedoborami odporności zakażenie po wstępnej fazie płucnej, szybko obejmuje centralny układ nerwowy, przyjmując postać zapalenia opon mózgowych, a także atakuje inne narządy (1). Rozpuszczalne antygeny kryptokoków pojawiają się szybko na wykrywalnym poziomie w surowicy, płynie mózgowo-rdzeniowym (PMR), popłuczynach oskrzelowopęcherzykowych (BAL) i w moczu. Diagnostyka kryptokokozy opiera się na obserwacji w preparacie mikroskopowym charakterystycznych komórek drożdżaków z szeroką otoczką, hodowli C.neoformans oraz na wykryciu antygenów otoczkowych w płynach fizjologicznych (2). 2- ZASADA TESTU Test Pastorex Crypto Plus jest oznaczeniem jakościowym oraz półilościowym, wykorzystującym zjawisko aglutynacji do wykrywania polisacharydowego antygenu otoczkowego Cryptococcus neoformans, glikuronoksylomannanu (GXM), w płynach fizjologicznych (surowicy, CSF, BAL-u, moczu). Cząsteczki lateksu opłaszczone są mysim przeciwciałem monoklonalnym E-1 przeciwko glikuronoksylomannanowi, który jest głównym składnikiem otoczki C.neoformans (4). Reagując z antygenem, cząstki dają aglutynację widoczną gołym okiem. Czułość testu dla surowicy wynosi 50 ng/ml. Test można wykonywać na próbkach termicznie inaktywowanych (30 minut w temp. 56 C) w celu eliminacji ryzyka zakażenia wirusem HIV. Przed oznaczeniem płyny fizjologiczne oprócz moczu należy poddać działaniu enzymatycznemu, które eliminuje nieswoiste oddziaływania oraz wpływa na zwiększenie czułości testu (5, 6, 7). Próbki dodatnie należy oznaczyć ilościowo, wykonując serię rozcieńczeń w buforze. Miano antygenu wskazuje na stadium zaawansowania zakażenia. Oznaczenie kinetyki miana antygenu w przebiegu zakażenia jest przydatne w ocenie skuteczności leczenia (2). 3- SKŁAD ZESTAWU Zestaw 60 testów (nr kat ) zawiera: Latex Cryptococcus: 1 fiolka: 1 ml cząstek lateksu opłaszczonych mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko glikuronoksylomannanowi, zawieszonych w buforze glicynowym. Kontrola dodatnia - antygen: 1 fiolka: 0.5 ml kontrola dodatnia: oczyszczony antygen uzyskany z otoczek C.neoformans. Bufor do rozcieńczania próbek: 1 fiolka: 10 ml buforu glicynowego z albuminą. Pronaza: 2 fiolki: liofilizowany enzym pronaza, który należy zrekonstytuować w 1 ml wody destylowanej. Roztwór zatrzymujący reakcje enzymatyczne: 1 fiolka: 2 ml roztworu zatrzymującego reakcję (inhibitor rekcji enzymatycznej). 15 jednorazowych kart do aglutynacji. 100 jednorazowych patyczków. Odczynniki są konserwowane 0.02% mertiolanem i zawierają poniżej 0.1% azydku sodu. 4- PRZECHOWYWANIE Odczynniki są trwałe zgodnie z datą ważności, przechowywane w temp. 2-8 C, przy braku zanieczyszczenia mikrobiologicznego, nawet po otwarciu. Rekonstytuowana pronaza jest trwała przez 4 tygodnie, przechowywana w lodówce lub kilka miesięcy, zamrożona w temp. -20 C. Fiolkę z odczynnikiem lateksowym należy przechowywać w pozycji stojącej. ODCZYNNIKÓW LATEKSOWYCH NIE MOŻNA ZAMRAŻAĆ 1

