UNIWERSYTET GDAŃSKI Pracownia studencka Katedry Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 4 Oznaczanie zawartości związków fenolowych w materiale roślinnym metodą spektrofotometryczną LABORATORIUM PRZYRODNICZE Gdańsk, 2011 1
I. Wprowadzenie 1. Stres oksydacyjny w komórce i jego skutki Gdy odkryto w zdrowych organizmach wolne rodniki tlenowe, które powodują uszkodzenia komórek, zwłaszcza jądra i mitochondriów, okazało się, że tlen, pierwiastek niezbędny do życia, może być toksyczny. Wolne rodniki są to atomy lub cząsteczki mające na ostatniej powłoce (orbitalu walencyjnym) niesparowany elektron, co sprawia, że są niestabilne i bardzo reaktywne, zdolne do reakcji z różnorodnymi składnikami komórki. Reaktywne formy tlenu (RFT lub ang. ROS reactive oxygen species) powstają jako uboczne i niepożądane produkty reakcji oksydacyjno-redukcyjnych zachodzących w procesie zwanym łańcuchem transportu elektronów czyli w łańcuchu oddechowym, dostarczającym organizmowi niezbędnej energii. Powstają podczas procesu autooksydacji wielu związków, zwłaszcza lipidów, podczas licznych reakcji enzymatycznych a także w czasie procesów fagocytozy. Najważniejszymi reaktywnymi formami tlenu są: tlen cząsteczkowy (słabo reaktywny, zwiększający swą reaktywność pod wpływem jonów żelaza i miedzi); tlen singletowy (1O2); anionorodnik ponadtlenkowy (O2.- ), powstający w wyniku przeniesienia elektronu na tlen cząsteczkowy; nadtlenek wodoru (H2O2), powstający w wyniku redukcji tlenu cząsteczkowego; rodnik hydroksylowy (HO ); tlenek azotu (NO ); anion kwasu nadtlenoazotawego (ONOO-); rodniki alkoksylowe (RO, ROO ). W warunkach homeostazy zachowana jest równowaga między szybkością wytwarzania i rozpadu RFT. Równowagę tę zapewniają systemy antyoksydacyjne wewnątrz i zewnątrzkomórkowe, chroniące komórkę przed szkodliwymi formami tlenu. W skład systemów antyoksydacyjnych wchodzą substancje zwane antyoksydantami (przeciwutleniaczami). Są to substancje, które w niskich stężeniach w porównaniu do utlenianego substratu, opóźniają lub hamują jego utlenianie. Działanie antyoksydantów może być: o prewencyjne, polegające na powstrzymywaniu tworzenia RFT, a w szczególności powstawania najbardziej reaktywnego rodnika wodorotlenowego. Prewencyjnie działają dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza, peroksydaza glutationowa, albuminy, transferryna, laktoferryna, ceruloplazmina, haptoglobina i hemopeksyna; o interwencyjne, polegające na przerywaniu reakcji wolnorodnikowych lub ukierunkowanie terminacji poprzez wchodzenie w reakcje z RFT. Do przeciwutleniaczy interwencyjnych należą glutation, askorbinian, kwas moczowy, kreatynina, bilirubina, tokoferole, karotenoidy, ubihydrochinon-koenzym Q, pochodne estronu i estradiolu; o reparacyjne, polegające na usuwaniu skutków reakcji RFT z DNA i białkami. Reperacyjne działanie wykazują ligazy, glikolazy, tioredoksyna i proteazy. 2
Zaburzenia prawidłowego przebiegu procesów redukcyjno-oksydacyjnych komórki prowadzą do zwiększonego wytwarzania RFT. Sytuacja taka może być powodowana różnymi zjawiskami patologicznymi, jak niedotlenienie, wirusowe czy bakteryjne stany zapalne, hiperglikemia i inne. Reaktywne formy tlenu powstają również pod wpływem zewnętrznych czynników, takich jak promieniowanie jonizujące, ultradźwięki, promieniowanie ultrafioletowe, oddziaływanie ksenobiotyków, podwyższona temperatura, zanieczyszczenia śladami metali (szczególnie żelazem i miedzią), barwniki naturalne (chlorofil, mioglobina, hemoglobina), produkty utleniania innych związków (zwłaszcza nadtlenki i inne rodniki). Nasilenie szybkości wytwarzania RFT lub/i upośledzenie mechanizmów antyoksydacyjnych prowadzą do tzw. stresu oksydacyjnego. Stres