Platelia Rubella IgM 1 płytka

Transkrypt

1 Platelia Rubella IgM 1 płytka TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO JAKOŚCIOWEGO WYKRYWANIA PRZECIWCIAŁ KLASY IgM PRZECIWKO WIRUSOWI RÓŻYCZKI W LUDZKIEJ SUROWICY LUB OSOCZU /11 1. ZASTOSOWANIE Platelia Rubella IgM jest immunoenzymatycznym testem wykorzystującym technologię immunocapture do jakościowego oznaczania przeciwciał klasy IgM przeciwko wirusowi różyczki w ludzkiej surowicy lub osoczu. 2. ZNACZENIE KLINICZNE Różyczka jest chorobą wirusową rozpowszechnioną na całym świecie. Występujące u dzieci i dorosłych zakażenia przeważnie mają łagodny przebieg. Objawy kliniczne obejmują niezbyt wysoki wzrost temperatury ciała, ból głowy, ból gardła i uogólnioną wysypkę skórną. Zakażenie wirusem różyczki jest natomiast niebezpieczne podczas ciąży, udokumentowane wady wrodzone to między innymi: głuchota, katarakta, opóźnienie umysłowe, obumarcie płodu. Intensywne szczepienia dzieci w wieku przed-szkolnym, zmniejszyły częstość występowania epidemii zakażeń wirusem różyczki, lecz nadal należy monitorować status immunologiczny kobiet ciężarnych i planujących zajście w ciążę. Wykrycie przeciwciał IgG przeciwko wirusowi różyczki u kobiety przed zajściem w ciążę, pozwala uzyskać pewność ochrony płodu przed zakażeniem w przypadku zakażenia matki. Wykrywanie przeciwciał IgG jest także metodą potwierdzenia skuteczności szczepienia. Od czasu wyizolowania wirusa różyczki w 1962 roku, wykrywanie swoistych przeciwciał ma wielkie znaczenie ze względu na teratogenne działanie wirusa. Do wykrywania ich opracowano metody neutralizacji surowicy, wiązania dopełniacza i techniki immunofluorescencyjne. Testy oparte na tych technikach są albo trudne do wykonania w laboratoriach wykonujących badania rutynowe, albo dają niepowtarzalne lub niepełne wyniki. Metoda zahamowania hemaglutynacji pozwala na szybką diagnostykę ostrego zakażenia, a także umożliwia określenie statusu immunologicznego pacjenta. Pierwszą procedurę opartą na metodzie immunoenzymatycznej opisali w 1971 roku Engvall i Perlmann. Obecnie stosowane techniki EIA charakteryzują się wysoką swoistością i czułością wykrywania szerokiej gamy antygenów i przeciwciał. Interpretacja kolejnych testów serologicznych, wskazująca na obecność przeciwciał klasy IgM, stwierdzenie obecności lub znaczący wzrost miana przeciwciał klasy IgG (dwukrotny wzrost miana) w dwóch próbkach surowicy uzyskanych w odstępnie minimum trzech tygodni należy rozważać jako dowód na niedawną ekspozycję pacjenta na wirusa różyczki, zanim jeszcze wystąpią typowe objawy zakażenia. 3. ZASADA TESTU Platelia Rubella IgM jest jakościowym testem immunoenzymatycznym do oznaczania przeciwciał klasy IgM przeciwko wirusowi różyczki w ludzkiej surowicy lub osoczu. Na fazie stałej opłaszczone są przeciwciała przeciwko ludzkim łańcuchom. Jako koniugat używana jest mieszanina antygenu wirusa różyczki oraz monoklonalnego przeciwciała przeciwko wirusowi różyczki znakowanego peroksydazą. Wykonanie oznaczenia obejmuje następujące etapy: Etap 1 Próbki od pacjentów, kalibratory i kontrole są rozcieńczane w stosunku 1/21, a następnie przenoszone do studzienek mikropłytki. W czasie 1 godziny inkubacji w temperaturze 37 C, przeciwciała IgM przeciwko wirusowi różyczki obecne w próbce wiążą się z przeciwciałami anty-µ opłaszczonymi na studzienkach mikropłytki. Po inkubacji IgG oraz inne białka surowicy są usuwane przez wymywanie.

