PLATELIA CANDIDA Ab/Ac/Ak TESTÓW

Transkrypt

1 PLATELIA CANDIDA Ab/Ac/Ak TESTÓW TEST IMMUNOENZYMATYCZNY DO ILOŚCIOWEGO OZNACZANIA PRZECIWCIAŁ ANTY-MANNANOWYCH CANDIDA W SUROWICY 1- PRZEZNACZENIE TESTU Platelia Candida Ab/Ac/Ak jest mikropłytkowym, pośrednim testem immunoenzymatycznym do ilościowego oznaczania przeciwciał anty-mannanowych Candida w surowicy. 2- ZALECENIA DO STOSOWANIA TESTU Diagnostyka inwazyjnej kandydozy musi opierać się na połączeniu wyników badań w kierunku przeciwciał anty-mannanowych oraz wykrywaniu krążącego antygenu mannanowego (Platelia Candida Ag nr kat ). Połączenie wyników obu tych badań pozwala na wcześniejsze diagnozowanie i podnosi czułość procedury rozpoznania inwazyjnej kandydozy w procesie pełnego podejścia diagnostycznego, łączącego dane kliniczne z mykologicznymi oraz ewaluację endogennych i jatrogennych czynników ryzyka 13. Połączenie obu tych badań jest integralnym elementem klinicznego i laboratoryjnego monitorowania pacjentów jako pomoc w podjęciu decyzji o przebiegu leczenia. 3- ZASADA DZIAŁANIA Zakażenia wywołane przez Candida są najczęstszą formą zakażeń szpitalnych wywoływanych przez grzyby 1. Zakażenia układowe stanowią najcięższą postać z 30-70% śmiertelnością u pacjentów w immunosupresji 11. Diagnostykę tych zakażeń utrudnia brak swoistych dla zakażenia grzybiczego objawów oraz niska czułość wykrywania metodą hodowli, mimo postępów poczynionych na tym polu. Inwazyjną kandydozę w celu wdrożenia leczenia, diagnozuje się przeważnie na podstawie połączenia danych klinicznych, mykologicznych i wiedzy o istniejących czynnikach ryzyka 8. W tym kontekście, diagnostyka kandydoz układowych musi obejmować badania serologiczne jak też i bezpośrednie badanie mykologiczne. Platelia Candida Ab/Ac/Ak umożliwia wykrywanie przeciwciał skierowanych przeciw antygenowi mannanowemu, który jest głównym składnikiem ściany komórkowej drożdżaków należących do rodzaju Candida 2. Mannan, marker inwazyjnej kandydozy 3, 4, jest wysoce immunogennym polisacharydem ZASADA OZNACZENIA Test Platelia Candida Ab/Ac/Ak jest dwustopniowym, pośrednim testem immunoenzymatycznym do ilościowego wykrywania przeciwciał anty-mannanowych w surowicy ludzkiej. Do dołków mikropłytki opłaszczonych oczyszczonym mannanem C.albicans dodawane są rozcieńczone próbki surowicy. Po inkubacji paski płucze się, w celu usunięcia niezwiązanego materiału. Następnie do studzienek dodawany jest koniugat. W obecności przeciwciał antymannanowych powstaje kompleks: mannan- ludzkie przeciwciało anty-mannanowe kozie przeciwciało anty-igg/ peroksydaza. Paski płucze się, w celu usunięcia niezwiązanego materiału. Następnie, dodaje się roztwór substratu, który reaguje z kompleksami związanymi z dołkiem wywołując niebieskie zabarwienie. Po dodaniu kwasu, reakcja enzymatyczna zostaje zatrzymana, a zabarwienie z niebieskiego zmienia się na żółte. Wartości absorbancji próbek i kontroli określa się spektrofotometrycznie przy długości fali 450 i 620 nm. 1

2 5- SKŁAD ZESTAWU Test Platelia Candida Ab/Ac/Ak nr kat Zestaw należy przechowywać w temperaturze 2-8 C. Przed użyciem wszystkie odczynniki przenieść do temperatury pokojowej (18-25 C). Natychmiast po użyciu wszystkie odczynniki powinny być przeniesione do temperatury 2-8 C. Niezużyte paski/płytki włożyć do opakowania, zamknąć szczelnie. Nie usuwać środka pochłaniającego wilgoć. Paski powinny być zużyte w ciągu 5 tygodni od pierwszego otwarcia opakowania. Rozcieńczony bufor do płukania można przechowywać przez 14 dni w temp. 2-8 C. Wszystkie pozostałe odczynniki po otwarciu są stabilne do daty ważności podanej na opakowaniu. Dostarczona ilość odczynników wystarcza do przeprowadzenia 96 testów w maksimum 6 seriach. Składnik Zawartość Ilość R1 Mikropłytka -96 dołków (12 pasków z 8 dołkami każdy) opłaszczonych oczyszczonym antygenem mannanowym C.albicans. 