oksydacyjny definiuje się jako zaburzenie równowagi prooksydacyjnoantyoksydacyjnej w kierunku reakcji utleniania. Najistotniejsze zaburzenia w komórce to peroksydacja lipidów wchodzących w skład fosfolipidów błon komórkowych i mitochondrialnych, prowadząca do powstawania uszkodzonych cząstek lipidów oraz końcowych produktów utleniania aldehydów. Aldehydy powodują zaburzenie struktury błony komórkowej, jej depolaryzację, utratę integralności oraz rozprzężenie fosforylacji oksydacyjnej w mitochondriach, co prowadzi do śmierci komórki. Poza tym aldehydy hamują działanie wielu enzymów, co prowadzi do hamowania replikacji DNA, transkrypcji, pękania nici DNA i również śmierci komórki. Stres oksydacyjny jest istotnym czynnikiem etiopatologicznym procesu starzenia oraz wielu chorób ogólnoustrojowych. Do najważniejszych należą: miażdżyca naczyń i jej powikłania, cukrzyca, choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, stwardnienie rozsiane, schizofrenia, nowotwory, reumatoidalne zapalenie stawów, astma, choroba popromienna, porfirie, zapalenie kłębuszków nerkowych, zapalenie naczyń krwionośnych, AIDS, choroba wrzodowa, choroba alkoholowa i inne. Organizm ludzki jest narażony na wiele czynników indukujących stres oksydacyjny. Nieodpowiednia dieta, niewłaściwe przyrządzanie i przechowywanie żywności, zanieczyszczenie środowiska to powody dostarczania organizmowi wielu ksenobiotyków i wolnych rodników. Wszechobecna mechanizacja i technika sprawia, że źródeł wolnych rodników przybywa. Mogą one powstać podczas wielu chemicznych procesów, np. przy wytwarzaniu powszechnie stosowanych mas plastycznych, wskutek reakcji tlenu z paliwem napędowym podczas pracy silników, w czasie tworzenia smogu. Coraz częściej też jesteśmy narażeni na działanie takich szkodliwych czynników jak promieniowanie jonizujące, ultradźwięki, promieniowanie ultrafioletowe. 3
2. Naturalne antyoksydanty polifenolowe 2.1. Właściwości antyoksydacyjne związków fenolowych Antyoksydacyjne właściwości posiadają związki zawierające grupę -OH, która redukuje wolne rodniki. Związki fenolowe (grupa hydroksylowa związana z pierścieniem aromatycznym o właściwościach kwasowych) wykazują szczególne właściwości antyoksydacyjne: łatwo wychwytują rodnik a powstały wolny rodnik fenolowy jest na tyle stabilny (delokalizacja rodnika na skutek rezonansu), że nie jest w stanie oderwać atomu wodoru z cząsteczki kwasu tłuszczowego. C6H5-OH + R C6H5O + RH Polifenole są związkami organicznymi zawierającymi przynajmniej dwie grupy hydroksylowe przyłączone do pierścienia aromatycznego. Są grupą związków o bardzo zróżnicowanej budowie i właściwościach. Działanie przeciwutleniające związków fenolowych zachodzi wg różnorodnych mechanizmów: o mogą oddawać elektron lub atom wodoru (wł. redukujące), o mogą stabilizować i delokalizować niesparowany elektron, o mogą chelatować jony metali enzymów katalizujących reakcje utleniania, o mogą być inhibitorem oksydaz, o mogą być terminatorem przerywającym łańcuchowe reakcje rodnikowe, o mogą być stabilizatorem wolnych rodników, powstających w reakcjach oksydacyjnych. Wynikające z mechanizmów działania właściwości antyoksydacyjne związków fenolowych polegają na: o eliminowaniu reaktywnych form tlenu przez bezpośrednią reakcję z wolnymi rodnikami, przez blokowanie (zmiatanie) wolnych rodników (najczęściej nadtlenkowych, hydroksylowych i hydroksynadtlenkowych), przez nasilenie dysmutacji wolnych rodników do związków o znacznie mniejszej reaktywności, o hamowaniu lub wzmacnianiu działania wielu enzymów, np. inhibicji enzymów z grupy oksydaz, podnoszenie ekspresji antyoksydacyjnych białek, takich jak katalazy (CAT) i dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), o chelatowaniu jonów metali prooksydacyjnych (np. żelaza, miedzi), o wzmacnianiu działania innych antyoksydantów np. przywracają z rodnikowej pierwotną postać tokoferoli, przedłużają działanie kwasu askorbinowego. 4