2 Etap 2 Koniugat (mieszanina antygenu wirusa różyczki oraz monoklonalnego przeciwciała przeciwko wirusowi różyczki znakowanego peroksydazą) jest dodawany do studzienek mikropłytki. W czasie 1 godziny inkubacji w temperaturze 37 C, koniugat wiąże się ze swoistymi przeciwciałami IgM przeciwko wirusowi różyczki, które są związane na mikropłytce. Niezwiązany koniugat jest usuwany przez wymywanie po inkubacji. Etap 3 Obecność kompleksów immunologicznych (przeciwciała przeciw ludzkim łańcuchom / IgM przeciwko wirusowi różyczki / antygenu wirusa różyczki / monoklonalnego przeciwciała przeciwko wirusowi różyczki znakowanego peroksydazą) jest wykazywana przez dodanie roztworu substratu dla enzymu do każdej studzienki. Etap 4 Po inkubacji w temperaturze pokojowej ( C) reakcja enzymatyczna jest zatrzymywana przez dodanie 1N roztworu kwasu siarkowego. Odczyt optycznej gęstości uzyskiwany przy pomocy spektrofotometru ustawionego na 450/620 nm jest proporcjonalny do ilości przeciwciał IgM przeciwko wirusowi różyczki obecnych w próbce 4. SKŁAD ZESTAWU Odczynniki wystarczają na wykonanie 96 oznaczeń. Wszystkie odczynniki zestawu służą wyłącznie do diagnostyki in vitro. Etykieta Postać odczynnika Opakowanie R1 Mikropłytka Mikropłytka (gotowa do użytku): 1 12 pasków z 8 łamanymi studzienkami opłaszczonymi przeciwciałami przeciw ludzkim łańcuchom R2 Skoncentrowany Skoncentrowany roztwór do płukania (20x): 1 x 70 ml roztwór do Bufor TRIS-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20 płukania (20x) Konserwant: 0,04% ProClin 300 R3 Kontrola ujemna Kontrola ujemna: 1 x 0,75 ml Ludzka surowica, ujemna pod względem przeciwciał IgM przeciwko wirusowi różyczki oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs-Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty- HIV2 i anty-hcv Konserwant: 0,1% ProClin 300 R4 Kalibrator Kalibrator: 1 x 0,75 ml Ludzka surowica, dodatnia pod względem przeciwciał IgM przeciwko wirusowi różyczki, oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs-Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty- HIV2 i anty-hcv Konserwant: 0,1% ProClin 300 R5 Kontrola dodatnia Kontrola dodatnia: 1 x 0,75 ml Ludzka surowica, dodatnia pod względem przeciwciał IgM przeciwko wirusowi różyczki, oraz ujemna pod względem antygenu powierzchniowego wirusa hepatitis B (HBs-Ag) i przeciwciał anty-hiv1, anty- HIV2 i anty-hcv Konserwant: 0,1% ProClin 300 R6a Antygen Antygen różyczki Liofilizowany antygen wirusa różyczki Konserwant: 0,36% ProClin x qs 8.0 ml

3 Etykieta Postać odczynnika Opakowanie R6b Koniugat Koniugat (101x): 1 x 0,4 ml (101x) Mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko wirusowi różyczki, znakowane peroksydazą chrzanu Konserwant: 0,16% ProClin 300 R7 Rozcieńczalnik Rozcieńczalnik do próbek i koniugatu (gotowy do użytku): Tris-NaCl (ph 7,6), BSA, 1 x 80 ml 0,1% Tween 20, czerwień fenolowa Konserwant: 0,15% ProClin 300 R9 Chromogen TMB Chromogen (gotowy do użytku): 3,3,5,5 czterometylobenzydyna (< 0,1%), H 2 O 2 1 x 28 ml R10 Roztwór zatrzymujący reakcję (<1%) Roztwór zatrzymujący reakcję (gotowy do użytku): Roztwór 1N kwasu siarkowego 1 x 28 ml Informacje dotyczące warunków przechowywania i daty ważności znajdują się na opakowaniu. 5. ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA Wiarygodność wyników zależy od przestrzegania zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej: Nie używać przeterminowanych odczynników. Podczas jednego oznaczenia używać wyłącznie odczynników o tym samym numerze serii. UWAGA: W przypadku roztworu do płukania (R2, etykieta: 20x koloru zielonego), chromogenu (R9, etykieta: TMB koloru turkusowego) oraz roztworu zatrzymującego reakcję (R10, etykieta: 1N koloru czerwonego), możliwe jest użycie innych serii niż zawarte w zestawie, pod warunkiem, że odczynniki te są identyczne i w danym badaniu używana jest ta sama seria. UWAGA: Dodatkowo w przypadku roztworu do płukania (R2, etykieta: 20x koloru