1 płytka / 12 8 dołków R2 Stężony bufor do - bufor Tris NaCl (ph 7.4) ml płukania (10x) - 1% Tween 20-0,01% tiomersal R3 Kontrola ujemna - Ludzka surowica ujemna pod względem przeciwciał antymannanowych. 1 x ml - Jest ona ujemna pod względem przeciwciał anty-hiv-1 i anty-hiv-2 oraz antygenów HBs i przeciwciał anty-hcv. - Konserwant: < 0.1% azydek sodu R4 Surowica kalibracyjna - Zawiesina ludzkich przeciwciał anty-mannanowych, uzyskanych z surowicy ujemnej pod względem przeciwciał anty-hiv-1 i anty-hiv-2 oraz antygenów HBs i przeciwciał anty-hcv. Stosowana do wykreślenia krzywej wzorcowej (patrz p.10 Procedura). - Jest ona ujemna pod względem przeciwciał anty-hiv-1 i anty-hiv-2 oraz antygenów HBs i przeciwciał anty-hcv. - Konserwant: < 0.1% azydek sodu R5 Kontrola Dodatnia - Ludzka surowica zawierająca przeciwciała anty-mannanowe. - Jest ona ujemna pod względem przeciwciał anty-hiv-1 i anty-hiv-2 oraz antygenów HBs i przeciwciał anty-hcv. - Konserwant: < 0.1% azydek sodu R6 Koniugat (gotowy do użycia) R7 Rozcieńczalnik próbek (gotowy do użycia) R8 Bufor substratu TMB (gotowy do użycia) R9 R10 Chromogen: roztwór TMB (stężony) Roztwór zatrzymujący(goto wy do użycia) - Antyglobulinowe przeciwciała kozie znakowane peroksydazą. -Środek konserwujący: 0,01% tiomersal -kwaśny roztwór EDTA, bez środka konserwującego -Roztwór kwasu cytrynowego i octanu sodu ph 5.2-0,009% Nadtlenek wodoru -4% Dwumetylosulfotlenek (DMSO) -90% roztwór dwumetylosulfotlenku (DMSO) zawierający 0,6% tetrametylobenzydynę (TMB) * 1 x ml 1 x ml 1 12 ml 2 x 100 ml 1 60 ml 1 1 ml -1.5 N Kwas siarkowy (H 2 SO 4 ) 1 12 ml Folia adhezyjna Folia adhezyjna do mikropłytek 4 arkusze * Uwaga: TMB (tetrametylobenzydyna) - jest nierakotwórczym i niemutagennym substratem chromogennym dla peroksydazy. 6- HIGIENA I BEZPIECZEŃSTWO PRACY 1. Wyrób do diagnostyki in vitro. 2. Tylko do użytku profesjonalnego. 3. Nie zaleca się stosowania próbek innych niż ludzka surowica. 2

3 4. Surowica kontrolna dodatnia, surowica kalibracyjna i surowica kontrolna ujemna to inaktywowana termicznie surowica ludzka. Próbki zostały przebadane z użyciem zatwierdzonych we Francji testów i uznane za ujemne w kierunku: przeciwciał anty-hiv -1/2 i anty-hcv, jak również antygenu HBs. Ponieważ żadna ze znanych metod badawczych nie może dać całkowitej pewności, co do nieobecności czynników zakaźnych, z odczynnikami jak i z próbkami pacjentów należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym. Oznaczenia należy prowadzić z zastosowaniem środków ochrony właściwych dla patogenów przenoszonych drogą krwi. 5. W trakcie pracy z odczynnikami i próbkami używać rękawiczek i okularów ochronnych. Po wykonaniu testu umyć dokładnie ręce. 6. Nie pipetować ustami. 7. Nie palić, nie pić i nie jeść w miejscu pracy z próbkami i odczynnikami zestawu. 8. Unikać rozlania próbek i roztworów zawierających próbki. 9. Niezawierające kwasów rozlane płyny zawierające materiały biologiczne, należy wytrzeć dokładnie z stosując środek dezynfekujący. Jako środka dezynfekującego można użyć między innymi: 10% wybielacza (0.5% roztwór podchlorynu sodu), 70% etanolu lub 0.5% Wescodyne. W przypadku rozlania kwaśnych cieczy, należy je dokładnie wytrzeć bibułą lub zobojętnić dwuwęglanem sodu, a następnie przemyć środkiem dezynfekującym. Materiały użyte do wycierania rozlanych cieczy należy wyrzucić do pojemnika na odpady biologiczne. UWAGA: Nie wstawiać roztworów zawierających wybielacz do autoklawu. 