IV. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI KWAŚNEJ FOSFATAZY W HOMOGENACIE Z KIEŁKÓW ROŚLINNYCH I. WSTĘP Enzymy są to katalizatory, które zwiększają szybkośd reakcji chemicznej, same nie ulegając zmianie. Przy braku enzymów większośd reakcji w układach biologicznych zachodzi tak wolno, że są one niezauważalne. Enzymy zwiększają szybkośd reakcji nawet 10 7 razy. Enzymy są wysoce specyficzne względem substratów, na które działają i produktów, które tworzą. Jeden enzym katalizuje na ogół pojedynczą reakcję chemiczną lub zestaw ściśle pokrewnych reakcji. W wyniku reakcji katalizowanych przez enzymy rzadko występują reakcje uboczne, prowadzące do nieekonomicznego tworzenia zbędnych produktów. Aktywnośd enzymatyczna może byd regulowana, zmieniając się w zależności od stężenia substratów, produktów, inhibitorów, kofaktorów itp. Niemal wszystkie enzymy, za wyjątkiem rybozymów (cząsteczki RNA o właściwościach katalitycznych), są białkami. Mogą mied budowę monomeryczną tzn. posiadają jeden łaocuch polipeptydowy lub oligomeryczną są zbudowane z dwóch lub więcej podjednostek będących odrębnymi łaocuchami białkowymi. W wielu przypadkach poza częścią białkową posiadają dodatkowo części nie będące białkami. Takie enzymy o złożonej budowie noszą nazwę holoenzymów (rys. 1). Ich częśd białkowa to apoenzym, natomiast częśd niebiałkowa to kofaktor, który może byd jonem metalu lub małą cząsteczką organiczną (koenzymem). Rys. 1. Aktywny katalitycznie enzym, zwany holoenzymem, zbudowany jest z części białkowej (aponenzym) i kofaktora, którym może byd metal, bądź jon metalu lub koenzym. W zależności od stopnia związania koenzymu z enzymem, wyróżniamy kosubstraty i grupy prostetyczne (podział wg Berg, Tymoczko, Stryer. Biochemia. 2005)
W zależności od sposobu związania z białkiem enzymu, koenzymy możemy podzielid na grupy prostetyczne lub kosubstraty. Grupa prostetyczna jest ściśle związana z białkiem enzymu (np. układy hemowe, stanowiące centrum katalityczne enzymów oksydacyjno-redukcyjnych), natomiast kosubstrat może występowad samodzielnie i łączy się z apoenzymem w trakcie katalizowanej reakcji (np. witaminy i ich pochodne, pochodne nukleotydów). Żadna z części składowych enzymu złożonego nie wykazuje aktywności oddzielnie. Zadaniem kofaktorów jest bezpośrednie oddziaływanie z substratem lub udział we właściwym usytuowaniu substratu w centrum aktywnym, co jest niezbędne do zajścia reakcji enzymatycznej. Niektóre enzymy, katalizujące sprzężone ze sobą reakcje chemiczne, występują w organizmach w formie kompleksów wieloenzymowych KLASYFIKACJA ENZYMÓW W celu ujednolicenia klasyfikacji enzymów, powołana w 1964 roku Komisja Enzymowa (ang. Enzyme Commission) wprowadziła system nazewnictwa enzymów, który dzieli wszystkie enzymy na sześd głównych klas (1 6, tab. 1), opierając się na typie katalizowanych reakcji. Tab. 1. Międzynarodowa klasyfikacja enzymów Klasa Nazwa Typ katalizowanej reakcji Przykład 1 Oksydoreduktazy Utlenianie-redukcja (przenoszenie elektronów) A - + B A + B - Dehydrogenaza mleczanowa Dehydrogenaza alkoholowa 2 Transferazy Przenoszenie grup funkcyjnych A B + C A + B C Kinaza nukleozydomonofosforanowa (kinaza NMP) Heksokinaza 3 Hydrolazy Reakcje hydrolizy (przenoszenie grup funkcyjnych na cząsteczki wody) A B + H 2 O A H + B OH Chymotrypsyna Trypsyna 4 Liazy Utworzenie wiązao podwójnych poprzez dodanie lub usunięcie grup A B A=B + X Y vvvvvvvvvvvv X Y vvvvvvvvvv Fumaraza Dehydrogenaza pirogronianowa 5 Izomerazy Izomeryzacja (przenoszenie grup w obrębie cząsteczki) A B A B vvv X Y Y X Izomeraza triozofosforanowa Izomeraza maleinianowa 6 Ligazy (Syntetazy) Ligacja (połączenie) dwóch substratów (tworzenie wiązao) sprzężone z hydrolizą ATP A + B A B Syntetaza aminoacylo-trna Karboksylaza pirogronianowa Zasady klasyfikacji enzymów znajdują odzwierciedlenie w nadawanych im systematycznych numerach kodowych, złożonych z czterech członów liczbowych oddzielonych od siebie kropkami,