zielonego), możliwe jest zmieszanie z dwoma innymi roztworami znajdującymi się w różnych zestawach odczynników Bio-Rad (R2, etykiety: 10x koloru niebieskiego lub 10x koloru pomarańczowego) przy prawidłowym ich rozcieńczeniu, pod warunkiem, że w danym badaniu używana jest tylko jedna mieszanina. Przed użyciem należy odczekać 30 minut, aby pozwolić odczynnikom osiągnąć temperaturę pokojową ( C). Ostrożnie rozcieńczyć lub rozpuścić odczynniki nie dopuszczając do zanieczyszczenia. Nie przeprowadzać testu w obecności reaktywnych oparów (kwasów, zasad i aldehydów) lub kurzu, które mogą wpłynąć na aktywność enzymatyczną koniugatu. Używać dokładnie umytych naczyń szklanych po przepłukaniu ich wodą dejonizowaną lub, jeśli to możliwe, naczyń jednorazowego użytku. Mycie mikropłytki jest bardzo ważnym etapem procedury: należy przeprowadzić zalecaną liczbę cykli mycia i upewnić się, że studzienki zostaną całkowicie wypełnione, a następnie całkowicie opróżnione. Nieprawidłowe mycie może być powodem błędnych wyników. Nie dopuszczać do wyschnięcia mikropłytek po zakończeniu mycia i przed wprowadzeniem odczynników. Nigdy nie używać tego samego pojemnika na koniugat i roztwór substratu, wywołujący reakcję barwną. Reakcja enzymatyczna jest bardzo wrażliwa na obecność metalu lub jonów metali. Z tego powodu nie można pozwolić na kontakt żadnego metalowego elementu z różnymi roztworami zawierającymi koniugat lub chromogen. Roztwór chromogenu (R9) powinien być bezbarwny. Pojawienie się niebieskiego koloru oznacza, że odczynnik nie nadaje się do użycia i należy go wymienić. Do każdej próbki należy używać nowej końcówki pipety. Należy skontrolować pipety i inny sprzęt pod względem dokładności i prawidłowego działania.

4 BEZPIECZEŃSTWO I HIGIENA PRACY Materiał pochodzenia ludzkiego użyty do przygotowania odczynników został przebadany i wykazał brak reaktywności w kierunku antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBs Ag), przeciwciał przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C (anty-hcv) oraz wirusom ludzkiego niedoboru odporności (anty-hiv1 i anty-hiv2). Ponieważ nie ma metod absolutnie wykluczających obecność czynników zakaźnych, odczynniki pochodzące z materiału ludzkiego powinny być traktowane jako materiał potencjalnie zakaźny: Każdy materiał, łącznie z roztworami do płukania, który wejdzie w bezpośredni kontakt z próbkami i odczynnikami zawierającymi materiał pochodzenia ludzkiego, należy traktować jako potencjalnie zakaźny. Podczas pracy z próbkami i odczynnikami należy używać rękawiczek jednorazowych. Nie pipetować ustami. Unikać rozlewania próbek lub roztworów zawierających próbki. Miejsca, w których nastąpiło rozlanie należy przepłukać wybielaczem rozcieńczonym do 10%. W przypadku rozlania kwasu, należy go najpierw zneutralizować wodorowęglanem sodu, a następnie przemyć miejsce rozlania wybielaczem rozcieńczonym do 10% i osuszyć papierem chłonnym. Materiał użyty do czyszczenia należy wyrzucić do pojemnika ze skażonymi odpadami. Próbki pacjentów, odczynniki zawierające materiał pochodzenia ludzkiego oraz skażony materiał i produkty należy wyrzucać dopiero po ich odkażeniu: - przez zanurzenie w wybielaczu w stężeniu 5% podchlorynu sodu na 30 minut - lub przez sterylizacje w autoklawie w 121 C przez co najmniej 2 godziny. UWAGA: Nie wprowadzać do autoklawu roztworów zawierających podchloryn sodu Unikać kontaktu ze skórą i błoną śluzową wszelkich odczynników, również tych uważanych za bezpieczne. Chemiczne i biologiczne pozostałości należy traktować i utylizować zgodnie z dobrymi praktykami laboratoryjnymi. Wszystkie odczynniki w zestawie są przeznaczone wyłącznie do diagnostycznego użytku in vitro. W celu zapoznania się z zaleceniami dotyczącymi zagrożeń i środków ostrożności związanych z niektórymi substancjami chemicznymi zawartymi w niniejszym zestawie należy skorzystać z piktogramów wskazujących rodzaj zagrożenia znajdujących się na etykietach i w informacjach zamieszczonych na końcu instrukcji obsługi. Karta charakterystyki jest dostępna na stronie internetowej 6. PRÓBKI 1. Zalecanymi typami próbek są surowica i osocze (EDTA, heparyna lub cytrynian). 