10. Wszystkie próbki i materiały używane do wykonania testu należy traktować jak materiał potencjalnie zakaźny. Należy przestrzegać wszelkich wymagań odnośnie usuwania odpadów tego rodzaju. 11. Niektóre z odczynników zestawu zawierają jako konserwant azydek sodu. W połączeniu z ołowiem lub miedzią, azydek sodu może w kanalizacji tworzyć wybuchowe azydki metali. Usuwając do kanalizacji inaktywowane roztwory zawierające azydki należy spłukać zlew dużą ilością wody, aby zapobiec ich kumulacji. 12. UWAGA: Xi - drażniący 1.5 N kwas siarkowy (H 2 SO 4 ) i 90% DMSO (dwumetylosulfotlenek) R36/38: Substancja drażniąca dla oczu i skóry. S26-30: W razie kontaktu z oczami natychmiast przemyć dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza. Nigdy nie dodawać wody do tego produktu. 13. Należy unikać kontaktu skóry i błon śluzowych z buforem do substratu, chromogenem i roztworem zatrzymującym (możliwość zatrucia, podrażnienia i poparzenia). 14. Karta charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) jest dostępna na żądanie. 7- ZALECENIA DLA UŻYTKOWNIKA 1. ZAMROŻONE PRÓBKI, PRZECHOWYWANE W NIEZNANYCH WARUNKACH MOGĄ DAWAĆ WYNIKI FAŁSZYWE DODATNIE Z POWODU ZANIECZYSZCZENIA GRZYBAMI I/LUB BAKTERIAMI. 2. Nie używać odczynników po upływie terminu ważności. 3. Z wyjątkiem stężonego buforu do płukania (R2) oraz roztworu zatrzymującego (R10), nie mieszać odczynników z różnych zestawów posiadających odmienny numer serii. 4. Przynajmniej 15 minut przed użyciem przenieść wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej. 5. Starannie mieszać odczynniki w trakcie rekonstytucji, unikając ich zanieczyszczenia. 6. Nie wykonywać testu w obecności reaktywnych par związków (kwasów, zasad, aldehydów) lub kurzu, które mogą pływać na aktywność enzymatyczną koniugatu. 7. Do przygotowywania roztworu substrat-chromogen używać czystych, jednorazowych, polipropylenowych pojemników. W przypadku stosowania naczyń szklanych, należy przemyć je 1N kwasem solnym, a następnie wypłukać wodą destylowaną i wysuszyć. 8. Podczas ręcznego pipetowania kontroli i próbek, w celu uniknięcia zanieczyszczania materiałem pochodzącym z próbek, za każdym razem zmieniać jednorazową końcówkę. 3

4 9. W celu zapewnienia dokładnego przemycia dołków, należy przestrzegać zalecanej ilości cykli płukania oraz zwracać uwagę, czy studzienki są całkowicie napełniane a następnie opróżniane. Do przemywania nie należy stosować tryskawki. 10. Nie dopuszczać do wysuszenia mikropłytki między etapem płukania a dodawaniem kolejnego odczynnika. 11. Nigdy nie używać tych samych pojemników dla roztworów koniugatu i substratu. 12. Nie dopuszczać do kontaktu koniugatu i roztworu substrat-chromogen z metalami i jonami metali. 13. Przechowując odczynniki i wykonując oznaczenie, unikać ekspozycji koniugatu i roztworu substrat-chromogen na silne światło. Nie dopuszczać do kontaktu roztworów chromogenu z utleniaczami. 14. Unikać kontaktu roztworu zatrzymującego z utleniaczami. Nie dopuszczać do kontaktu roztworu zatrzymującego z metalami i jonami metali. 15. Ograniczyć do minimum kontakt roztworów (próbek, roztworu do przygotowywania próbek, koniugatu) oraz otwartych pojemników (mikropłytek, próbówek i pipet) z powietrzem. 16. Nie zlewać niezużytego koniugatu do oryginalnego opakowania. 17. Roztwór substrat-chromogen musi być bezbarwny. Pojawienie się wkrótce po rozcieńczeniu niebieskiego zabarwienia, wskazuje na zanieczyszczenie odczynnika i oznacza, iż nie może być on stosowany. Należy przygotować nowy odczynnik. 8- PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW I WARUNKI PRZECHOWYWANIA Mikropłytka (R1) Po otwarciu oryginalnego opakowania, studzienki mikropłytek zachowują zdolność reakcyjną przez 5 tygodni, o ile są przechowywane w temp. 2-8 C, w szczelnie zamkniętej torebce, w obecności pochłaniacza wilgoci. Stężony bufor do płukania (R2) Przygotować roboczy bufor do płukania dodając jedną część stężonego buforu do płukania do dziewięciu części jałowej wody dejonizowanej lub destylowanej. Roboczy bufor do płukania może być przechowywany przez 14 dni w temp. 2-8 C. Przygotowywać odpowiednią ilość buforu na całe badanie (80 ml buforu wystarcza na jeden pasek : 8 ml R ml wody destylowanej). Stężony odczynnik po otwarciu należy przechowywać w temp C, przy braku zanieczyszczenia, odczynnik jest stabilny do daty ważności podanej na opakowaniu. Roztwór roboczy substrat-chromogen (R8 + R9) Przygotować roztwór substrat-chromogen, dodając jedną część stężonego roztworu chromogenu TMB (R9) do 50 części buforu substratu TMB (R8). Przygotować 2 ml roztworu substrat-chromogen na każdy pasek: 40 µl (R9) + 2 ml (R8). Roztwór zachowuje trwałość przez 6 godz. przechowywany w ciemności, w temperaturze pokojowej ( C). Po otwarciu, odczynniki R8 i R9 przechowywane w temp C, przy braku zanieczyszczenia, są stabilne do daty ważności podanej na opakowaniu. Surowica kontrolna ujemna (R3), Surowica kalibracyjna (R4), Surowica kontrolna dodatnia (R5) Koniugat (R6), rozcieńczalnik próbek (R7) i roztwór zatrzymujący (R10) Po otwarciu, odczynniki R3, R4, R5, R6, R7 i R10 przechowywane w temp C przy braku zanieczyszczenia, są stabilne do daty ważności podanej na opakowaniu. 9- POBIERANIE PRÓBEK Pobrać krew zgodnie z rutynową procedurą. Oznaczenie należy wykonywać z użyciem surowicy. Próbki surowicy muszą być wolne od spor grzybiczych i/lub bakterii. Próbówki z próbkami podczas przechowywania i transportu powinny być szczelnie zamknięte, bez dostępu powietrza. Przed oznaczeniem próbki w zamkniętej probówce, w temp. 2-8 C mogą być przechowywane przez 24 godziny. W celu dłuższego przechowywania surowicę należy zamrozić w -70 C. Próbki surowicy mogą być zamrażane/rozmrażane najwyżej raz. Rozmrożone próbki przez oznaczeniem należy dokładnie wymieszać. Nie ogrzewać próbek. 4

5 Nie badano wpływu nadmiernych ilości albuminy, lipidów, hemoglobiny ani bilirubiny na wynik oznaczenia. Nie używać surowicy pozbawionej dopełniacza. 10- PROCEDURA Materiały dostarczone Patrz rozdział ODCZYNNIKI. Materiały potrzebne, ale niedostarczone w zestawie 1. Jałowa woda destylowana lub dejonizowana, do rozcieńczania buforu do płukania. 2. Bibuła. 3. Rękawice jednorazowego użytku. 4. Okulary ochronne. 5. Podchloryn sodu (wybielacz) i dwuwęglan sodu. 6. Pipety lub pipety wielokanałowe, nastawne lub stało-objętościowe, pozwalające odmierzać i dozować 2 µl, 100 µl, i 400 µl. 7. Próbówki do rozcieńczania próbek surowicy 8. Wortex. 9. Inkubator mikropłytek nastawiony na temp. 37 ± 1 C. 10. Półautomatyczna lub automatyczna płuczka mikropłytek. 11. Czytnik mikropłytek wyposażony w filtry 450nm i 620 nm. 12. Pojemnik na odpady zakaźne. Uwagi proceduralne W celu walidacji każdej serii oznaczeń należy zawsze stosować surowice kontrolne: ujemną, dodatnią oraz standardy. Przygotowanie standardów Stężenie przeciwciał anty-mannanowych wyrażane jest w jednostkach umownych AU/ml (Arbitrary Units): Standard 20 AU/ml: rozcieńczenie 1:441 R4 w R7: dwa kolejne rozcieńczenia 1:21 (40 μl μl rozcieńczalnika). Standard 10 AU/ml: rozcieńczenie 1:2 standardu 20 AU/ml (200 μl μl rozcieńczalnika). Standard 5 AU/ml: rozcieńczenie 1:4 standardu 20 AU/ml (100 μl μl rozcieńczalnika). Standard 2.5 AU/ml: rozcieńczenie 1:8 standardu 20 AU/ml (50 μl μl rozcieńczalnika). Przygotowanie próbek i kontroli Wykonać dwa kolejne rozcieńczenia 1/81 (10 μl surowicy μl R7); podobnie przygotować kontrolę dodatnią i ujemną. Procedura testu EIA Oznaczenie należy wykonać ściśle wg opisanej procedury. Stosować się do zasad Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. 