2.2. Właściwości biologiczne naturalnych związków fenolowych. Działanie związków fenolowych sprawia, że pełnią one funkcje biologiczne i mają pozytywny wpływ na ludzkie zdrowie. Wśród właściwości leczniczych poszczególnych polifenoli wymienia się kilka głównych, które zostały udowodnione w różnych badaniach na zwierzętach i w badaniach statystycznych: 1. Ochrona organizmu przed kancerogenami, mutagenami i chorobami nowotworowymi, udział w leczeniu raka. 2. Zapobieganie schorzeniom układu sercowo-naczyniowego, w tym hamowanie procesu prowadzącego do miażdżycy. 3. Zapobieganie i leczenie infekcji, alergii i chorób przewodu pokarmowego. 4. Pobudzanie wydzielania estrogenów w organizmie kobiety. 2.3. Występowanie naturalnych polifenoli Naturalne antyoksydanty polifenolowe to związki o różnej strukturze i właściwościach (Rys. 1). Produkowane są przez niektóre rośliny w odpowiedzi na stres, uszkodzenie, infekcję grzybową lub promieniowanie ultrafioletowe(uv). Na te związki, w technologii żywności, zwraca się w ostatnich latach szczególną uwagę. Występują powszechnie w roślinach, zwłaszcza w liściach, tkankach kwiatowych i zdrewniałych częściach, jak łodygi i kora, w mniejszym stężeniu w owocach, nasionach. Do roślinnych związków fenolowych należą: flawonoidy, taniny (skondensowane i łatwo hydrolizujące), kwasy fenolowe, stilbenoidy (np. resweratrol), lignany, ligniny i inne. Jednym ze źródeł kwasów fenolowych są ziarniaki zbóż. Na przykład, w ziarnie jęczmienia jest ok.0,5 g/kg kwasu ferulowego, ok. 100 mg/kg kwasu wanilinowego, ok. 30 mg/kg kwasu p-kumarowego i ok.20 mg/kg kwasu kawowego W winogronach występują trzy grupy flawonoidów (czerwone antocyjaniny, flawonole, flawan-3-ole), oligomeryczne proantocyjanidyny i polimeryczne skondensowane taniny, kwasy fenolowe (galusowy, hydroksycynamonowy, hydroksybenzoesowy) i stilbenoidy. Stilbenoidów w winorośli jest mniej niż innych związków fenolowych jak np. flawonoidów. Podobnie jak ciemne owoce, ciemne warzywa, takie jak czerwona kapusta, czerwona cebula, czarna fasola, bakłażan są również dobrym źródłem antocyjanów, stilbenoidów i innych związków fenolowych. Związki fenolowe we wszystkich warzywach występują w naziemnych częściach roślin, jedynym wyjątkiem jest cebula, która w części podziemnej zawiera duże ilości polifenoli, głównie kwercetyny. 5
resweratrol kwercetyna Rys. 1. Struktury chemiczne wybranych związków fenolowych 2.4. Oznaczanie całkowitej zawartości związków fenolowych metodą Folina-Ciocalteau (F-C) Oznaczanie całkowitej zawartości związków fenolowych przeprowadza się metodami kolorymetrycznymi, z których najczęściej stosowaną jest metoda Folina-Ciocalteau (F-C). Podstawą oznaczania jest odwracalna reakcja redukcji przez fenole w środowisku alkalicznym molibdenu(vi) do molibdenu(v) zawartego w odczynniku Folina-Ciocalteau (F-C). W wyniku reakcji powstaje niebieski związek, który wykazuje maksimum absorpcji przy długości fali 745-750 nm. Intensywność absorpcji przy tej długości fali jest proporcjonalna do stężenia fenoli. Odczynnik F-C przygotowuje się z mieszaniny wolframianu sodu (Na 2 WO 4 ), molibdenianu sodu (Na 2 MoO 4 ), siarczanu litu (Li 2 SO 4 ), wody bromowej i stężonych kwasów solnego i fosforowego. Struktura powstającego związku nie jest znana, przypuszcza się, że powstaje heteropolifosfowolframian molibdenu. Na 2 WO 4 /Na 2 MoO 4 + fenol (fenol-mow 11 O 40 ) -4 Mo(VI) (żółty) + ē Mo(V) (niebieski) Mechanizm reakcji polega na przenoszeniu elektronu. Do reakcji potrzebne jest alkaliczne środowisko (ph 10), w którym powstaje anion fenolanowy redukujący molibden. Niebieski barwnik powstaje w reakcji odczynnika F-C z fenolami niezależnie od ich struktury.w 1965 r Singleton i Rossi zmodyfikowali tę metodę, stosując mieszaninę tlenków tungstenu i molibdenu: 3H 2 O - P 2 O 5-13WO 3-5MoO 3-10H 2 O i 3H 2 O - P 2 O 5-14WO 3-4MoO 3-10H 2 O 6