2. Podczas przetwarzania, przechowywania i pracy z próbkami krwi należy stosować się do poniższych zaleceń: Próbki krwi należy pobrać zgodnie z rutynową procedurą, z wkłucia dożylnego. Próbki surowicy pozostawić do powstania skrzepu przed odwirowaniem. Próbówki z próbkami przez cały czas powinny być zamknięte. Po odwirowaniu jak najszybciej oddzielić surowicę lub osocze od czerwonych krwinek i przenieść do szczelnie zamykanej próbówki. Jeśli test będzie wykonany w ciągu 7 dni, próbki można przechować w temp C. Jeśli test będzie wykonany później, lub próbki będą transportowane, należy je zamrozić w temp C lub niższej. Nie należy używać próbek, które zostały rozmrożone więcej niż pięć razy. Wcześniej zamrożone próbki powinny być po rozmrożeniu dokładnie zmieszane (vortex) przed przystąpieniem do oznaczenia. 3. Próbki zawierające 90 g/l albuminy lub 100 mg/l wolnej bilirubiny, próbki lipemiczne zawierające ekwiwalent 36 g/l oleiny (trójglicerydu) oraz hemolizowane próbki zawierające do 10 g/l hemoglobiny nie mają wpływu na wyniki. 4. Nie należy podgrzewać próbek.

5 7. PROCEDURA OZNACZENIA 7.1 Wymagane materiały, które nie znajdują się w zestawie Worteks. Czytnik mikropłytek wyposażony w filtry 450 nm i 620 nm (*). Inkubator mikropłytek ustawiony termostatycznie na 37±1 C (*). Automatyczna, półautomatyczna lub ręczna płuczka mikropłytek (*). Jałowa woda destylowana lub dejonizowana. Rękawiczki jednorazowego użytku. Gogle lub okulary ochronne. Papier chłonny. Automatyczne lub półautomatyczne pipety lub multipipety regulowane lub ze stałym ustawieniem do odmierzania i wprowadzania od 10 µl do 1000 µl, oraz 1 ml, 2 ml i 10 ml. Cylindry z podziałką pojemności 25 ml, 50 ml, 100 ml i 1000 ml. Podchloryn sodu (wybielacz) i wodorowęglan sodu. Pojemnik na odpady niebezpieczne dla człowieka i środowiska. Probówki jednorazowego użytku. (*) Szczegółowe informacje na temat zalecanego sprzętu można uzyskać kontaktując się z działem technicznym naszej firmy. 7.2 Rozcieńczanie odczynników R1: Przed otwarciem pozostawić torebkę na 30 minut w temperaturze pokojowej ( C). Wyciągnąć ramkę, niewykorzystane paski natychmiast schować z powrotem do torebki i sprawdzić obecność środka osuszającego. Dokładnie zamknąć ponownie torebkę i przechowywać w temperaturze +2-8 C. R2: Rozpuścić roztwór do płukania R2 w stosunku 1/20 w wodzie destylowanej: na przykład 50 ml R2 i 950 ml wody destylowanej w celu otrzymania gotowego do użytku roztworu do płukania. Przygotować 350 ml rozcieńczonego roztworu do płukania dla jednej płytki z 12 paskami w przypadku mycia manualnego. R3, R4, R5: Rozcieńczyć w rozcieńczalniku (R7) w stosunku 1/21 (przykład: 300 µl R µl kalibratora lub kontroli). R6a: Antygen wirusa różyczki jest liofilizowany. Do przetestowania 3 pasków, rozcieńczyć jedną fiolkę liofilizowanego antygenu dodając 8 ml rozcieńczalnika (R7). Dokładnie wymieszać. Po rozcieńczeniu roztwór antygenu (R6a+R7) musi być idealnie przejrzysty. R6 (R6a+R6b) - roztwór roboczy koniugatu: Dodać 80 µl koniugatu (R6b) do każdej fiolki z rozcieńczonym antygenem wirusa różyczki (rozcieńczonym R6a). Dokładnie wymieszać. Roztwór roboczy koniugatu musi zostać rozcieńczony co najmniej 1 godzinę przed użyciem. 