2 5- INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY I SPRZĘT Dokładne pipety Próbówki Eppendorfa lub inne szczelnie zamykane Wytrząsarka pozioma (160 obrotów/minutę) Wortex Łaźnia wodna o temp. 56 C Łaźnia wodna o temp. 100 C Pojemnik ze środkiem dezynfekującym 6- ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA Uzyskanie prawidłowego wyniku zależy od przestrzegania Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Wszystkie odczynniki i próbka powinny mieć temperaturę pokojową (18-30 C). Nie należy dotykać powierzchni reakcyjnej na karcie do aglutynacji. Do każdej badanej próbki zmieniać pipetę jednorazową lub końcówkę pipety automatycznej. Wstrząsnąć odczynnik lateksowy przed użyciem. Osuszyć końcówkę zakraplacza w fiolce z odczynnikiem, aby uzyskać dobrze skalibrowane krople. Podczas nakrapiania należy trzymać fiolkę pionowo. Do każdej aglutynacji używać nowego patyczka. Zużyte materiały jednorazowe autoklawować lub dezynfekować przed wyrzuceniem. HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO Zawsze należy postępować zgodnie z aktualnymi zaleceniami dotyczącymi ochrony przez zakażaniem badanym materiałem biologicznym W celu zapoznania się z zaleceniami dotyczącymi zagrożeń i środków ostrożności związanych z niektórymi substancjami chemicznymi zawartymi w niniejszym zestawie należy skorzystać z piktogramów wskazujących rodzaj zagrożenia znajdujących się na etykietach i w informacjach zamieszczonych na końcu instrukcji obsługi. Karta charakterystyki jest dostępna na stronie internetowej 7- WYKONANIE TESTU 1) Przygotowanie pronazy Rekonstytuować zawartość fiolki z pronazą za pomocą 1 ml wody destylowanej, przy czym unikać zanieczyszczenia i dokładnie rozpuścić cały liofilizat. Jeżeli miesięcznie wykonuje się testów, enzym można przechowywać w temp C (pozostaje on aktywny przez 4 tygodnie). Jeśli wykonuje się mniej oznaczeń, zawartość fiolki należy rozporcjować po 20 l na pojedyncze próbki i zamrozić w temp. -20 C. 2) Próbki Przechowywanie Próbki powinny być opracowane jak najszybciej po pobraniu. Jeżeli jest to niemożliwe, można pozostawić je na kilka godzin w temp. 2-8 C lub na dłuższy czas zamrozić w temp. -20 C (w tym przypadku tylko supernatant po odwirowaniu). Próbek nie należy odmrażać i ponownie zamrażać więcej niż 3 razy. UWAGA: Do próbek surowicy należy używać wyłącznie suchych próbówek. Nie badano wpływu nadmiaru albuminy, lipidów, hemoglobiny i bilirubiny na jakość oznaczenia. Przygotowanie próbek a) Surowica, BAL Nanieść 120 l badanego płynu do eppendorfówki i dodać 20 l pronazy. Dobrze wymieszać i ogrzewać w temp. 56 C przez 30 minut. Po wyjęciu z łaźni wodnej dodać 1 kroplę odczynnika zatrzymującego reakcję (inhibitora enzymu). Dobrze wymieszać. UWAGA: Korzystając z łaźni wodnej należy zabezpieczyć probówki przed dostaniem się wody do środka, mogłoby to prowadzić do uzyskania zafałszowanych wyników. b) PMR Jeżeli płyn jest bardzo mętny lub zawiera erytrocyty należy go odwirować przez 5 min. przy 250 g (2000 obr./min.) i zebrać supernatant. Nanieść 120 l badanego płynu do eppendorfówki i dodać 20 l pronazy. Dobrze wymieszać i ogrzewać w temp. 56 C przez 30 minut. Wyjąć próbkę z łaźni wodnej. 2

3 Zatrzymać reakcję enzymatyczną inaktywując pronazę poprzez ogrzewanie próbki w C przez 5 minut. Dobrze wymieszać. Przed reakcją aglutynacji pozwolić by 3-4 minuty próbka schłodziła się. UWAGA: Korzystając z łaźni wodnej należy zabezpieczyć probówki przed dostaniem się wody do środka, mogłoby to prowadzić do uzyskania zafałszowanych wyników. c) Mocz Rozcieńczyć 1:2 w buforze glicynowym. 