poprzedzonych literami EC. Numer klasyfikacyjny jednoznacznie wskazuje określony enzym. Przykładowo numer EC 3.2.1.1 oznacza α-amylazę (jeden z enzymów hydrolizujących skrobię). - Pierwsza cyfra tego enzymu oznacza przynależnośd do 3 klasy enzymów hydrolaz i charakteryzuje typ reakcji katalizowanej przez ten enzym. - Druga cyfra oznacza podklasę 2, w której znajdują się enzymy działające na związki glikozylowe. - Trzecia cyfra określa pod-podklasę 1 i precyzuje bliżej typ hydrolizowanego wiązania (O-glikozydowe). - Czwarta cyfra jest kolejnym numerem danego enzymu w jego podklasie. W podanym powyżej przykładzie posłużono się nazwą zwyczajową enzymu. Nazwa systematyczna α-amylazy to 1,4-glukanohydrolaza:α-1,4-glukan. Komisja Enzymowa dopuszcza stosowanie nazw potocznych enzymów, zwłaszcza w odniesieniu do enzymów dawno odkrytych np. α-amylazy, trypsyny, chymotrypsyny itp. Często używa się także dwuczłonowych, zwyczajowych nazw enzymów np. oksydaza mleczanowa (EC 1.1.3.2 oksydoreduktaza L-mleczan : tlen). Są one utworzone wg schematu, w którym pierwsza częśd nazwy pochodzi od rodzaju katalizowanej reakcji i zawsze ma koocówkę -aza, natomiast druga częśd jest tworzona od nazwy substratu, podanej w formie przymiotnika (koocówka -owa ). W praktyce laboratoryjnej można zetknąd się również z nazwami zwyczajowymi enzymów, które zostały utworzone od nazw ich substratów przez dodanie przyrostka -aza np. rybonukleaza, ureaza, arginaza. Obecnie nie tworzy się nazw enzymów od nazwy substratu. Na ogół używanie potocznych nazw enzymów jest wygodniejsze i powszechnie stosowane w literaturze podręcznikowej, natomiast w pracach naukowych podaje się nazwy systematyczne i numery klasyfikacyjne. Izoenzymy (izozymy) to różne formy enzymu, które katalizują tę samą reakcję, ale wykazują odmienne właściwości fizyczne lub kinetyczne (np. punkt izoelektryczny, optimum ph, powinowactwo do substratu, wrażliwośd na inhibitory). MIEJSCE AKTYWNE ENZYMU Miejsce aktywne enzymu to obszar który wiąże substrat (i kofaktor jeśli taki występuje) i przemienia je w produkt. Miejsce to zawiera reszty aminokwasowe (tzw. grupy katalityczne enzymu), które biorą bezpośredni udział w tworzeniu i zrywaniu wiązao. Miejsce aktywne stanowi względnie niewielką częśd całej cząsteczki enzymu. Jest to określona trójwymiarowa przestrzeo, zagłębienie lub szczelina, zbudowana z aminokwasów pochodzących z różnych części sekwencji aminokwasowej (leżących w pewnej odległości od siebie w łaocuchu polipeptydowym). W centrum aktywnym można wyróżnid grupy aminokwasów pełniących różne role w katalizowanym procesie, są to: - aminokwasy kontaktowe, których jeden lub więcej atomów jest oddalony od substratu na odległośd odpowiadającą przeciętnej długości wiązania chemicznego; należą do nich aminokwasy wiążące substrat oraz biorące bezpośredni udział w katalizie;