7.3 Przechowywanie i okres przydatności otwartych i/lub rozcieńczonych odczynników Pod warunkiem przechowywania przed otwarciem w temperaturze +2-8 C, każdy składnik może zostać użyty do upływu daty przydatności umieszczonej na zewnętrznej etykiecie zestawu. R1: Po otwarciu paski pozostaną stabilne do 8 tygodni, jeśli przechowywane będą w temperaturze +2-8 C w tej samej dokładnie zamkniętej torebce (sprawdzić obecność środka osuszającego). R2: Po rozcieńczeniu roztwór do płukania może być przechowywany do 2 tygodni w temperaturze C. Po otwarciu skoncentrowany roztwór do płukania przechowywany w temperaturze C przy braku zanieczyszczeń pozostanie stabilny do upływu daty przydatności oznaczonej na etykiecie. R3, R4, R5, R6b, R7: Po otwarciu i przy braku zanieczyszczeń odczynniki przechowywane w temperaturze +2-8 C pozostaną stabilne do 8 tygodni. R6 (R6a+R6b): Po rozcieńczeniu roboczy roztwór koniugatu pozostanie stabilny przez 8 godzin w temperaturze pokojowej ( C) lub przez 2 tygodnie w temperaturze +2-8 C. R9: Po otwarciu i przy braku zanieczyszczeń odczynnik przechowywany w temperaturze +2-8 C pozostanie stabilny do 8 tygodni. R10: Po otwarciu i przy braku zanieczyszczeń odczynnik przechowywany w temperaturze +2-8 C pozostanie stabilny do upływu daty przydatności oznaczonej na etykiecie.

6 7.4 Procedura Należy bezwzględnie przestrzegać procedury oznaczenia i zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. Przed użyciem należy pozwolić odczynnikom osiągnąć temperaturę pokojową ( C). Użycie odłamywalnych studzienek wymaga szczególnej uwagi podczas pracy z nimi. Podczas każdego cyklu należy użyć kalibratora i wszystkich kontroli w celu weryfikacji wyników testu. 1. Dokładnie ustalić plan wprowadzania i identyfikacji kontroli, kalibratora i próbek pacjenta. 2. Przygotować rozcieńczony roztwór do czyszczenia (R2) [patrz: punkt 7.2]. 3. Wyjąć ramkę i paski (R1) z opakowania [patrz: punkt 7.2]. 4. Przygotować roztwór roboczy koniugatu R6 (R6a+R6b) [patrz: punkt 7.2]. 5. W oznakowanych probówkach rozcieńczyć kalibrator (R4) i kontrole (R3, R5) oraz próbki pacjentów (S1, S2 ) w rozcieńczalniku (R7) w stosunku 1/21: 300 µl rozcieńczalnika (R7) i 15 µl próbki. Wymieszać rozcieńczone próbki. 6. Nanieść rozcieńczone kalibratory, kontrole i próbki po 200 l do każdego dołka, ściśle wg podanego schematu: A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 7. Przykryć mikropłytkę folią adhezyjną i mocno docisnąć do płytki w celu zapewnienia szczelności. Natychmiast przystąpić do inkubacji mikropłytki w łaźni wodnej kontrolowanej termostatem lub w suchym inkubatorze przez 1 godzinę 5 minut w temperaturze 37 C 1 C. 8. Po zakończeniu inkubacji zdjąć folię. Zaaspirować zawartość wszystkich studzienek do pojemnika na odpady zakaźne (zawierającego podchloryn sodu). Przemyć mikropłytkę 4 razy 350 µl roztworu do płukania (R2). Odwrócić mikropłytkę i delikatnie ostukać na papierze chłonnym w celu usunięcia pozostałej ilości płynu. 9. Natychmiast dodać 200 µl roboczego roztworu koniugatu (R6) do wszystkich studzienek. Przed użyciem roztworu należy nim delikatnie wstrząsnąć. 10. Przykryć mikropłytkę folią adhezyjną i mocno docisnąć do płytki w celu zapewnienia szczelności. Natychmiast przystąpić do inkubacji mikropłytki w łaźni wodnej kontrolowanej termostatem lub w suchym inkubatorze przez 1 godzinę 5 minut w temperaturze 37 C 1 C. 11. Po zakończeniu inkubacji zdjąć folię. Zaaspirować zawartość wszystkich studzienek do pojemnika na odpady zakaźne (zawierającego podchloryn sodu). Przemyć mikropłytkę 4 razy 350 µl roztworu do czyszczenia (R2). Odwrócić mikropłytkę i delikatnie ostukać na papierze chłonnym w celu usunięcia pozostałej ilości płynu. 12. Szybko dodać 200 µl roztworu chromogenu (R9) do każdej studzienki z dala od światła. Pozwolić reakcji przebiegać w ciemności przez 30 ± 5 minut w temperaturze pokojowej ( C). W czasie tej inkubacji nie używać folii adhezyjnej. 13. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie 100 µl roztworu zatrzymującego reakcję (R10) do każdej studzienki. Zastosować tę samą sekwencję i szybkość wprowadzania jak w przypadku roztworu preparatu enzymatycznego. 14. Ostrożnie przetrzeć dolną stronę płytki. Odczytać gęstość optyczną przy 450/620 nm korzystając z czytnika płytki w ciągu 30 minut po zatrzymaniu reakcji. Przed dokonaniem odczytu paski muszą znajdować się ciągle z dala od światła. 15. Przed wydaniem wyników należy sprawdzić zgodność odczytu z planem dystrybucji płytki i próbek.