Mieszanina tlenków utlenia fenole bardziej specyficznie, dając produkt reakcji wykazujący maksimum absorpcji przy λmax 765 nm. Interferencje w tej metodzie mogą powodować różne, niefenolowe związki, jak cukry redukujące, aromatyczne aminy, ditlenek siarki, kwas askorbinowy, sorbowy, Fe(II) i inne i powinny być brane pod uwagę, ewentualnie usuwane wcześniej z badanej próbki. Dla uzyskania wiarygodności wyników pomiarów należy zachować następujące warunki, które są krytyczne w tej metodzie: 1. Należy zachować odpowiedni stosunek ilościowy zasady do odczynnika F - C. 2. Zoptymalizować czas i temperaturę reakcji dla uzyskania właściwej barwy i trwałości produktu. 3. Mierzyć absorbancję przy długości fali 765 nm. 4. Używać kwasu galusowego jako fenolowego standardowego odniesienia. Dla uzyskania środowiska alkalicznego stosuje się nasycony roztwór bezwodnego węglanu sodu. Próbkę o odpowiednim rozcieńczeniu miesza się z odczynnikiem F - C i po 30s, ale przed upływem 8 min, dodaje się nasyconego roztworu Na 2 CO 3. Próbkę inkubuje się w temperaturze 40ºC przez 30 min, po czym wykonuje pomiar absorbancji. Przy temperaturze pokojowej, czas inkubacji wydłuża się do 2 godzin. Zalecana proporcja objętości nasyconego roztworu Na 2 CO 3 i odczynnika F-C wynosi 3:1. Kwas galusowy jest rekomendowany jako standard z wielu powodów. Stosowanie go jako pojedynczego standardu ułatwia porównywanie danych. Otrzymanie kwasu galusowego w postaci czystej nie jest drogie a przechowywany jako substancja sucha jest trwały. W roztworze alkoholowo-wodnym przechowywany w lodówce jest trwały przez 2 tygodnie. Metoda Folina- Ciocalteau jest stosowana w analizie ekstraktów roślinnych, żywności, również leków zawierających grupy fenolowe, jak salbutamol czy morfina. 3. Spektrofotometria UV/Vis 3.1. Wprowadzenie W metodach spektroskopowych sygnał analityczny powstaje w wyniku oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego lub korpuskularnego na badana próbkę. Promieniowanie elektromagnetyczne zachodzi wskutek okresowych zmian pola elektromagnetycznego rozchodzących się w przestrzeni ze skończoną prędkością i związanych z przenoszeniem energii. Promieniowanie elektromagnetyczne składa się z fotonów, czyli kwantów promieniowania (kwantów energii). Charakterystyczną ich własnością jest energia: gdzie: E - energia fotonu wyrażona w jednostkach energii (zgodnie z układem SI w dżulach, poprzednio w ergach lub w kaloriach: 1J = 107 erg = 0,2389 cal); 7
h - stała uniwersalna Plancka - 6,626.10-34 J.s (6,626.10-27erg.s, 1,583.10-34 cal.s); γ - częstotliwość drgań promieniowania emitowanego lub absorbowanego, wyrażona w hercach (Hz). Promieniowanie elektromagnetyczne określa się także przy pomocy długości fali gdzie: c - prędkość światła w próżni (3.108 m/s). Wzory przedstawione powyżej można przekształcić: Spektroskopia molekularna (cząsteczkowa) obejmuje badanie widm cząsteczkowych. W ogólnym pojęciu widma cząsteczkowego są zawarte trzy rodzaje widm promieniowania elektromagnetycznego: widmo rotacyjne, widmo oscylacyjno-rotacyjne oraz elektronowooscylacyjno-rotacyjne danej cząsteczki. Całkowitą energię cząsteczki E można zatem przedstawić jako sumę trzech składników odpowiadających trzem rodzajom ruchu w cząsteczce: E = Ee + Eos + Erot gdzie: Ee - energia elektronowa (związana z ruchem elektronów), Eos - energia oscylacyjna (związana z ruchem oscylacyjnym), Erot - energia rotacyjna (związana z ruchem rotacyjnym). Energia elektronowa w cząsteczce (wartość podobna jak w atomie) jest wielokrotnie większa od energii oscylacyjnej, a ta z kolei jest większa od energii rotacyjnej. Różnice pomiędzy poziomami elektronowymi wynoszą kilka elektronowoltów, pomiędzy poziomami oscylacyjnymi dziesiąte i setne części ev, a pomiędzy poziomami rotacyjnymi tysięczne części ev. Stosunek wartości poszczególnych rodzajów energii jest w przybliżeniu następujący: Ee : Eos : Erot = 1000 : 10 : 1 Znaczne różnice wartości poszczególnych rodzajów energii powodują, że odpowiednie widma pojawiają się w różnych zakresach spektralnych. Pochłonięcie kwantów promieniowania z zakresu dalekiej podczerwieni jako najmniej energetycznego może powodować tylko zmiany energii rotacji; powstaje wtedy widmo rotacyjne. Zaabsorbowana energia nie wystarcza do zmiany energii oscylacji i energii elektronowej. Promieniowanie z zakresu bliskiej podczerwieni, o większej energii, powoduje przejścia pomiędzy poziomami oscylacyjnymi. Ponieważ zmianom 8
energii oscylacyjnej towarzyszą zmiany energii rotacyjnej, powstają widma oscylacyjno-rotacyjne. Zmiany energii elektronowej może wywołać tylko zaabsorbowanie promieniowania z zakresu widzialnego i nadfioletu. Ponieważ zmianom tej energii towarzyszą zazwyczaj zmiany energii oscylacyjnej i rotacyjnej, powstaje widmo elektronowo-oscylacyjno-rotacyjne (Rys. 2). Rys. 2. Schemat przejść elektronowych, oscylacyjnych i rotacyjnych w cząsteczce dwuatomowej. E - poziomy elektronowe, v- poziomy oscylacyjne, I - poziomy rotacyjne, a - przejścia elektronowe, b - przejścia oscylacyjne, c - przejścia rotacyjne 3.2. Prawa absorpcji Promieniowanie elektromagnetyczne, przechodząc przez roztwór, może ulegać: absorpcji, odbiciu i rozproszeniu. Natężenie wiązki padającej wyraża się wzorem: Io = Ia + It + Ir gdzie: Ia - natężenie promieniowania zaabsorbowanego przez roztwór, It - natężenie promieniowania przechodzącego przez roztwór, Ir -natężenie promieniowania odbitego i rozproszonego. Ponieważ pomiary absorpcji promieniowania wykonuje się najczęściej w stosunku do roztworu porównawczego (odnośnika), którego skład powinien być zbliżony do składu próbki i który znajduje się w identycznych kuwetach, promieniowanie odbite i rozproszone (Ir) w obu przypadkach jest jednakowe i może być pominięte. Roztwór odnośnika w warunkach pomiaru nie absorbuje promieniowania, gdyż nie zawiera substancji oznaczanej i można przyjąć, że natężenie wiązki promieniowania przechodzącej przez roztwór odnośnika jest równe natężeniu wiązki padającej na roztwór badanej próbki. Stosunek natężenia promieniowania przechodzącego przez próbkę (It) do natężenia promieniowania padającego na próbkę (Ia) (równego natężeniu promieniowania przechodzącego przez odnośnik), nazywamy transmitancją lub przepuszczalnością i oznaczamy 9
Transmitancję najczęściej wyrażamy w procentach Może ona przybierać wartości od 0% do 100%. Natężenie promieniowania zaabsorbowanego zależy od stężenia roztworu i od grubości warstwy absorbującej. Matematycznie zależność tę opisuje prawo Lamberta-Beera, które w postaci logarytmicznej przyjmuje postać Logarytm dziesiętny stosunku natężenia wiązki promieniowania padającego na badaną próbkę (Io) do natężenia wiązki promieniowania przechodzącego przez badaną próbkę (It) nazywany jest absorbancją. Przyjmuje ona wartości z przedziału od 0 do nieskończoności. Gdy stężenie roztworu jest wyrażone w mol/l, a grubość warstwy jest wyrażona w cm, współczynnik proporcjonalności k nosi nazwę molowego współczynnika