1. Wszystkie odczynniki przenieść do temperatury pokojowej (18-25 C) przynajmniej 15 min. przed użyciem. 2. Przygotować bufor do płukania, roztwór substrat-chromogen oraz surowice kontrolne: dodatnią, ujemną i standardy. 3. Należy ustalić rozkład używanych dołków dla badanych surowic, standardów (20, 10, 5 i 2.5 AU/ml) i kontroli. - A1: surowica kontrolna ujemna (R3) - B1: surowica kontrolna - standard 2.5 AU/ml - C1: surowica kontrolna - standard 5 AU/ml - D1: surowica kontrolna - standard 10 AU/ml - E1: surowica kontrolna - standard 20 AU/ml - F1: surowica kontrolna dodatnia (R5) - G1: surowica kontrolna dodatnia(r5) 5

6 4. Wyjąć ramkę i paski (R1) z opakowania. Paski, które nie będą używane schować do opakowania z pochłaniaczem wilgoci i szczelnie zamknąć. 5. Do dołków dodać po 100 µl rozcieńczonych próbek, kontroli i standardów. 6. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną lub podobnym materiałem, tak by zapewnić ochronę przed odparowaniem płynu z dołków. Upewnić się, iż zamknięcie jest wodoszczelne i przykryta jest cała powierzchnia. 7. Inkubowa płytk w suchym inkubatorze mikropłytek przez 60 ± 5 min. w temp. 37 C (± 1 C). 8. Zdjąć przykrycie. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika na odpady z podchlorynem sodu). Wykonać 4 cykle płukania. Po ostatnim płukaniu, odwracając i ostukując, osuszyć mikropłytkę z resztek płynu na bibule. 9. Przed użyciem koniugat (R6) wymieszać przez odwracanie. 10. Dodać po 100 µl koniugatu (R6) do każdego dołka. 11. Zakryć szczelnie mikropłytkę folią adhezyjną lub podobnym materiałem, tak by zapewnić ochronę przed odparowaniem płynu z dołków. Upewnić się, iż zamknięcie jest wodoszczelne i przykryta jest cała powierzchnia. 12. Inkubowa płytk w suchym inkubatorze mikropłytek przez 60 ± 5 min. w temp. 37 C (± 1 C). 13. Zdjąć przykrycie. Zaaspirować zawartość studzienek (do pojemnika na odpady z podchlorynem sodu). Wykonać 4 cykle płukania. Po ostatnim płukaniu, odwracając i ostukując, osuszyć mikropłytkę z resztek płynu na bibule. 14. Unikając ostrego światła, szybko nanieść do studzienek po 200 ul roztworu substrat-chromogen (R8+R9). 15. Inkubować mikropłytkę w ciemności, przez 30 ± 5 min, w temp. pokojowej (18-30 C). Nie zakrywać folią adhezyjną. 16. Zatrzymać reakcję enzymatyczną przez dodanie do każdej studzienki 100 ul roztworu zatrzymującego (R10). Roztwór ten dodawać w tej samej kolejności jak roztwór substratu. Wymieszać dokładnie. 17. Wytrzeć starannie spód każdej mikropłytki. 18. Odczytać gęstość optyczną dla każdego dołka przy 450 nm (z filtrem referencyjnym 620 nm). Wyniki odczytać w ciągu 30 min. od zatrzymania reakcji. 11- KONTROLA JAKOŚCI (KRYTERIA WAŻNOŚCI) Następujące kryteria muszą być spełnione w celu walidacji oznaczenia: Wartość gęstości optycznej: 0.400< OD standardu 5 AU/ml < Proporcje: OD standardu 20 AU/ml / OD standardu 5 AU/ml > 2 OD standardu 10 AU/ml / OD standardu 5 AU/ml > 1.4 OD standardu 2.5 AU/ml / OD standardu 5 AU/ml < 0.8 Stężenie przeciwciał anty-mannanowych: Stężenie R3: < 2.5 AU/ml Stężenie R5: stężenie podane na fiolce ± 2.5 AU/ml 12- INTERPRETACJA WYNIKÓW Krzywa wzorcowa Krzywą wzorcową wyznaczają cztery punkty, odpowiadające wartościom uzyskanym dla czterech standardów: 2.5, 5, 10, i 20 A/U, będących rozcieńczeniami dodatniej surowicy kalibracyjnej (R4). do krzywej nie włącza się wartości surowic kontrolnych, dodatniej (R5) i ujemnej (R3). Aby uzyskać najwyższą precyzję, należy ekstrapolując wykreślić krzywą sigmoidalną na osi X zaznaczając stężenie przeciwciał w jednostkach AU/ml (skala logarytmiczna), na osi Y wartości odczytu OD (skala liniowa). Jeśli czytnik nie posiada opcji definiowania skali, należy wykreślić krzywą łączącą punkty odpowiadające wartościom standardów. 6