7 8 INTERPRETACJA WYNIKÓW 8.1 Obliczanie wartości odcięcia (CO) Wartość odcięcia (CO) odpowiada średniej wartości gęstości optycznych (OD) kalibratora (R4): CO = średnia OD dla R4 8.2 Obliczanie indeksu próbki Wynik próbki jest wyrażany w formie indeksu na podstawie poniższego wzoru: Indeks próbki = OD próbki /CO 8.3 Kontrola jakości Dla każdej mikropłytki i każdego cyklu należy uwzględnić wszystkie kalibratory i przeanalizować uzyskane wyniki. W celu weryfikacji testu należy spełnić następujące kryteria: Wartości gęstości optycznej: - CO 0,300-0,80 x CO < OD R4 Repl.1 < 1,20 x CO - 0,80 x CO < OD R4 Repl.2 < 1,20 x CO (Wartość OD dla kalibratorów (R4) nie może różnić się od wartości CO o więcej niż 20%). Stosunki gęstości optycznej: - Stosunek R3 (OD R3 / CO) 0,30 - Stosunek R5 (OD R5 / CO) 1,50 Jeśli te kryteria kontroli jakości nie zostaną spełnione, należy powtórzyć test. 8.4 Interpretacja wyników Stosunek próbki Wynik Interpretacja Stosunek < 0,80 Próbka o wyniku ujemnym 0,80 Stosunek < 1,00 Niejednoznaczny Stosunek 1,00 Próbka o wyniku dodatnim Próbka jest uważana za niereaktywną pod względem obecności przeciwciał IgM przeciwko wirusowi różyczki. Próbka jest uważana za niejednoznaczną pod względem obecności przeciwciał IgM różyczki. Wynik należy potwierdzić przez inny test wykonany na drugiej próbce pobranej co najmniej 3 tygodnie po pierwszym badaniu. Próbka jest uważana za reaktywną pod względem obecności przeciwciał IgM przeciwko wirusowi różyczki. Większą różnorodność stężeń można zaobserwować powyżej wartości 150 IU/ml. 8.4 Rozwiązywanie problemów Wyniki nie spełniające kryteriów walidacji i niepowtarzalne reakcje są często powodowane przez: Niedokładne przemycie mikropłytek. Zanieczyszczenie negatywnych próbek surowicą lub osoczem o wysokim stężeniu przeciwciał. Zanieczyszczenie roztworu preparatu enzymatycznego chemicznymi odczynnikami utleniającymi (wybielacz, jony metalu...). Zanieczyszczenie roztworu zatrzymującego reakcję.