3) Reakcja aglutynacji Nanieść 40 l przygotowanej próbki na okrągłe pole karty do aglutynacji. Dodać 1 kroplę (10 l) lateksu Cryptococcus. Wymieszać za pomocą patyczka. Wykonać kontrolę ujemną mieszając 40 l buforu do rozcieńczania z kroplą lateksu. Umieścić kartę aglutynacyjną na poziomej wytrząsarce na 5 minut (przy 160 obrotach / minutę) w temp. pokojowej ( C). 8- INTERPRETACJA WYNIKÓW Odczytać wynik reakcji. O wyniku dodatnim świadczy aglutynacja cząstek lateksu z próbką i brak aglutynacji w kontroli ujemnej (lateks z buforem do rozcieńczeń). Wyznaczanie miana. Proponowany sposób przygotowania rozcieńczeń w buforze glicynowym: Rozcieńczenie 1:10 1:100 1:1000 1: Objętość próbki 50 l 50 l 50 l 50 l Objętość buforu 450 μl 450 l 450 l 450 l Można dokładnie wymiareczkować próbkę, wykonując serię 2-krotnych rozcieńczeń z ostatniej próbówki dodatniej: 50 l próbki + 50 l buforu. UWAGA: Interpretacja aglutynacji przy wysokich rozcieńczeniach często różni się w zależności od wykonawcy; podczas oznaczania kolejnej próbki dodatniej od danego pacjenta należy porównać wynik z uzyskanym dla poprzedniej próbki. 9- KONTROLA JAKOŚCI TESTU Czułość odczynnika lateksowego należy systematycznie kontrolować za pomocą kontroli dodatniej, zawartej w zestawie, gdzie poziom GXM wynosi 200 ng/ml. 10- KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Odczynniki zostały przygotowane zgodnie z Systemem Jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Odczynniki każdej serii podlegają oznaczeniu kontrolnemu, i są dopuszczane do użytkowania, jeśli spełniają wymagane kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii. 11- CHARAKTERYSTYKA TESTU Przeciwciało monoklonalne E1 stosowane w tym teście aglutynacyjnym zostało opisane przez Dromer i wsp. (4). Poprzednie badania z użyciem białego lateksu wykazały dobre właściwości aglutynacyjne wspomnianego przeciwciała. Jedno z badań (8), wykonano na 84 surowicach od pacjentów z kryptokokozą i 47 surowicach kontrolnych. Wykazano wpływ działania pronazą na zwiększenie czułości i swoistości wykrywania GXM. Inne badania (9) wykazały, że miano wykrywanego antygenu różni się w zależności od stosowanych odczynników oraz, że rewersja do wyniku ujemnego w teście Pastorex Crypto Plus może być wynikiem skutecznego leczenia. Zastosowanie czerwonych cząsteczek lateksu zamiast białych zapewnia lepszą widoczność agregatów. Wyniki uzyskane przez laboratorium przyszpitalne: 3

4 CZUŁOŚĆ: Badano próbki od 38 pacjentów z kryptokokozą: Próbki Liczba pacjentów Pastorex Crypto Plus Materiał Liczba Surowica PMR BAL Mocz Razem * W badaniu tym, przeprowadzonym na 51 próbkach, czułość testu Pastorex Crypto Plus określono na 92%. *4 próbki, które były ujemne w teście Pastorex Crypto Plus były również ujemne w innym teście aglutynacyjnym opartym na przeciwciałach poliklonalnych. SWOISTOŚĆ: Badano próbki od 92 pacjentów bez kryptokokozy: Próbki Liczba pacjentów Pastorex Crypto Plus Materiał Liczba Surowica PMR BAL Mocz Razem W badaniu tym, przeprowadzonym na 96 próbkach, swoistość testu Pastorex Crypto Plus określono na 98%. Uzupełniające wewnętrzne badania przeprowadzone na 59 surowicach od 18 pacjentów ze stwierdzoną aspergilozą lub kandydozą wykazały 100% swoistość testu. Dolna wartość wykrywanego antygenu GXM została ustalona na poziomie 50 ng/ml. 12- OGRANICZENIA TESTU Aglutynacja również być zahamowana przy bardzo wysokim poziomie antygenu (efekt wymiareczkowania). Jeżeli są jakiekolwiek wątpliwości