7 Oznaczenie stężenia przeciwciał anty-mannanowych w badanej surowicy Krzywa wzorcowa może być użyta do odczytania stężenia przeciwciał anty-mannanowych w AU/ml dla każdej z badanych surowic. Interpretacja wyników Próbki surowicy z poziomem przeciwciał poniżej 5 AU/ml (C < 5) są uznawane za ujemne pod względem obecności przeciwciał anty-mannanowych. Próbki surowicy z poziomem przeciwciał pomiędzy 5-10 AU/ml (5 C < 10) są uznawane za pośrednie pod względem obecności przeciwciał anty-mannanowych. Próbki surowicy z poziomem przeciwciał powyżej 10 AU/ml (C 10) są uznawane za dodatnie pod względem obecności przeciwciał anty-mannanowych. Krzywa wzorcowa wykreślona w oparciu o standardy nie pozwala na dokładne określenie poziomu przeciwciał, jeżeli ich stężenie wynosi powyżej 20 AU/ml. W celu uzyskania bardziej pracyzyjnych wyników dla silnie dodatnich surowic, test należy powtórzyć po rozcieńczeniu badanej surowicy 1:4 w roztworze do rozcieńczania próbek (R7) zanim wykonane zostanie rozcieńczenie opisane w procedurze wykonania testu (patrz punkt 10). Uzyskany wynik OD pomnożyć przez 4. Określenie poziomu przeciwciał anty-mannanowych jest istotne przy określaniu statusu immunologicznego chorego w stosunku do zakażenia Candida. Obecność przeciwciał odzwierciedla obecność grzybów z rodzaju Candida i musi być interpretowana jako dodatkowy czynnik ryzyka rozwoju układowej kandydozy u pacjentów z grupy ryzyka 5, 13. Nagły wzrost poziomu przeciwciał mówi o przejściu do fazy aktywnego zakażenia: wyniki te powinny być interpretowane w świetle danych klinicznych. W diagnostyce inwazyjnej kandydozy monitorowanie miana przeciwciał powinno być połączone z określeniem miana antygenu krążącego. Wykonywanie regularnych badań skryningowych jest bardziej informatywne, niż wynik pojedynczego oznaczenia i umożliwia monitorowanie pacjentów z grup wysokiego ryzyka 7, 12. Zalecane jest wykonywanie regularnych badań skryningowych u pacjentów z grupy wysokiego ryzyka, aby podnieść czułość procedury i uchwycić wczesną konwersję na wynik dodatni testu. 13- OGRANICZENIA TESTU 1. Wynik ujemny nie wyklucza rozpoznania inwazyjnej kandydozy. Trudno jest interpretować brak przeciwciał u pacjentów z upośledzonym układem odpornościowym. 2. Ujemny wynik w teście wykrywającym przeciwciała anty-mannanowe należy interpretować jednocześnie z wynikiem testu wykrywającego antygen mannanowy: u pacjentów dodatnich w kierunku przeciwciał anty-mannanowych trudniej jest wykryć antygen mannanowy (patrz p. 14 Charakterystyka testu). 3. Na wykrywanie antygenu mannanowego w surowicy ma wpływ ilość testów wykonanych dla danego pacjenta 4. Regularne monitorowanie pacjentów wysokiego ryzyka oraz wykonywanie testu na obecność przeciwciał anty-mannanowych podnosi czułość procedury i pozwala uchwycić wczesną konwersję na wynik dodatni. 4. Wykonując oznaczenie należy przestrzegać procedury wykonania testu oraz zasad interpretacji wyników testu Platelia Candida Ab/Ac/Ak. Przed przystąpieniem do wykonania testu użytkownik powinien dokładnie zapoznać się z instrukcją obsługi. W szczególności dokładnie przestrzegana musi być procedura pipetowania próbek i odczynników, płukania płytki oraz czasy inkubacji. 5. Dodanie próbki lub odczynnika niezgodnie z procedurą może prowadzić do uzyskania wyników fałszywie ujemnych. Należy rozważyć powtórzenie badania dla kolejnej próbki w przypadku podejrzenia inwazyjnej kandydozy w oparciu o dane kliniczne lub wystąpienia błędu proceduralnego. 6. W przypadku nieostrożnego obchodzenia się z mikropłytkami lub technicznie nieprawidłowego pipetowania odczynników, możliwe jest zanieczyszczenie dołków z ujemną próbką pacjenta na skutek przelania się do nich zawartości dołka z kontrolą lub próbką dodatnią. 7