absorpcji (e). Wzór przyjmuje wówczas postać: Jest to podstawowe prawo spektrofotometrii absorpcyjnej. Zależność między absorbancją a transmitancją wyraża zależność: lub gdy transmitancja jest wyrażona w procentach Zależność odwrotną tj. transmitancji od absorbancji wyraża wzór Jeżeli w badanym roztworze znajduje się kilka składników, oznaczanie spektrofotometryczne można wykonać poprawnie tylko wtedy, gdy spełnione jest prawo addytywności absorbancji, wg którego absorbancja mieszaniny jest równa sumie absorbancji poszczególnych składników, a absorbancja pojedynczego składnika jest taka, jakby tylko on jeden znajdował się w badanej próbce. Matematycznie prawo to określają następujące wzory: 10
gdzie: A - absorbancja mieszaniny, A1, A 2, An - absorbancje poszczególnych składników, c1, c2, cn - stężenia molowe poszczególnych składników, ε1, ε2, εn - molowe współczynniki absorpcji poszczególnych składników. 3.3. Aparatura Do pomiarów absorpcji służą spektrofotometry. Na Rys. 3 przedstawiono blokowy schemat spektrofotometru. Rys. 3. Blokowy schemat spektrofotometru optycznego: Z - źródło promieniowania ciągłego, M -monochromator, K - kuweta z badanym roztworem, Ko - kuweta z rozpuszczalnikiem (odnośnik), D układ detektora, R - rejestrator, P- synchroniczny przesuw taśmy rejestratora i bębna monochromatora Źródło Z wysyła ciągłe promieniowanie elektromagnetyczne. Wyodrębniona przez monochromator M monochromatyczna wiązka promieniowania przechodzi na przemian przez kuwetę K z badaną substancją i przez identyczną kuwetę porównawcza Ko (z odnośnikiem). Kuweta Ko w przypadku pomiarów absorpcji roztworów jest wypełniona ta samą cieczą, w której rozpuszczono substancję badaną. W niektórych przyrządach (tzw. spektrofotometry dwuwiązkowe) promieniowanie wychodzące z monochromatora jest dzielone na dwie wiązki o jednakowym natężeniu, z których jedna przechodzi przez K a druga, jednocześnie, przez Ko. W obu przypadkach, w układzie detektora D, następuje pomiar natężenia wiązki, która przeszła przez kuwetę K (Ip) i przechodzącej prze kuwetę Ko (Io). Rejestrator R kreśli widmo absorpcyjne badanej substancji w postaci krzywej A = f(λ). Czułość metody definiuje się jako najmniejsze oznaczalne stężenie substancji lub najmniejsza różnica w stężeniach substancji, którą można oznaczyć za pomocą danej metody. Dla metod spektrofotometrycznych obiektywnym, liczbowym wyrażeniem czułości jest molowy współczynnik absorpcji (ε). Molowy współczynnik absorpcji nie może przekroczyć wartości 1,5.10 5 (ta wartość wynika z teorii). Najmniejsze stężenie substancji (mol/l) oznaczalne spektrofotometrycznie można obliczyć ze wzoru Lamberta-Beera. Przy założeniu, że A = 0,02 11
(minimalna absorbancja, którą można zmierzyć), l = 2 cm (grubość kuwety), ε = 104 (molowy współczynnik absorpcji średnio czułej metody spektrofotometrycznej). Jeśli przyjąć masę molową substancji jako przykładowo równą 200 g/mol to minimalne oznaczalne stężenie tej substancji (dla średnio czułej metody, ε = 104, i klasycznego spektrofotometru) wyniesie: 3.4. Metoda krzywej kalibracyjnej W przeważającej części metod detekcji mierzony parametr jest funkcją liniową stężenia analitu: Y = ac + b gdzie: Y - wielkość mierzona, c stężenie analitu, a współczynnik proporcjonalności, a = BC/AB = tg α, b wartość stała, jest często wartością eksperymentalną ślepej próby, którą można przedstawić graficznie (Rys. 4a) Rys. 4a. Krzywa kalibracyjna Y = ac + b Współczynnik proporcjonalności a określa czułość metody; im większe zmiany wartości mierzonej Y na jednostkę stężenia c, tym większa jego wartość i tym wyższa czułość metody. Metody o małym kącie nachylenia krzywych kalibracyjnych nie są przydatne do celów analitycznych. Parametr b może przyjmować wartości dodatnie, ujemne lub zero. W metodzie krzywej kalibracyjnej przygotowuje się szereg roztworów o znanych stężeniach substancji analizowanych oraz tzw. ślepą próbę roztwór, w którym są wszystkie składniki roztworów wzorcowych z wyjątkiem analitu i dla każdego roztworu mierzy się wartość Y. Zależność Y od c wzorców wykreśla się (Rys. 4b) lub wylicza równanie prostej. Wartość Y mierzy się również dla próbki badanej, nanosi na krzywą kalibracyjną i odczytuje stężenie lub oblicza z równania prostej. 12