- aminokwasy pomocnicze, które nie stykając się z substratem, pełnią jednak określoną rolę w czynności katalitycznej enzymu, właściwie orientując substrat. Oprócz aminokwasów tworzących centrum aktywne, w cząsteczce enzymu występują aminokwasy stabilizujące jego strukturę przestrzenną oraz aminokwasy nie biorące udziału w stabilizacji budowy przestrzennej ani w funkcji katalitycznej. W obszarze centrum aktywnego wyróżnia się miejsce wiązania substratu, czyli miejsce określające specyficznośd enzymu oraz miejsce katalityczne, czyli miejsce, w którym zachodzi katalizowana reakcja. Szczelina miejsca aktywnego ma zazwyczaj charakter niepolarny co sprzyja wiązaniu substratu. Substrat/-y jest wiązany w miejscu aktywnym przez liczne słabe siły (np. oddziaływania elektrostatyczne, wiązania wodorowe, siły van der Waalsa, oddziaływania hydrofobowe) lub z niektórych przypadkach także przez odwracalne wiązania kowalencyjne. Po związaniu cząsteczki substratu i utworzeniu kompleksu enzym-substrat, katalitycznie czynne reszty znajdujące się w miejscu aktywnym enzymu działają na cząsteczkę substratu tak, aby początkowo przekształcid go w stan przejściowy, a następnie w produkt. Uwolnienie produktu zwalnia enzym, który może związad kolejną cząsteczkę substratu i rozpocząd nowy cykl katalityczny. Rys. 2. Ogólny cykl katalityczny. E enzym, S substrat, P produkt. Specyficznośd wiązania substratu zależy od precyzyjnie określonego ułożenia atomów w miejscu aktywnym. Ponieważ enzym i substrat oddziałują na siebie poprzez siły o niewielkim zasięgu, które wymagają bliskiego kontaktu, substrat musi mied odpowiedni kształt, by mógł pasowad do miejsca aktywnego. Zaproponowano dwa modele wyjaśniające jak enzym może wiązad swój substrat: a) Model zamka i klucza (model E. Fischera) przestrzenny kształt substratu i miejsca aktywnego pasują do siebie jak klucz do zamka. Są to struktury sztywne, trwałe, idealnie do siebie pasujące po odpowiednim zestawieniu (rys. 3a). b) Model indukowanego dopasowania (model Koshlanda) związanie substratu indukuje zmianę konformacyjną w miejscu aktywnym enzymu (rys. 3b). Różne enzymy wykazują cechy charakterystyczne dla obu modeli, tzn. pewną komplementarnośd i pewne zmiany konformacji. Specyficznośd substratowa może byd wąska i dotyczyd tylko jednego rodzaju cząsteczki lub szeroka i dotyczyd grupy cząsteczek o podobnej budowie i charakterze.
Rys. 3. Model dopasowania substratu do enzymu a) jak klucz do zamka ; b) indukowanego dopasowania Enzymy są cząsteczkami labilnymi, dlatego mogą łatwo tracid swą katalityczną aktywnośd. Zniszczenie struktury fragmentów cząsteczki odpowiedzialnych za aktywnośd enzymu powoduje spadek lub całkowitą utratę jego aktywności, czyli inaktywację. Może to wystąpid m.in. wskutek zablokowania centrum aktywnego enzymu, degradacji cząsteczki lub zniszczenia struktury przestrzennej, czyli denaturacji. Denaturację enzymów powodują wszystkie czynniki chemiczne i fizyczne denaturujące białka. RÓWNOWAGA REAKCJI I ENERGIA AKTYWACJI Aby zaszła reakcja biochemiczna musi zostad pokonana bariera energetyczna związana z przekształceniem cząsteczki substratu w stan przejściowy. Stan przejściowy ma w przebiegu reakcji największą energię swobodną (G). Różnica energii swobodnej miedzy substratem a stanem przejściowym nazywana jest energią aktywacji (ΔG ). Enzym stabilizuje stan przejściowy i zmniejsza wartośd ΔG, zwiększając przez to szybkośd przebiegu reakcji (rys. 4). Zmiana energii swobodnej G (ΔG) decyduje, czy reakcja będzie termodynamicznie korzystna, czy niekorzystna: ΔG 0 reakcja termodynamicznie korzystna, może zajśd spontanicznie bez dopływu energii, reakcja egzoergiczna (rys. 4). ΔG 0 reakcja termodynamicznie niekorzystna i wymaga nakładu energii, nie zachodzi spontanicznie, reakcja endoergiczna.