8 14- CHARAKTERYSTYKA TESTU Powtarzalność Współczynnik zmienności wyliczony w badaniach powtarzalności wewnątrz-testowej (30 replikatów) i między-testowej (5 dni) potwierdził wysoką jakość testu ( współczynnik zmienności (AU/ml) < 10% dla próbek dodatnich, natomiast pomiędzy testami, oraz współczynnik zmienności < 17.5% dla próbek dodatnich w badaniach między-testowych). Powtarzalność wewnątrz-testowa: 4 surowice (1 ujemna, 2 pośrednie o stężeniu przeciwciał 8.5 AU/ml i 9.7 AU/ml, oraz 1 dodatnia o stężeniu 14.4 AU/ml) oznaczono w 30 powtórzeniach. Uzyskano dla nich powtarzalność wynoszącą odpowiednio 3.6%, 4.8%, 6.9% i 5.4%. Powtarzalność pomiędzy-testowa: Przez 5 dni oznaczano 4 surowice ujemne, 1 pośrednią i 2 dodatnie. Współczynnik zmienności wynosił < 17.5% dla wartości uzyskiwanych dla surowic dodatnich i pośredniej Oznaczenia kliniczne SWOISTOŚĆ Test Platelia Candida Ab/Ac/Ak, wykonany na próbkach surowic od 700 hospitalizowanych chorych, charakteryzował się 83% korelacją (współczynnik Spearmana) z metodą immunofluorescencyjną wykrywania przeciwciał 10. Swoistość testu, uzyskana dla różnych populacji pacjentów, przedstawia tabela. Stężenie przeciwciał anty-mannanowych uzyskane dla różnych populacji badanych w oznaczeniu testem Platelia Candida Ab/Ac/Ak: Stężenie przeciwciał (AU/ml) Kategoria pacjentów Liczba C < C < 5 5 C < C < 20 C 20 pacjentów (surowic) Nie wybierani 173 (173) 82.1% (142) 11% (19) 4.6% (8) 1.7% (3) 0.6% (1) Hospitalizowani 33 (62) 84.9% (28) 9.1% (3) 3.0% (1) 3.0% (1) Nie skolonizowani Hospitalizowani 102 (221) 20.6% (21) 11.8% (12) 31.4% (32) 22.5% (23) 13.7% (14) Skolonizowani Candida Inwazyjna kandydoza 117 (384) 25.6% (30) 8.5% (10) 20.5% (24) 16.2% (19) 29.2% (34) CZUŁOŚĆ W celu oceny czułości testu Platelia Candida Ab/Ac/Ak przeprowadzono badania w czterech szpitalach akademickich na terenie Francji. Wykonano badania retrospektywne dla 337 surowic (117 pacjentów) z różnych oddziałów szpitalnych (chirurgia, hematologia, OIOM, oparzeniowy, itp.). Drożdżaki z rodzaju Candida były izolowane z krwi tych pacjentów lub z głębokich materiałów klinicznych 6, 9, 10. Dla badanej populacji, uzyskano dla testu Platelia Candida Ab/Ac/Ak uzyskano ogólną czułość 60% (wyłączając 16% pacjentów, dla których uzyskano wynik pośredni pomiędzy 5 a 10 AU/ml). 8

9 Czułość testu różniła się w zależności od izolowanego gatunku Candida: Gatunek Liczba pacjentów (liczba surowic) Czułość C 10 C 10 i 5 C < 10 C.tropicalis 10 (72) 66.7 % 76.7 % C.glabrata 12 (31) 30.0% 46.7 % C.albicans 75 (219) 71.0 % 88.3 % C.kefyr 2 (5) 50.0 % 50.0 % C.parapsilosis 10 (29) 25.0 % 45.0 % C.krusei 8 (21) 42.9 % 62.9 % Badania te wykazały celowość jednoczesnego wykonywania testu na obecność przeciwciał antymannanowych i testu Platelia Candida Ag, wykrywającego antygen krążący. Testy te wykonano dla 106 pacjentów z inwazyjną kandydozą 9, 10. Uzyskano czułość 84.8% (wyłączając 6.6% pacjentów, dla których uzyskano wynik pośredni pomiędzy 5 a 10 AU/ml). Wykazano nie tylko przydatność wykonywania obu oznaczeń dla populacji wysokiego ryzyka, ale i obserwować można także balans pomiędzy wynikami obu tych testów podczas