Rys. 4b. Krzywa kalibracyjna Y = a c II. Wykonanie ćwiczenia 1. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodami izolacji związków wrażliwych na działanie temperatury, tlenu i promieniowania UV, jakimi są polifenole; oznaczania całkowitej zawartości związków fenolowych w surowcach i produktach roślinnych metodami spektroskopowymi. Wykonanie ćwiczenia polega na ekstrakcji rozpuszczalnikowej (wspomaganej ultradźwiękami) związków fenolowych z czterech surowców roślinnych: kasza gryczana, wytłoki z winogron czerwonych, czerwona kapusta (świeża), czerwona cebula (świeża). W otrzymanych ekstraktach należy oznaczyć sumaryczną zawartość związków fenolowych metodą spektrofotometryczną z odczynnikiem Folina-Ciocalteu'a (F-C). Wynik oznaczeń ilościowych należy przedstawić w przeliczeniu na zawartość kwasu galusowego na masę surowca (mg/g). W tym celu należy przeprowadzić reakcję kwasu galusowego (roztwory kalibracyjne o różnych stężeniach) z odczynnikiem F-C i wykonać krzywą kalibracyjną. 1.1. Odczynniki 1. Nasycony roztwór węglanu sodu Na 2 CO 3 (studenci otrzymują gotowy) 200 g Na 2 CO 3 rozpuścić w 800 ml wody i podgrzać do wrzenia. Po wystudzeniu dodać kilka kryształków węglanu sodu i po 24 godz. przesączyć do kolby miarowej i uzupełnić wodą do 1 l. 2. Odczynnik Folina-Ciocalteu'a. 3. Kwas galusowy. 4. Alkohol etylowy 96%. 5. Alkohol metylowy destylowany. 6. Kwas octowy. 7. Woda destylowana. 13
1.2. Ekstrakcja W czasie ekstrakcji i innych etapów izolacji polifenoli należy chronić próbkę przed działaniem światła i tlenu. Naczynia należy osłaniać folią aluminiową, jeśli to możliwe, czynności wykonywać bez dostępu światła. Ekstrakcję i hydrolizę wykonywać w atmosferze gazu obojętnego, np. azotu. Przechowywać ekstrakty w ciemności, najlepiej w temperaturze -20ºC. Ekstrakcja kaszy gryczanej Około 100 mg rozdrobnionej (na mąkę) kaszy gryczanej odważyć z dokładnością do 0,5 mg do naczynka zakręcanego o pojemności 4 ml, dodać 1 ml 1% roztworu kwasu octowego w metanolu, przestrzeń nad cieczą przedmuchać azotem i zamknąć naczynko. Zawinąć naczynko folią aluminiową i wstawić do łaźni lodowo-wodnej. Całość umieścić w łaźni ultradźwiękowej i ekstrahować przez 3 min. Po 3 min sprawdzić, czy w łaźni znajduje się lód, jeśli brak, uzupełnić i ekstrahować następne 3 min. Próbkę z ekstraktem pozostawić do dekantacji w ciemności. Ekstrakcja skórek i nasion winogron czerwonych Skórki i nasiona owoców czerwonych winogron oddzielono w sokowirówce a następnie zliofilizowano, zabezpieczając przed światłem. Do czasu analizy przechowywano w temperaturze -20ºC. Około 20 mg rozdrobnionego liofilizatu odważyć z dokładnością do 0,5 mg w naczynku zakręcanym o pojemności 4 ml, dodać 1 ml 1% roztworu kwasu octowego w metanolu, przestrzeń nad cieczą przedmuchać azotem i zamknąć naczynko. Zawinąć naczynko folią aluminiową i wstawić do łaźni lodowo-wodnej. Całość umieścić w łaźni ultradźwiękowej i ekstrahować przez 3 min. Po 3 min sprawdzić, czy w łaźni znajduje się lód, jeśli brak, uzupełnić i ekstrahować następne 3 min. Próbkę z ekstraktem pozostawić do dekantacji w ciemności. Ekstrakcja czerwonej kapusty i czerwonej