Rys. 4. Zmiany energii zachodzące podczas przebiegu reakcji biochemicznej. W układach biochemicznych nakład energii konieczny do przeprowadzenia reakcji termodynamicznie niekorzystnej uzyskuje się poprzez sprzężenie z reakcją termodynamicznie korzystną tzw. reakcje sprzężone. Reakcja chemiczna istnieje zazwyczaj w stanie równowagi dynamicznej, w której mimo ustawicznego przekształcania nowych cząstek substratu i tworzenia nowych cząstek produktu, proporcja substratu do produktu pozostaje stała. W równowadze stosunek stężeo substratu do produktu stanowi wartośd stałą, znaną jako stała równowagi (K). Stała równowagi jest określana przez stosunek szybkości reakcji w kierunku wprost (k 1 ) do szybkości reakcji w kierunku odwrotnym (k -1 ). Enzymy nie zmieniają stałej równowagi reakcji ale zwiększają szybkośd reakcji w obu kierunkach w tym samym stopniu, przyspieszając tym samym osiągnięcie stanu równowagi. AKTYWNOŚD ENZYMU Pomiar szybkości katalizowanej reakcji umożliwia określenie aktywności enzymu. Aby ułatwid porównywanie aktywności preparatów enzymatycznych, Komisja Enzymowa Międzynarodowej Unii Biochemicznej wprowadziła pojęcie międzynarodowej standardowej jednostki U (ang. U = unit). Jest to taka ilośd enzymu, która katalizuje przemianę 1 µmola substratu w ciągu 1 minuty, w temp. 30 C i w optymalnych warunkach (optymalne ph i stężenie substratu zapewniające wysycenie enzymu). Mianem jednostki standardowej jest µmol/min. Aktywnośd enzymu najczęściej wyraża się jako początkowa szybkośd katalizowanej reakcji (V 0 ). Poza jednostką standardową (U) do wyrażania aktywności enzymu stosuje się również jednostkę o nazwie katal (kat). Jest to taka ilośd enzymu, która katalizuje przemianę 1 mola substratu w ciągu 1 sekundy. Mianem katala jest mol/s. Jest to jednostka 60 milionów razy większa od jednostki standardowej,
stąd też zaleca się stosowanie jednostek pokrewnych: mikrokatal (μkat =10 6 kat), nanokatal (nkat = 10 9 kat), pikokatal (pkat= 10 12 kat). Zależnośd liczbowa pomiędzy jednostką standardową i katalem: 1 kat = 1 mol/s = 60 moli/min = 60 10 6 µmola/min = 6 10 7 U 1 U = 1 µmol/min = 1/60 µmola/s = 1/60 µkat = 16,67 10-9 kat = 16,67 nkat Inną wielkością określającą zdolnośd enzymu do katalizowania reakcji chemicznych jest stała katalityczna k kat, określająca stosunek szybkości maksymalnej reakcji V max do całkowitego stężenia enzymu: k kat = V max /[E] = µm/s/µm = 1/s Stała katalityczna (liczba obrotów, aktywnośd molekularna) określa liczbę cząsteczek substratu przetworzonych przez cząsteczkę enzymu w czasie 1 sekundy, w warunkach, w których enzym wykazuje maksymalną aktywnośd. Inne wartości liczbowe charakteryzujące czysty enzym: Aktywnośd całkowita całkowita liczba jednostek enzymu w próbce Aktywnośd specyficzna, właściwa liczba jednostek standardowych enzymu na 1 mg białka (U/mg białka). SZYBKOŚD REAKCJI ENZYMATYCZNEJ Szybkośd reakcji enzymatycznej zależy od stężenia substratu i enzymu oraz warunków, w jakich jest przeprowadzana (temperatura, ph, obecnośd aktywatorów, lub inhibitorów). Początkowa szybkośd reakcji V 0 to wartośd wyznaczona eksperymentalnie, zanim więcej niż ok 10% substratu ulegnie przekształceniu w produkt (aby zminimalizowad wpływ zjawisk komplikujących pomiar, tj. reakcja odwrotna, hamowanie enzymu przez produkt i stopniowa inaktywacja enzymu). V 0 wyznacza się z wykresu zależności ilości powstawania produktu od czasu. Taki typowy wykres wykazuje początkowy okres szybkiego narastania produktu, co odpowiada prostoliniowemu odcinkowi wykresu (rys. 5). Po okresie tym następuje stopniowe zwalnianie szybkości działania enzymu w miarę zużywania substratu lub/i osłabienia aktywności enzymu. Wartośd V 0 wyznacza się jako nachylenie prostej stycznej do wykresu funkcji w punkcie t=0. Rys. 5. Zależnośd między powstawaniem produktu a czasem trwania reakcji katalizowanej przez enzym.