dotyczące interpretacji wyniku próbkę należy rozcieńczyć 1/100. Wyniki należy interpretować w świetle historii choroby pacjenta Wynik ujemny można uzyskać, gdy stężenie antygenu GXM w próbce jest niższe niż wartość progowa wykrywana w teście Pastorex Crypto Plus. W przypadku podejrzenia zakażenia należy powtórzyć oznaczenie w kolejno pobranej próbce. Wykrywanie antygenów rozpuszczalnych za pomocą aglutynacji lateksowej jest metodą szybszą od tradycyjnej hodowli. Obecnie dostępne są tylko nieliczne dane kliniczne i literaturowe na temat wykrywania antygenów kryptokokowych w BAL-u i w moczu. Podobieństwo antygenowe otoczki C.neoformans i ściany komórkowej grzybów z gatunku Trichosporon beigelii może być przyczyną fałszywie dodatnich wyników u pacjentów z trichosporozą (4). Tak jak we wszystkich metodach immunologicznych, także w tym przypadku należy rozważyć nieswoiste reakcje krzyżowe. Diagnostyka kryptokokozy opiera się na obserwacji w preparacie mikroskopowym komórek drożdżaków z szeroką otoczką (barwienie negatywowe tuszem), hodowli C.neoformans oraz na wykryciu antygenów otoczkowych w płynach fizjologicznych (2). Wykrywanie antygenów rozpuszczalnych metodą aglutynacji lateksowej jest metodą pomocniczą w diagnostyce tego zakażenia. Diagnozę kryptokokozy można postawić dopiero po analizie wyników klinicznych, radiologicznych i biologicznych (mikrobiologicznych, histologicznych, serologicznych); wyniki pojedynczych badań należy interpretować z należytą rozwagą. 13- BIBLIOGRAFIA 1. CAMERON M.L, BARTLETT J.A., GALLIS H.A., WASKIN H.A, Manifestations of Pulmonary Cryptococcocis in Patients with Acquired Immunodeficiency Syndrome, R.I.D., 1991, 13, p STAIB F., Cryptococcocis in Aids - Mycological-diagnostic and epidemiological observations, Aids-Forshung (AIFO), 1987, p DROMER F., MATHOULIN S., DUPONT B, LAPORTE A., and the French Cryptococcosis Study Group. Epidemiology of Cryptococcosis in France : A 9-Year Survey ( ). Clin. Inf. Dis.1996, 23, p DROMER F., SALAMERO J., CONTREPOIS A., CARBON C., YENI P. Production, Characterization and Antibody Specificity of a Mouse Monoclonal Antibody Reactive with Cryptococcus neoformans Capsular Polysaccharide. Infect. and Immun., 1987, 55, p GRAY L.D., ROBERTS G.D. Experience with the Use of Pronase to eliminate Interference Factors in the Latex Agglutination Test for Cryptococcal Antigen. J. Clin. Microbiol., 1988, 26, p HEELAN J.S., CORPUS L, KESSIMIAN N. False-positive reaction in the Latex Agglutination Test for Cryptococcus neoformans Antigen. J.Clin.MIcrobiol. 1991, 29, p

5 7. HAMILTON J.R., NOBLE A., DENNING D.W., STEVENS D.A. Performance of Cryptococcus Antigen Latex Agglutination Kits on Serum and Cerebrospinal Fluid Specimens of Aids patients before and after Pronase treatment. J. Clin. Microbiol. 1991, 29, p TEMSTET A., ROUX P., POIROT J.L., RONIN O., DROMER F. Evaluation of monoclonal antibody based latex test for the diagnosis of Cryptococcosis : Comparison with two tests Using Polyclonal Antibodies J. Clin. Microbiol. 1992, 30, p SWINNE D., MEULEMANS L., DE VROEY Ch. Detection of Cryptococcus antigen with a mononucleal antibody based latex test (abstract) Trends in the management of systemic fungal infections, Nijmegen, The Netherlands, 5-7 Sept

6 6

7 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /07 Fax : +33 (0)