8 9 CHARAKTERYSTYKA TESTU 9.1 Prewalencja Występowanie przeciwciał IgM przeciwko wirusowi różyczki zostało oznaczone przy pomocy testu Platelia Rubella IgM na panelu 347 próbek od kobiet ciężarnych. 2 próbki dały pozytywny wynik na obecność przeciwciał IgM przeciwko wirusowi różyczki. Prewalencja oznaczona z użyciem testu Platelia Rubella IgM zostało określone na 0,6% (2/347). Charakterystyka testu Platelia Rubella IgM została wykonana w 2 ośrodkach, przy użyciu w sumie 809 próbek od kobiet w ciąży i dawców krwi. W jednym ośrodku przeprowadzono badanie porównawcze przy użyciu testu Platelia Rubella IgM TMB (72922). W drugim ośrodku własności testu Platelia Rubella IgM oceniono przez porównanie z innym komercyjnie dostępnym testem EIA. 9.2 Badanie porównawcze (Ośrodek 1) Charakterystyka testu Platelia Rubella IgM została wykonana na panelu 399 próbek pogrupowanych w następujący sposób: 172 próbki surowicy od dawców krwi 151 próbek surowicy od kobiet w ciąży 76 próbek surowicy z komercyjnie dostępnych paneli reaktywnych w kierunku przeciwciał IgM przeciwko wirusowi różyczki Platelia Rubella IgM TMB (72922) Platelia Rubella IgM (72851) Ujemny Wątpliwy Dodatni Suma Ujemny Wątpliwy Dodatni Suma Zgodność globalna: 396/399 99,25% [IC 95% = 97,82% -99,84%] Swoistość względna: 319/321 99,38%* [IC 95% = 97,77% -99,92%] Swoistość względna: 77/78 98,72% [IC 95% = 93,06% - 99,97%]. * Wyniki wątpliwe uznano za pozytywne [IC 95%] = 95% przedział ufności. Dodatkowo przy użyciu obu zestawów oceniono 60 próbek surowicy z 7 kontroli poszczepiennych (wykonanych dwoma typami szczepionek): przeciwciała IgM przeciwko wirusowi różyczki pojawiały się zachowując identyczny schemat przy stosowaniu obu zestawów. 9.3 Charakterystyka (ośrodek 2) Charakterystyka testu Platelia Rubella IgM została wykonana na panelu 350 próbek pochodzących od: 47 dzieci w wieku 15 lat lub młodszych (27 dziewcząt i 20 chłopców) 299 dorosłych (298 kobiet w ciąży lub tuż po porodzie - i 1 mężczyzna) Jedna próbka surowicy pochodziła z badania Francuskiej Narodowej Kontroli Jakości. Wyniki zostały porównane z tymi uzyskanymi przy pomocy komercyjnie dostępnego testu EIA, uznanego za źródło odniesienia. Inny test EIA Platelia Rubella IgM (72851) Ujemny Wątpliwy Dodatni Suma Ujemny Wątpliwy Dodatni Suma

9 Swoistość względna: 344/345 99,71%* [IC 95% = 98,40% - 99,99%] * Wyniki wątpliwe uznano za pozytywne [IC 95%] = 95% przedział ufności. Wśród 5 próbek surowicy o wyniku pozytywnym: 4 zgodne próbki o wyniku pozytywnym zostały pobrane od tej samej osoby w różnym czasie, pozytywny wynik rozbieżnej próbki surowicy został potwierdzony przy użyciu trzeciego komercyjnie dostępnego testu EIA i odpowiadał próbce pobranej 4 miesiące po szczepieniu. 9.4 Reaktywność krzyżowa Panel 212 próbek zawierający 164 próbki o wyniku dodatnim w kierunku dla CMV, toksoplazmozy, EBV, HSV, VZV, świnki, odry i HIV oraz 48 próbek o wyniku dodatnim w kierunku czynnika reumatoidalnego, autoprzeciwciał i przeciwciał heterofilnych oraz próbki od pacjentów ze szpiczakiem został poddany oznaczeniom z użyciem testu Platelia Rubella IgM (72851) i Platelia Rubella IgM TMB (72922). Wśród tych próbek, 1 próbka CMV IgM uzyskała rozbieżny wynik pozytywny, natomiast 6 próbek dodatnich w kierunku czynnika reumatoidalnego uzyskało wynik pozytywny lub wątpliwy przy użyciu obu metod. ujemny wynik czterech z tych 6 próbek został potwierdzony przy użyciu innych komercyjnie dostępnych testów EIA. 9.5 Precyzja Precyzja w ramach cyklu (powtarzalność): W celu oceny powtarzalności, w ramach jednego testu przebadano jedną próbkę o wyniku ujemnym i trzy próbki o wyniku dodatnim, 30 razy w ciągu tego samego cyklu. Indeks (OD próbki/co) został określony dla każdej próbki. Poniższa tabela zawiera średni indeks, odchylenie standardowe (SD) oraz współczynnik zmienności (%CV) dla każdej próbki: Precyzja w ramach cyklu (powtarzalność) Próbka słabo Próbka Próbka wysoko N=30 Próbka ujemna dodatnia dodatnia dodatnia Stosunek (OD próbki/co) Średnia 0,07 1,73 2,51 4,06 SD 0,002 0,03 0,06 0,11 %CV 2,7% 1,8% 2,5% 2,7% Precyzja pomiędzy cyklami (odtwarzalność): W celu oceny powtarzalności pomiędzy testami przetestowano cztery próbki (jedną próbkę o wyniku ujemnym i trzy próbki o wyniku dodatnim) 20 razy w dwóch cyklach dziennie przez okres 20 dni. Indeks (OD próbki/co) został określony dla każdej próbki. Poniższa tabela zawiera średni stosunek, odchylenie standardowe (SD) oraz współczynnik zmienności (%CV) dla każdej próbki: Precyzja pomiędzy cyklami (odtwarzalność) Próbka słabo Próbka Próbka wysoko N=80 Próbka ujemna dodatnia dodatnia dodatnia Stosunek (OD próbki/co) Średnia 0,04 1,19 2,24 3,60 SD 0,005 0,03 0,06 0,10 %CV 12,7% 2,8% 2,6% 2,8%