a) Wpływ stężenia substratu na szybkośd reakcji enzymatycznej Przy małych stężeniach substratu podwojenie *S+ powoduje podwojenie wartości V 0. Przy wyższych stężeniach substratu enzym ulega wysyceniu i dalszy wzrost *S+ powoduje niewielką zmianę wartości V 0 (rys. 6). Szybkośd działania enzymu jest zależna od szybkości oddysocjowywania produktu od enzymu. Rys. 6. Zależnośd między stężeniem substratu *S+ a początkową szybkością reakcji (V 0 ) krzywa hiperboliczna. b) Wpływ stężenia enzymu na szybkośd reakcji enzymatycznej Przy stężeniu substratu zapewniającym wysycenie enzymu szybkośd reakcji V 0 jest wprost proporcjonalna do stężenia enzymu. Przy niewystarczającym stężeniu substratu szybkośd reakcji maleje (rys. 7). Rys. 7. Zależnośd między stężeniem enzymu *E+ a początkową szybkością reakcji (V 0 ) przy wysycającym stężeniu substratu [S] zależnośd liniowa, lub przy nie wysycającym stężeniu substratu zależnośd hiperboliczna c) Wpływ temperatury na szybkośd reakcji enzymatycznej Wzrost temperatury zwiększa energię termiczną cząsteczek substratu, co zwiększa ilośd cząsteczek, które mają dostateczną ilośd energii by przekroczyd barierę energetyczną ΔG, dzięki czemu szybkośd reakcji się zwiększa. Jednak wraz z podwyższeniem temperatury wzrasta również energia termiczna enzymu, co zwiększa szansę zerwania licznych słabych wiązao niekowalencyjnych utrzymujących trójwymiarową strukturę enzymu i miejsca aktywnego, co może prowadzid do denaturacji (rozfałdowania) enzymu i spadku lub do całkowitej utraty aktywności katalitycznej. Zatem wpływ wzrostu temperatury na V 0 jest wynikiem
równowagi miedzy tymi dwoma zjawiskami. Stan optimum temperaturowego (wąski lub szeroki zakres temperatury oraz wartośd temperatury) jest różny dla różnych enzymów. Większośd enzymów wykazuje optimum temperatury w zakresie 35 45 C, a w temperaturach powyżej 60 C traci aktywnośd nieodwracalnie (denaturacja). Istnieją jednak enzymy, które zachowują aktywnośd nawet po dłuższym ogrzewaniu w temp. 100 C (np. enzymy wydzielane przez bakterie żyjące w gorących źródłach). Rys. 8. Wpływ temperatury na aktywnośd enzymu. d) Wpływ ph na szybkośd reakcji enzymatycznej Każdy enzym ma optymalne ph działania, w którym szybkośd katalizowanej reakcji jest maksymalna. Niewielkie odchylenia ph od wartości optymalnej powodują spadek aktywności spowodowany zmianami jonizacji grup w miejscu aktywnym enzymu. Duże odchylenia ph prowadzą do zrywania słabych niekowalencyjnych oddziaływao, utrzymujących trójwymiarową strukturę białka, co w konsekwencji prowadzi do denaturacji enzymu. Krzywa ph ma najczęściej ma kształt dzwonowy (jak w przypadku trypsyny, rys. 9a), tzn. enzym wykazuje najwyższą aktywnośd w ph optymalnym, natomiast poniżej i powyżej tej wartości aktywnośd enzymu maleje. Większośd enzymów wykazuje optimum ph w zakresie 6 8. Nie zawsze jednak krzywa zależności aktywności od ph musi mied charakter dzwonowy. Niektóre enzymy mają taką samą aktywnośd w szerokim zakresie ph, np. papaina, esteraza cholinowa (rys. 9b-d).
Rys. 9. Wpływ ph na aktywnośd różnych enzymów. MODEL MICHAELISA-MENTEN Enzym E wiąże się z substratem S, tworząc kompleks enzym-substrat E S, ze stałą szybkości k 1. Kompleks E S może z powrotem dysocjowad do E i S ze stałą szybkości k -1 lub może się przekształcad tworząc produkt P, ze stałą szybkości k 2. Zakłada się, że produkt reakcji nie może ulec powrotnemu przekształceniu w wyjściowy substrat. Jest to warunek, który jest spełniany na początkowym etapie reakcji, zanim stężenie produktu stanie się znaczące. Ponieważ stężenie E S utrzymuje się na stałym poziomie dopóki w przybliżeniu całkowita ilośd substratu nie zostanie zużyta, przez większośd czasu przebiegu reakcji szybkośd powstawania E S jest równa szybkości jego przekształcania w P i wolny E, a więc E S utrzymuje stan równowagi. Przy małych stężeniach substratu (*S+), kiedy [S] jest znacznie mniejsze do K M, początkowa szybkośd reakcji V 0 jest wprost proporcjonalna do [S+, natomiast przy dużych stężeniach substratu, kiedy *S+ jest dużo większe od K M, szybkośd zmierza do wartości maksymalnej V max, czyli szybkośd staje się niezależna od *S+ (rys. 6). Rys. 10. Zależnośd między stężeniem substratu *S+ a początkową szybkością reakcji (V 0 ) wykres hiperboliczny.