cebuli Około 100 mg rozdrobnionej (posiekanej lub rozgniecionej) czerwonej cebuli (kapusty) odważyć z dokładnością do 0,5 mg w naczynku zakręcanym, dodać 1 ml metanolu zawierającego 1% kwasu octowego, usunąć powietrze z naczynka azotem i zamknąć. Zawinąć naczynko folią aluminiową i wstawić do łaźni lodowo-wodnej. Całość umieścić w łaźni ultradźwiękowej i ekstrahować przez 3 min. Po 3 min sprawdzić, czy w łaźni znajduje się lód, jeśli brak, uzupełnić i ekstrahować następne 3 min. Próbkę z ekstraktem pozostawić do dekantacji w ciemności. Szkło i sprzęt laboratoryjny do p.1.2: 4 naczynka zakręcane o pojemności 4 ml, moździerz porcelanowy, łopatka dentystyczna, pipety miarowe o pojemności 0,1 ml; 1 ml, folia aluminiowa, 14
naczynie na łaźnię lodowo-wodną. 1.3. Oznaczanie całkowitej zawartości fenoli metodą Folina-Ciocalteu'a (F-C) Ekstrakty z badanych surowców po zdekantowaniu nadają się do oznaczania fenoli. Wykonanie krzywej kalibracyjnej dla roztworu wzorca - kwasu galusowego a) Przygotowanie wzorcowego roztworu kwasu galusowego: 5 mg kwasu galusowego odważyć w naczynku zakręcanym, rozpuścić w 100 µl etanolu, następnie dodać 900 µl wody, wymieszać i zamknąć. Szkło i sprzęt laboratoryjny do p. 1.3.a: 1 naczynko zakręcane o poj. 4 ml, łopatka dentystyczna, pipeta miarowa o poj. 0,1 ml, pipeta miarowa o poj.1 ml. b) Przygotowanie odpowiednich rozcieńczeń roztworu kwasu galusowego, dla uzyskania roztworów kalibracyjnych o stężeniach: 0; 0,05; 0,15; 0,25; 0,35 i 0,50 mg/ml. W tym celu do naczynek o poj. 4 ml umieścić odpowiednie objętości roztworu wzorcowego kwasu galusowego a następnie dodać tyle destylowanej wody, by całkowita objętość każdego roztworu kalibracyjnego roztworu wynosiła 1 ml. c) Do osobnych naczynek (o poj. 4 ml) pobrać po 20 µl z każdego roztworu kalibracyjnego, dodać po 1,58 ml wody, następnie po 100 µl odczynnika Folina- Ciocalteu'a, dobrze wymieszać i pozostawić na czas min 0,5 min do maks. 8,0 min, następnie dodać po 300 µl nasyconego roztworu węglanu sodu, wymieszać i wstawić do termostatu ustawionego na 40ºC na 30 min (do uzyskania trwałego, charakterystycznego, niebieskiego koloru). Mierzyć absorbancję przy 765 i 735 nm wobec ślepej próby (0 µl roztworu kwasu galusowego). Szkło i sprzęt laboratoryjny do p. 1.3.b i 1.3.c: 12 naczynek zakręcanych o poj. 4 ml, pipeta miarowa o poj. 0,1 ml, pipeta miarowa o poj.1 ml, pipeta miarowa o poj.2 ml. d) Pomiar absorbancji badanych ekstraktów Do osobnych naczynek (o poj. 4 ml) pobrać po 20 µl z roztworu każdego badanego ekstraktu, dodać po 1,58 ml destylowanej wody, następnie po 100 µl odczynnika Folina - Ciocalteu'a, dobrze wymieszać i pozostawić na 0,5 do 8,0 min, następnie dodać po 300 µl roztworu węglanu sodu i 15
wstawić do termostatu, ustawionego na 40ºC na 30 min (do uzyskania trwałego, charakterystycznego niebieskiego koloru). Mierzyć absorbancję przy 765 i 735 nm. Szkło i sprzęt laboratoryjny do 1.3.d: 4 naczynka zakręcane o poj.4 ml, pipeta miarowa o poj. 0,1 ml, pipeta miarowa o poj.1 ml, pipeta miarowa o poj.2 ml. 2. Wykreślić krzywą kalibracyjną A = f(c kwasu galusowego[mg/ml] ) 3. Odczytać z krzywej kalibracyjnej stężenie kwasu galusowego odpowiadające absorbancji badanej próbki i obliczyć całkowitą zawartość polifenoli w mg/g próbki w przeliczeniu na kwas galusowy. 4. Porównać ilości polifenoli w badanych surowcach z danymi opublikowanymi, np. w internecie, i przeprowadzić dyskusję na temat możliwości przeciwutleniających badanych próbek. 5. Sprawozdanie z wykonanego ćwiczenia powinno obejmować: - 0,5 stronicowy wstęp teoretyczny obejmujący zagadnienia wyszczególnione w wymaganiach, - schemat wykonania ćwiczenia, - uzyskane wyniki wg punktów 2, 3 i 4. 16