10 10 OGRANICZENIA PROCEDURY Rozpoznanie zakażenia wirusem różyczki może być dokonane wyłącznie na podstawie połączenia danych klinicznych i biologicznych. Wynik pojedynczego oznaczenia miana przeciwciał IgM przeciwko wirusowi różyczki, nie stanowi dostatecznego dowodu, aby postawić diagnozę niedawnej infekcji wirusem różyczki. Diagnoza niedawnej infekcji może zostać postawiona wyłącznie na podstawie pełnych informacji na temat pacjenta, łącznie z danymi klinicznymi i biologicznymi (znaczny wzrost przeciwciał IgG przeciwko wirusowi różyczki w 2 kolejnych próbkach surowicy pacjenta pobranych w odstępie 3 tygodni i przetestowanych w ramach tego samego cyklu, obecność przeciwciał różyczki IgM na istotnym poziomie, niska awidność przeciwciał IgG przeciwko wirusowi różyczki). Obecność przeciwciał IgM przeciwko wirusowi różyczki nie jest wystarczającym dowodem potwierdzającym niedawną infekcję, ponieważ przeciwciała klasy IgM mogą utrzymywać się przez kilka miesięcy, lub nawet lat, po infekcji. Po wykryciu przeciwciał IgM, należy przeprowadzić badanie ilościowe przeciwciał klasy IgG przeciwko wirusowi różyczki oraz skontrolować ewolucję stężenia przeciwciał klasy IgG przeciwko wirusowi różyczki, przynajmniej na drugiej próbce surowicy pobranej trzy tygodnie później. Jeśli próbka zostanie poddana testowi zbyt wcześnie po niedawnej infekcji pierwotnej, przeciwciała IgM przeciwko wirusowi różyczki mogą jeszcze nie być obecne. Jeśli istnieje podejrzenie zakażenia, należy pobrać drugą próbkę około 3 tygodni później i przeprowadzić na niej ponownie test na obecność IgM. 11 KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Wszystkie produkowane i wprowadzane do sprzedaży odczynniki są przygotowywane zgodnie z naszym systemem jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Odczynniki każdej serii podlegają oznaczeniu kontrolnemu, i są dopuszczane do użytkowania, jeśli spełniają wymagane kryteria. Odpowiednie protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii są przechowywane w firmie. 12 LITERATURA 1. COOPER, L.Z., BUIMOVICI-KLEIN, E : Rubella. In Virology: Edited by Fields, B.N., et al. New York, New York: Raven Press. 2. DORSETT, P.H., MILLER, D.C., GREEN, K., BYRD, F : Structure and function of the Rubella virus proteins. Reviews of Infect. Dis., 7 (Suppl. 1): S 150-S FORSGREN, M : Standardization of techniques and reagents for the study of Rubella antibody. Rev. Infect. Dis., 7 (Suppl. 1): S 129-S KALKKINEN, N., OKER-BLOM, C., AND PETTERSSON, R.F : Three genes code for Rubella virus structural proteins El. E2a, E2b, and C. J. Gen. Virol, 65: LUCAS, G., et al. April 17-20, : Serological diagnosis of IgG immunoglobulins ant-rubella by immunoenzymatic assay in a commercially available kit. Nice: 4th European Congress of Clinical Microbiology. 308/PP MAURIN, J : Le virus de la rubéole. Bulletin de l Institut Pasteur 1969, 67, Virologie médicale, chap. 34, Flammarion Médecine Sciences. 7. NCCLS Document I/LA6-T Tentative Guideline December 1992 : Evaluation and Performance Criteria for Multiple Component Test and Product intended for the Detection and Quantitation of Rubella IgG Test Products. 8. PETTERSSON, R., et al : Molecular and antigenic characteristics and synthesis of Rubella virus structural proteins. Reviews of Infect. Dis., 7 (Suppl. 1): S 140-S WOLINSKY J.S. : Rubella. In Virology, 1990, 2nd Ed Edited by Fields, B.N., and al. New York: Raven Press, Ltd.

11

12

13 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)