Równanie Michaelisa-Menten [ ] [ ] [ ] [ ] gdzie jeśli *S+ = K M, wtedy K M (stała Michaelisa) jest równa takiemu stężeniu substratu przy którym szybkośd reakcji osiąga połowę swojej maksymalnej wartości. K M jest miarą stabilności kompleksu E S, stanowiąc iloraz sumy szybkości rozkładu E S i szybkości jego powstawania. W przypadku, gdy k -1 >> k 2 (znacznie większe) to K M staje się również miarą powinowactwa enzymu do substratu: wysoka wartośd K M wskazuje na słabe wiązanie substratu (gdyż k 2 > k 1 ) niska wartośd K M wskazuje na silne wiązanie substratu (gdyż k 1 > k 2 ) ` WYKRES LINEWEAVERA-BURKA Wykres Lineweavera-Burka pochodzi z przekształcenia równania Michaelisa-Menten i służy wyznaczeniu wartości V max i K M. [ ] Aby wyznaczyd wartości V max i K M należy zmierzyd V 0 przy różnych stężeniach substratu i wykonad wykres kinetyki enzymu, czyli zależności 1/V 0 od 1/[S]. Wykres 1/V 0 = f(1/*s+) jest linią prostą, której przecięcie z osią y równa się 1/V max, a przecięcie z osią x równa się -1/K M. Nachylenie linii ma wartośd K M /V max. Rys. 11. Zależnośd między stężeniem substratu *S+ a początkową szybkością reakcji (V 0 ) w układzie współrzędnych będących odwrotnościami V 0 i [S].
Ważną grupą enzymów działających niezgodnie z kinetyką Michaelisa-Menten są enzymy allosteryczne. Enzymy te składają się z kilku podjednostek i kilku miejsc aktywnych. W przypadku tych enzymów wykres zależności szybkości reakcji V 0 od stężenia substratu *S+ często przybiera kształt sigmoidalny (rys. 12). Rys. 12. Kinetyka enzymów allosterycznych. Enzymu allosteryczne wykazują sigmoidalny zależnośd szybkości reakcji od stężenia substratu. W enzymach allosterycznych, związanie substratu do jednego miejsca aktywnego może zmienid właściwości innych miejsc aktywnych w tej samej cząsteczce enzymu. Rezultatem takiego oddziaływania miedzy podjednostkami enzymu może byd kooperatywnośd wiązania substratu do innych miejsc aktywnych (tzn. związanie substratu w jednym miejscu aktywnym indukuje w enzymie zmianę konformacyjną, zmieniającą powinowactwo do substratu w innych miejscach aktywnych). Ponadto aktywnośd enzymów allosterycznych może byd zmieniana przez cząsteczki regulatorowe (aktywatory, inhibitory), które wiążą się do specyficznych miejsc innych niż miejsca katalityczne. Fosfatazy (fosfomonoesterazy) są enzymami katalizującymi hydrolityczny rozpad estrów kwasu fosforowego do odpowiedniego alkoholu i kwasu fosforowego. Enzymy te powszechnie występują zarówno w tkankach roślinnych jak i zwierzęcych. Wyróżniamy dwie klasy fosfataz: kwaśne, które wykazują maksymalną aktywnośd przy ph 4-6 oraz zasadowe z maksymalną aktywnością przy ph 8-9. Kiełki roślinne są łatwo dostępnym źródłem szeregu enzymów w tym również fosfatazy kwaśnej o małej specyficzności w stosunku do substratu. Rola fosfatazy kwaśnej w roślinie polega na uwalnianiu rezerw fosforanu znajdujących się w kiełkujących ziarnach w postaci m. in. sześciofosforanu inozytolu. Fosfataza kwaśna jest łatwo uwalniana w trakcie mieszania homogenizowanych kiełków w wodzie. Do oznaczania aktywności enzymu zostanie użyty syntetyczny substrat: nitrofenylofosforan sodu. Reakcja będzie przeprowadzana w warunkach optymalnych dla fosfatazy - w buforze cytrynianowym o ph 5,3. Produktem reakcji katalizowanej przez fosfatazę jest nitrofenol, bezbarwny w ph kwaśnym. Dodanie NaOH zatrzymuje reakcję i umożliwia przekształcenie nitrofenolu w barwny anion nitrofenolanowy (rys. 13).
Rys.13. Reakcja chemiczna z udziałem fosfatazy kwaśnej Ilośd produktu reakcji można określid na podstawie pomiaru spektrofotometrycznego. Oznaczanie aktywności fosfatazy prowadzi się przy stałym stężeniu substratu. Ilośd enzymu należy dobrad tak, aby stężenie substratu nie ograniczało szybkości katalizowanej reakcji. Zawartośd enzymu określa się w jednostkach aktywności, przyjmując za jednostkę taką ilośd enzymu, która hydrolizuje 1 µmol nitrofenylofosforanu w ciągu minuty. II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA 1. Enzymy jako katalizatory reakcji biochemicznych (wpływ enzymów na równowagę reakcji i energie aktywacji; miejsce aktywne enzymu, kompleksy enzym - substrat, specyficznośd substratowa, klasyfikacja enzymów). 2. Czynniki wpływające na aktywnośd enzymatyczną (temperatura, ph, kofaktory, stężenie substratu, stężenie enzymu). 3. Pojęcia: kofaktor, koenzym, grupa prostetyczna, holoenzym, apoenzym, izoenzymy, enzymy allosteryczne, jednostka enzymu (U), aktywnośd właściwa, aktywnośd całkowita, aktywnośd specyficzna,, aktywnośd molekularna (liczba obrotów). 4. Kinetyka reakcji enzymatycznej - równanie Michaelisa-Menten, stała Michaelisa, wykres Lineveawera- Burka. 5. Znajomośd części doświadczalnej (+ przeliczanie stężeo). III. APARATURA I SPRZĘT LABORATORYJNY 1. Probówki chemiczne zwykle 2. Pipeta szklana (5 ml) + nasadka 3. Statywy do probówek 4. Łaźnia wodna 5. Spektrofotometr 6. Mikser 7. Kolba stożkowa (500 ml) 8. Papier milimetrowy 9. Lejek, sączek, bibuła filtracyjna 10. Cylinder miarowy (200 ml) 11. Pipeta automatyczna (1000 µl)
IV. ODCZYNNIKI 1. 0,005 M roztwór nitrofenylofosforanu sodu w wodzie (przygotowad bezpośrednio przed użyciem) 2. 0,1 M bufor cytrynianowy ph 5.3 3. 1 N NaOH 4. 0,5 mm roztwór p-nitrofenolu w wodzie (przygotowad bezpośrednio przed użyciem) 5. H 2 O w lodówce do r-row 1 i 4 V. WYKONANIE DWICZENIA A. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU ENZYMATYCZNEGO Do 2-3 g kiełków (ilośd i rodzaj kiełków zostanie podana przez prowadzącego) dodad 200 ml wody destylowanej. Korzystając z miksera przygotowad homogenat z kiełków. Przesączyd. Przesącz należy rozcieoczyd 2-5 razy (wielokrotnośd rozcieoczenia zostanie podana przez prowadzącego). Przesącz zawiera fosfatazę kwaśną, której aktywnośd należy oznaczyd. UWAGA! Otrzymany ekstrakt należy przechowywad w lodzie. B. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ a. Przygotowanie krzywej wzorcowej Krzywą wzorcową wykonuje się w celu opisania zależności pomiędzy stężeniem p-nitrofenolu w próbie a wartością ekstynkcji. Do 7 probówek odmierzyd: Tab. 2. Dane opisujące zależnośd ekstynkcji od stężenia p-nitrofenolu Nr probówki 0,5 mm p-nitrofenol (ml) 1 N NaOH (ml) Woda destylowana (ml) Ekstynkcja przy λ=430 nm 1- kontrola 0 1 5 2 0,25 1 4,75 3 0,5 1 4,5 4 1 1 4 5 1,5 1 3,5 6 2 1 3 7 3 1 2 Próby wymieszad, zmierzyd ekstynkcję przy długości fali 430 nm (spektrofotometr wyzerowad względem pierwszej próby, pomiary wpisad do tabeli 2) i sporządzid krzywą wzorcową dla p-nitrofenolu
(wykres 1) odkładając na osi rzędnych stężenie p-nitrofenolu (mm) w danej próbie, a na osi odciętych wartości ekstynkcji dla tej próby. Pamiętaj, że krzywa wzorcowa to linia prosta przechodząca przez punkt (0,0) oraz przez jak największą ilośd punktów pomiarowych lub w ich pobliżu (jest to tzw. linia trendu). Napisz reakcję jaka zachodzi w probówkach na tym etapie dwiczenia (skorzystaj z rys. 13). Wymieo nazwy związków (substraty i produkty), zaznacz kolory roztworów jakie tworzą te związki. Wyznacz stosunek molowy substratu i produktu reakcji. Wyjaśnij, stężenie jakiego związku jest mierzone w spektrofotometrze. Wyjaśnij dlaczego, na postawie wyznaczonych pomiarów jest możliwe wyznaczenie zależności pomiędzy stężeniem p-nitrofenolu a wartością ekstynkcji. b. Przygotowanie mieszanin reakcyjnych i przeprowadzenie reakcji hydrolizy Do 5 ponumerowanych czystych probówek laboratoryjnych odmierzyd roztwory: Tab. 3. Przygotowanie roztworów Nr probówki Homogenat z kiełków (ml) Woda destylowana (ml) Bufor cytrynianowy (ml) 1 - kontrola 0 2,0 1,0 2 0,5 1,5 1,0 3 1,0 1,0 1,0 4 1,5 0,5 1,0 5 2,0 0 1,0 Próby po dokładnym wymieszaniu wstawid do łaźni wodnej o temp. 37 C na 10 min (przygotowanie środowiska reakcji). Następnie do każdej probówki szybko dodad po 2 ml 0,005 M roztworu nitrofenylofosforanu sodu o temp. 37 C i inkubowad próby w temp. 37 C przez kolejne 10 min (przebieg reakcji). Po tym czasie do każdej probówki dodad po 1 ml 1 N roztworu NaOH, wymieszad (zatrzymanie reakcji) i przeprowadzid pomiar ekstynkcji przy długości fali 430 nm (spektrofotometr wyzerowad względem pierwszej próby, pomiary wpisad do tabeli 4). Napisz reakcję jaka zachodzi w probówkach (skorzystaj z rys. 13). Wymieo nazwy związków (substraty i produkty), zaznacz kolory roztworów jakie tworzą te związki. Wyznacz stosunek molowy substratu i produktów reakcji.
Tab. 4 Dane opisujące zależnośd objętości homogenatu od µmol/min zhydrolizowanego p-nitrofenylofosforanu Nr probówki Homogenat z kiełków (ml) 1 - kontrola 0 2 0,5 3 1,0 4 1,5 5 2,0 Ekstynkcja przy λ=430 nm C m p-nitrofenolu (mm) Ilośd zhydrolizowanego p-nitrofenylofosforanu (µmol/min) Na podstawie wyników pomiaru ekstynkcji odczytad z wykresu 1 stężenie powstałego p-nitrofenolu w każdej próbie (odczyty wpisad do tabeli 4), a następnie obliczyd liczbę moli p-nitrofenolu każdej próbie (obliczenia wpisad do tabeli 4). Na podstawie uzyskanych wyników wyznaczyd całkowitą liczbę moli zhydrolizowanego p-nitrofenylofosforanu dla każdej próby i obliczyd ilośd moli zhydrolizowanego p- nitrofenylofosforanu w czasie 1 minuty. Przedstawid krzywą hydrolizy p-nitrofenylofosforanu sodu w obecności kwaśnej fosfatazy (wykres 2) odkładając na osi rzędnych µmole zhydrolizowanego substratu/min, a na osi odciętych ilośd dodanego homogenatu w ml. Pamiętaj, że krzywa hydrolizy to linia prosta przechodząca przez punkt (0,0) oraz przez jak największą ilośd punktów pomiarowych lub w ich pobliżu (jest to tzw. linia trendu). c. Wyznaczenie aktywności fosfatazy kwaśnej Na podstawie wykresu 2, wyznacz objętośd homogenatu, w której zawiera się 1 jednostka enzymu fosfatazy kwaśnej (wykorzystaj do tego celu definicje jednostki enzymu). Oblicz, ile jednostek enzymu znajduje się w 1 ml homogenatu. VI. WYNIKI i WNIOSKI Napisad cel dwiczenia, rodzaj i ilośd (masę) kiełków wykorzystanych w doświadczeniu oraz stopieo rozcieoczenia homogenatu stosowanego w dwiczeniu. Wykonad obliczenia (wraz z obliczeniami jednostek) wg wytycznych wypisanych kursywą w przebiegu doświadczenia. Uzupełnid tabele 2 i 4. Narysowad na papierze milimetrowym wykresy (wykres powinien zawierad tytuł oraz opisane obie osie, zaznaczeniem jednostek). Wyznaczyd aktywnośd fosfatazy kwaśnej (punkt V.c.) i sformułowad wnioski.