jednego epizodu zakażenia Candida, co może być pomocne w prognozie rozwoju infekcji KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Wszystkie produkty Bio-Rad są przygotowane zgodnie z naszym systemem jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Każda seria ostatecznego produktu podlega oznaczeniu kontrolnemu i jest dopuszczona do użytku, jeśli spełnia wymagane kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii. 17- BIBLIOGRAFIA 1. FRIDKIN, S. K. and W. R. JARVIS Epidemiology of nosocomial fungal infections. Clin. Microbiol. Rev. 9: p FUKAZAWA, Y Antigenic structure of Candida albicans. Immunochemical basis of the serologic specificity of the mannans in yeasts. Immunol. Ser. 47: p HERENT, P., D. STYNEN, F. HERNANDO, J. FRUIT, and D. POULAIN Retrospective evaluation of two latex agglutination tests for detection of circulating antigens during invasive candidosis. J. Clin. Microbiol. 30: p PONTON, J., M. MORAGUES, and G. QUINDOS Non-Culture-Based Diagnostics, p In R. Calderone (ed.), Candida and Candidiasis. ASM Press, Washington, D.C. 5. POULAIN, D Physiopathologie et diagnostic des candidoses systémiques. La Lettre de l'infectiologue 15: p RODIER, M.H., C. KAUFFMAN-LACROIX, P. GAUTRET, D. MAYET and J.L. JACQUEMIN Evaluation of a mettalopeptidase antigen from Candida albicans in serodiagnosis of candidosis : comparison of technics. Journal Mycologie Médicale 9: p RUCHEL, R Diagnosis of invasive mycoses in severely immunosuppressed patients. Ann. Hematol. 67: p RUHNKE, M. and G. MASCHMEYER Management of mycoses in patients with hematologic disease and cancer - review of the literature. Eur. J. Med. Res. 7: p

10 9. SENDID, B., J. L. POIROT, M. TABOURET, A. BONNIN, D. CAILLOT, D. CAMUS, and D. POULAIN Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p SENDID, B., M. TABOURET, J. L. POIROT, D. MATHIEU, J. FRUIT, and D. POULAIN New enzyme immunoassays for sensitive detection of circulating Candida albicans mannan and antimannan antibodies: useful combined test for diagnosis of systemic candidiasis. J. Clin. Microbiol. 37: p TIRABOSCHI, I. N., J. E. BENNETT, C. A. KAUFFMAN, J. H. REX, C. GIRMENIA, J. D. SOBEL, and F. MENICHETTI Deep Candida infections in the neutropenic and nonneutropenic host: an ISHAM symposium. Med. Mycol. 38 Suppl 1: p VAN DEVENTER, A. J., W. H. GOESSENS, J. H. VAN ZEIJL, J. W. MOUTON, M. F. MICHEL, and H. A. VERBRUGH Kinetics of anti-mannan antibodies useful in confirming invasive candidiasis in immunocompromised patients. Microbiol. Immunol. 40: p VERWEIJ, P. E., D. POULAIN, T. OBAYASHI, T. F. PATTERSON, D. W. DENNING, and J. PONTON Current trends in the detection of antigenaemia, metabolites and cell wall markers for the diagnosis and therapeutic monitoring of fungal infections. Med. Mycol. 36 Suppl 1: p YERA, H., B. SENDID, N. FRANCOIS, D. CAMUS, and D. POULAIN Contribution of serological tests and blood culture to the early diagnosis of systemic candidiasis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 20: p

11 CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) Znak CE (Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady nr 98/79/CE o wyrobach diagnozy medycznej in vitro) For in vitro diagnostic use Wyrób do diagnostyki in vitro Catalogue number Numer katalogowy Manufacturer Wytwórca Authorised Representative Autoryzowany przedstawiciel Batch code Kod partii Expiry date YYYY/MM/DD U y przed RRRR/MM/DD Storage temperature limitation Przestrzega zakresu temperatur Consult Instruction for use Sprawd w instrukcji obsługi Bio-Rad 3, Bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tél. : 33 (0) Fax.: 33 (0) /2009 kod: