Histology FISH Accessory Kit Nr kat. K5799

Histology FISH Accessory Kit Nr kat. K5799 Wydanie 6 Stosować do hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (technika FISH) skrawków utrwalanych w formalinie i zatapianych w parafinie. Zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 20 badań. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 1/28

Spis treści Przeznaczenie... 3 Wprowadzenie... 3 Odczynniki... 3 Dostarczane materiały... 3 Materiały wymagane, lecz niedostarczone... 4 Środki ostroŝności... 5 Przechowywanie... 7 Przygotowanie próbek... 8 Skrawki zatapiane w parafinie... 8 INSTRUKCJA UśYCIA... 9 A. Przygotowanie odczynników... 9 A.1 Roztwór Pre-Treatment Solution... 9 A.2 Bufor Stringent Wash Buffer... 9 A.3 Bufor Wash Buffer... 9 A.4 Seria rozcieńczeń etanolu... 9 A.5 Roztwór pepsyny... 9 B. Procedura barwienia... 10 B.1 Uwagi dotyczące procedury... 10 B.2 Przygotowanie tkanek do wykonania odczynu... 10 B.3 Protokół barwienia... 11 B.3.a B.3.b Protokół barwienia dla sond FISH rozcieńczonych w buforze hybrydyzacyjnym z węglanem etylenu... 11 Protokół barwienia dla sond FISH rozcieńczonych w buforze hybrydyzacyjnym z formamidem... 15 Kontrola jakości... 18 Interpretacja wyników... 19 Rozwiązywanie problemów... 20 Dodatek 1... 25 Dodatek 2... 26 Piśmiennictwo... 27 Objaśnienie symboli... 28 (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 2/28

POLSKI Przeznaczenie Do badań diagnostycznych in vitro. Zestaw akcesoriów Histology FISH Accessory Kit jest przeznaczony do hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (technika FISH) na skrawkach tkankowych utrwalanych w formalinie i zatapianych w parafinie. Odczynniki zawarte w niniejszym zestawie Histology FISH Accessory Kit mogą być stosowane wraz z zestawem HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix (nr kat. K5731, fiolka 3). W przypadku stosowania odczynników z zestawu Dako Histology FISH Accessory Kit (nr kat. K5799) z odczynnikami z zestawu o nr kat. K5731 naleŝy postępować zgodnie z procedurą opisaną w ulotce dołączonej do zestawu K5731. Wprowadzenie Zestaw Histology FISH Accessory Kit zawiera wszystkie najwaŝniejsze odczynniki, z wyjątkiem sondy, potrzebne do wykonania badania FISH na skrawkach tkankowych utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Po odparafinowaniu i nawodnieniu próbki podgrzewa się w roztworze Pre-Treatment Solution, a następnie przeprowadza trawienie proteolityczne produktem Pepsin. Po etapach ogrzewania i trawienia proteolitycznego do preparatów dodaje się dostarczone przez uŝytkownika sondy FISH, uszczelnia się szkiełka szczeliwem Coverslip Sealant, po czym poddaje się je przez noc denaturacji i hybrydyzacji. Po hybrydyzacji przeprowadza się głębokie płukanie, które gwarantuje usunięcie niezwiązanych i związanych nieswoiście sond FISH przed odwodnieniem przy uŝyciu etanolu. Na koniec preparaty są zatapiane środkiem Fluorescence Mounting Medium zawierającym niebieski fluorescencyjny barwnik kontrastowy. Wyniki interpretuje się przy uŝyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposaŝonego w odpowiednie filtry (zob. Dodatek 1). Odczynniki Dostarczane materiały Wymienione poniŝej materiały wystarczają do wykonania 20 badań (pojedyncze badanie definiuje się dla pojedynczego obszaru docelowego o rozmiarach 22 mm x 22 mm). Zestaw zawiera ilość materiału wystarczającą na 10 indywidualnych serii FISH (cztery oddzielne serie, w razie stosowania metody z zanurzaniem w pepsynie). Zestaw Histology FISH Accessory Kit jest dostarczany w suchym lodzie. Obecność suchego lodu przy odbiorze stanowi gwarancję, iŝ składniki zestawu nie były poddane działaniu wysokich temperatur podczas transportu. Niektóre składniki zestawu mogą być rozmroŝone, nie ma to wpływu na działanie zestawu Histology FISH Accessory Kit. Fiolka 1 Fiolka 2A Fiolka 2B Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, 20-krotnie stęŝony Bufor MES (kwas 2-[N-morfolino]-etanosulfonowy). Pepsin 4 x 6,0 ml, gotowy do uŝycia Roztwór pepsyny o ph 2,0; zawiera środek stabilizujący i przeciwbakteryjny. Pepsin Diluent (10x) 24 ml, koncentrat 10x Bufor do rozcieńczania o ph 2,0; zawiera środek przeciwbakteryjny. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 3/28

Fiolka 4 Fiolka 5 Fiolka 6 Element 7 Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, 20-krotnie stęŝony SSC (sól fizjologiczna z cytrynianem sodu) z detergentem Tween-20. Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml Gotowy do uŝycia fluorescencyjny środek do zatapiania z 500 µg/l DAPI (4,6-diamidino-2-fenyloindol). Wash Buffer (20x) 500 ml, 20-krotnie stęŝony bufor Tris/HCl. Coverslip Sealant 1 tubka Gotowy do uŝycia roztwór słuŝący do nietrwałego uszczelniania szkiełek nakrywkowych. UWAGA: Wszystkie odczynniki mogą być stosowane wymiennie z odpowiadającymi im odczynnikami z zestawu Dako HER2 IQFISH pharmdx (nr kat. K5731). W przypadku stosowania odczynników z zestawu Dako Histology FISH Accessory Kit (nr kat. K5799) z odczynnikami z zestawu o nr kat. K5731 naleŝy postępować zgodnie z procedurą opisaną w ulotce dołączonej do zestawu K5731. Materiały wymagane, lecz niedostarczone Odczynniki laboratoryjne Woda destylowana lub dejonizowana Etanol, 96% Ksylen lub jego odpowiedniki Sprzęt laboratoryjny Waciki Pipety nastawne Kalibrowany termometr częściowo zanurzany (zakres 37 100 C) Szkiełka nakrywkowe (18 mm x 18 mm lub 22 mm x 22 mm i 24 mm x 50 mm lub 24 mm x 60 mm) Pinceta Wyciąg Dako Hybridizer (nr kat. S2450/S2451)* Płyta grzejna lub piec hybrydyzacyjny* Wilgotna komora hybrydyzacyjna* Mikrowirówka Szkiełka silanizowane Dako Silanized Slides nr kat. S3003, szkiełka opłaszczone poli-l-lizyną lub szkiełka superfrost Plus Słoje lub łaźnie barwiące Metalowe lub plastykowe widełki Stoper (odpowiedni do wyznaczenia 0 60-minutowych okresów) Łaźnia wodna z pokrywą (zapewniająca utrzymanie temperatury 37 (±2) C, 63 (±2) C, 65 (±2) C i od 95 C do 99 C (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 4/28

Kuchenka mikrofalowa z funkcją detekcji, jeŝeli w procedurze wstępnej wykorzystywana jest kuchenka mikrofalowa** (patrz Etap 1, część B.3.a lub B.3.b. Protokół barwienia, Metoda B). Pojemnik odporny na mikrofale, pokrywa musi zawierać otwory o średnicy np. jednego cm * MoŜna zastosować płytę grzejną do trawienia (37 (±2) C), płytę grzejną lub piec hybrydyzacyjny do denaturacji (66 (±2) C (B.3.a.) lub 82 (±2) C) (B.3.b.) oraz wilgotną komorę hybrydyzacyjną do hybrydyzacji (45 (±2) C), lecz zalecane jest stosowanie urządzenia Dako Hybridizer, nr kat. S2450/S2451. ** Zamiast kuchenki mikrofalowej moŝna uŝyć łaźni wodnej z pokrywą (zapewniającej utrzymanie temperatury 95 99 C) lub sterowanej mikroprocesorowo komory ciśnieniowej, takiej jak Dako Pascal, nr kat. S2800. Sprzęt i przybory mikroskopowe Filtry do mikroskopu fluorescencyjnego: filtr DAPI i filtry odpowiednie do uŝytego fluorochromu, tj. dla sond Dako FISH: filtr podwójny FITC/Texas Red lub filtry pojedyncze FITC i Texas Red. Szczegółowe informacje zawiera Dodatek 1. Dla sond Dako FISH naleŝy stosować mikroskop fluorescencyjny ze źródłem światła w postaci lampy rtęciowej 100 W. Do stosowania z wymienionymi filtrami nie są zalecane inne źródła światła. Pojemnik na preparaty (tekturowa podstawka na 20 preparatów z odchylaną przegubowo pokrywą lub podobny). Środki ostroŝności 1. Do stosowania w diagnostyce in vitro. 2. Do stosowania przez wyszkolony personel. 3. Fiolka 1 nie wymaga oznakowania substancji niebezpiecznych. Karta Charakterystyki Substancji jest dostępna na Ŝądanie. 4. Fiolka 2A, Pepsin, zawiera 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsynę A, 0.011-<0.1% 5- chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one i 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Fiolka 2A jest oznaczona etykietą: Niebezpieczeństwo H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 Powoduje powaŝne oparzenia skóry oraz uszkodzenia oczu. MoŜe powodować reakcję alergiczną skóry. Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować odzieŝ ochronną. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO DRÓG ODDECHOWYCH: Wyprowadzić lub wynieść poszkodowanego na świeŝe powietrze i zapewnić mu warunki do swobodnego oddychania. Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub wezwać lekarza. W PRZYPADKU POŁKNIĘCIA: Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub wezwać lekarza. NIE wywoływać wymiotów. W PRZYPADKU KONTAKTU ZE SKÓRĄ (lub z włosami): Natychmiast zdjąć całą zanieczyszczoną odzieŝ. Spłukać skórę wodą albo pod prysznicem. Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub wezwać lekarza. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub wezwać lekarza. Przechowywać pod zamknięciem. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 5/28

P501 Zawartość pojemnika jak i pojemnik utylizować zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, narodowymi oraz międzynarodowymi przepisami. 5. Fiolka 2B, Pepsin Diluent (10x), zawiera 50-<75% propan-2-ol i 5-<10% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Fiolka 2B jest oznaczona etykietą: Niebezpieczeństwo H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P353 P235 P501 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. Provoca irritação ocular grave. MoŜe wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. Stosować rękawice ochronne. Stosować ochronę oczu lub twarzy. Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, źródeł iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Nie palić. UŜywać elektrycznego/wentylującego/oświetleniowego/ przeciwwybuchowego sprzętu. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO DRÓG ODDECHOWYCH: Wyprowadzić lub wynieść poszkodowanego na świeŝe powietrze i zapewnić mu warunki do swobodnego oddychania. PATEKUS ANT ODOS (arba plaukų): Natychmiast zdjąć całą zanieczyszczoną odzieŝ. Spłukać skórę pod strumieniem wody/prysznicem. Przechowywać w chłodnym miejscu. Zawartość pojemnika jak i pojemnik utylizować zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, narodowymi oraz międzynarodowymi przepisami. 6. Fiolka 4, Stringent Wash Buffer (20x), zawiera 10-<25% chlorek sodu i 10-<20% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Fiolka 4 jest oznaczona etykietą: H319 H315 P280 Uwaga P264 P305 + P351 + P338 Działa draŝniąco na oczy. Działa draŝniąco na skórę. Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Dokładnie umyć ręce po uŝyciu. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeŝeli są i moŝna je łatwo usunąć. Nadal płukać. 7. Fiolka 6, Wash Buffer (20x), zawiera 10-<25% chlorek sodu i 10-<20% trometamol. Fiolka 6 jest oznaczona etykietą: Uwage H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Działa draŝniąco na oczy. Działa draŝniąco na skórę. Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Dokładnie umyć ręce po uŝyciu. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 6/28

płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeŝeli są i moŝna je łatwo usunąć. Nadal płukać. 8. Element 7, Coverslip Sealant, zawiera 100% hydrorafinowanej benzyny cięŝkiej (ropy naftowej) i nosi następujące oznaczenia: Niebezpieczeństwo H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P501 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. Połknięcie i dostanie się przez drogi oddechowe moŝe grozić śmiercią. Działa toksycznie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki. Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, źródeł iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Nie palić. UŜywać sprzętu elektrycznego, wentylacyjnego, oświetleniowego i słuŝącego do operowania materiałem w wersji przeciwwybuchowej. Unikać uwolnienia do środowiska. W PRZYPADKU POŁKNIĘCIA: Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub wezwać lekarza. NIE wywoływać wymiotów. W PRZYPADKU KONTAKTU ZE SKÓRĄ (lub z włosami): Natychmiast zdjąć całą zanieczyszczoną odzieŝ. Spłukać skórę wodą albo pod prysznicem. Przechowywać w chłodnym miejscu. Zawartość pojemnika jak i pojemnik utylizować zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, narodowymi oraz międzynarodowymi przepisami. 9. Dodatkowe informacje znajdują się w Karcie Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (SDS). 10. Zastosowanie próbek o innej grubości lub metod ich utrwalania innych, niŝ podano w instrukcji, moŝe wpływać na morfologię tkanki i/lub intensywność sygnału. 11. Stosowanie innych od opisanych parametrów czasu inkubacji, temperatury lub metod moŝe powodować błędne wyniki badania. 12. Dostarczone odczynniki mają optymalne rozcieńczenia. Dalsze rozcieńczanie moŝe pogorszyć ich działanie. 13. W metodzie z zanurzaniem w pepsynie mogą być stosowane wyłącznie czyste naczynia do barwienia (Etap 2, metoda C). Przechowywanie Przechowywać w ciemności w temperaturze 2 8 C. Wszystkie odczynniki nada ją się równieŝ do zamraŝania. Wysoka temperatura moŝe mieć negatywny wpływ na produkt Pepsin (fiolka 2A). Nie naleŝy pozostawiać tego składnika w temperaturze pokojowej. Silne oświetlenie moŝe mieć negatywny wpływ na środek Fluorescence Mounting Medium (fiolka 5). Nie naleŝy przechowywać tego składnika w miejscach oświetlonych. Nie naleŝy uŝywać zestawu po upływie daty waŝności wydrukowanej na opakowaniu zestawu. JeŜeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ podane w ulotce dołączonej do opakowania, UŜytkownik powinien zweryfikować ich działanie (1). (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 7/28

Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego produktu. Dlatego waŝne jest, aby w serii testów uwzględnić kontrolę w postaci tkanki prawidłowej, o której wiadomo, Ŝe dobrze poddaje się badaniu FISH. W wypadku nieoczekiwanego obrazu fluorescencji, którego nie moŝna wyjaśnić róŝnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z zestawem Histology FISH Accessory Kit, naleŝy się skontaktować z Działem Pomocy Technicznej firmy Dako. Przygotowanie próbek Próbki pochodzące z biopsji, resekcji lub wycinki naleŝy poddać obróbce, aby utrwalić tkanki do analizy techniką FISH. NaleŜy postępować wg opisanej poniŝej zalecanej metody przygotowania tkanek do barwienia immunocytochemicznego. Dalsze informacje moŝna odnaleźć w piśmiennictwie (2). UŜycie dla FISH tkanek eksponowanych na odwapnianie kwasem nie jest zalecane (3-6). Uznaje się, Ŝe EDTA jako środek odwapniający lepiej zabezpiecza DNA (6) dla technik (F)ISH (3, 4, 7). UWAGA: Działanie zestawu Dako Histology FISH Accessory Kit nie zostało poddane walidacji dla tkanek odwapnionych. Skrawki zatapiane w parafinie Do uŝytku nadają się jedynie tkanki utrwalone w obojętnie zbuforowanej formalinie i zatopione w parafinie. Próbki naleŝy np. przygotować w formie bloczków o grubości od 3 do 4 mm i utrwalać przez 18 24 godziny w obojętnie zbuforowanej formalinie. Następnie tkanki są odwadniane w szeregu stęŝeń etanolu i w ksylenie, a potem nasączane stopioną parafiną, utrzymywaną w temperaturze nie wyŝszej niŝ 60 C. Prawidłowo utrwalone i zatopione tkanki przed podzieleniem na skrawki i osadzeniem na szkiełku moŝna przechowywać przez nieograniczony czas, o ile przechowuje się je prawidłowo (15 25 C) (2, 8). Inne środki utrwalające są nieodpowiednie. WydłuŜenie czasu utrwalania moŝe spowodować konieczność dłuŝszej inkubacji na etapie trawienia enzymem Pepsyną. Materiał tkankowy naleŝy pociąć na skrawki o grubości 2 6 µm, umieścić na preparatach wyjętych z łaźni wodnej i wysuszyć na powietrzu. Optymalna grubość skrawków tkankowych wynosi 2-3 µm w przypadku sond Dako Split Signal FISH. Skrawki o grubościach of 4 6 µm mogą być wykorzystane w innych zastosowaniach FISH. Parafina powinna być roztapiana w temperaturze 60 C przez 30 60 minut. Skrawki naleŝy następnie schłodzić do temperatury pokojowej (20 25 C) i przechowywać w temperaturze 2 8 C. Zaleca się osadzane skrawków na szkiełkach silanizowanych Dako Silanized Slides, nr kat. S 3003, szkiełkach opłaszczonych poli-l-lizyną lub szkiełkach Superfrost Plus. Co do zasady próbki przechowywane w temperaturze 2 8 C naleŝy przeanalizować przed upływem 6 miesięcy od pocięcia. JeŜeli skrawki tkankowe są przechowywane w warunkach innych niŝ podane w ulotce dołączonej do opakowania, uŝytkownik powinien zweryfikować te warunki. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 8/28

INSTRUKCJA UśYCIA A. Przygotowanie odczynników Dla wygody zaleca się przygotowanie następujących odczynników przed rozpoczęciem barwienia: A.1 Roztwór Pre-Treatment Solution W fiolce 1 mogą się pojawić kryształki, które rozpuszczają się w temperaturze pokojowej. Przed przygotowaniem odczynnika upewnić się, Ŝe w fiolce nie ma kryształków. Rozcieńczyć odpowiednią ilość stęŝonego roztworu z fiolki 1 (Roztwór Pre-Treatment Solution 20x) w wodzie destylowanej lub dejonizowanej w proporcji 1:20. Niewykorzystany rozcieńczony roztwór moŝna przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia rozcieńczony roztwór nie nadaje się do uŝycia. A.2 Bufor Stringent Wash Buffer Rozcieńczyć odpowiednią ilość stęŝonego roztworu z fiolki 4 (Bufor Stringent Wash Buffer 20x) w wodzie destylowanej lub dejonizowanej w proporcji 1:20. Niewykorzystany rozcieńczony bufor moŝna przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia rozcieńczony bufor wylać. A.3 Bufor Wash Buffer Rozcieńczyć odpowiednią ilość stęŝonego roztworu z fiolki 6 (Bufor Wash Buffer 20x) w wodzie destylowanej lub dejonizowanej w proporcji 1:20. Niewykorzystany rozcieńczony bufor moŝna przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia rozcieńczony bufor wylać. A.4 Seria rozcieńczeń etanolu Z 96% roztworu etanolu przygotować 3 naczynia zawierające etanol 70%, 85% i 96%. Zamknięte słoje przechowywać w temperaturze 2 8 C; roztwory uŝyć do maksymalnie 200 preparatów. W przypadku zmętnienia roztwory wylać. A.5 Roztwór pepsyny Roztwór pepsyny jest potrzebny jedynie w przypadku stosowania metody z zanurzaniem w pepsynie (B.3.a i B.3.b, Etap 2, Metoda C). Sposób przygotowania roztworu pepsyny; W przypadku pojemnika na sześć preparatów przygotować 60 ml roztworu pepsyny: Dodać do pojemnika 48 ml destylowanej lub dejonizowanej wody o temperaturze pokojowej (20 25 C). Dodać do pojemnika 6 ml zimnego (2 8 C) rozcieńczalnika Pepsin Diluent (10x) (fiolka 2B). Dodać do pojemnika 6 ml zimnego (2 8 C) produktu Pepsin (fiolka 2A). Przykryć pojemnik pokrywą i odczekać, aŝ roztwór pepsyny uzyska w łaźni wodnej temperaturę 37 (±2) C. W przypadku pojemnika na 24 preparaty przygotować 240 ml roztworu pepsyny: Dodać do pojemnika 192 ml destylowanej lub dejonizowanej wody o temperaturze pokojowej (20 25 C). Dodać do pojemnika 24 ml zimnego (2 8 C) rozcieńczalnika Pepsin Diluent (10x) (fiolka 2B). Dodać do pojemnika 24 ml zimnego (2 8 C) produktu Pepsin (fiolka 2A). (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 9/28

Przykryć pojemnik pokrywą i odczekać, aŝ roztwór pepsyny uzyska w łaźni wodnej temperaturę 37 (±2) C. Roztwór pepsyny o wyrównanej temperaturze powinien zostać zuŝyty w czasie 5 godzin. B. Procedura barwienia B.1 Uwagi dotyczące procedury Przed uŝyciem naleŝy dokładnie przeczytać niniejsze instrukcje oraz zapoznać się z wszystkimi składnikami (patrz Środki ostroŝności). Jeśli składniki zestawu są zamroŝone na czas przechowywania, zaleca się przeniesienie odczynników do temperatury 2 8 C na jeden dzień przed analizą, co pozwoli na prawidłowe wyrównanie temperatury. Wszystkie odczynniki naleŝy przed uŝyciem doprowadzić do stanu równowagi temperaturowej. Fiolka 1: Rozcieńczony roztwór Pre-Treatment Solution naleŝy doprowadzić do temperatury 95 99 C, jeŝeli w obróbce wstępnej stosowana jest łaźnia wodna (część B.3.a lub B.3.b, Protokół barwienia, Etap 1: Obróbka wstępna, Metoda A). JeŜeli w obróbce wstępnej stosowana jest kuchenka mikrofalowa z funkcją detekcji (część B.3a lub B.3.b, Protokół barwienia, Etap 1: Obróbka wstępna, Metoda B), wówczas rozcieńczony roztwór Pre-Treatment Solution powinien być doprowadzony do temperatury pokojowej 20 25 C. Fiolka 2A: Produkt Pepsin naleŝy dodawać w temperaturze 2 8 C (część B.3.a lub B.3.b, Protokół barwienia, Etap 2: Metoda A i B) i nieprzerwanie utrzymywać w chłodzie. Fiolka 2B: Rozcieńczalnik Pepsin Diluent (10x) naleŝy dodawać w temperaturze 2 8 C (część B.3.a lub B.3.b, Protokół barwienia, Etap 2: Metoda C) Fiolka 4: Przed uŝyciem jedno naczynie buforu Stringent Wash Buffer powinno być doprowadzone do stabilnej temperatury pokojowej, a drugie naczynie do temperatury 63 (±2) C (część B.3.a) lub 65 (±2) C (część B.3.b). Fiolka 5: Środek Fluorescence Mounting Medium moŝna dodawać w dowolnej temperaturze z przedziału 2 25 C. Fiolka 6: Rozcieńczony bufor Wash Buffer powinien zostać doprowadzony do temperatury pokojowej (20 25 C). Element 7: Szczeliwo Coverslip Sealant moŝna dodawać w temperaturze pokojowej (20 25 C). Wszystkie etapy procedury naleŝy wykonywać w podanej temperaturze. Procedura przygotowania do wykonania odczynu obejmuje odwadnianie i suszenie próbek. Przed przejściem do kolejnego etapu naleŝy zawsze sprawdzić, czy próbki całkowicie wyschły. Nie naleŝy dopuszczać, by próbki dosychały w trakcie czynności wchodzących w skład procedury. Jeśli zajdzie konieczność przerwania procedury barwienia, preparaty moŝna po etapie odparafinowania przechowywać w buforze Wash Buffer, w temperaturze pokojowej (20 25 C), przez maksymalnie 1 godzinę. B.2 Przygotowanie tkanek do wykonania odczynu Odparafinowanie i nawodnienie: Przed przystąpieniem do wykonania procedury naleŝy odparafinować preparaty w celu usunięcia parafiny i ponownie je nawodnić. NaleŜy usuwać parafinę całkowicie. Pozostałości parafiny powodują nasilenie odczynu nieswoistego. Ten etap powinien być wykonywany w temperaturze pokojowej (20 25 C). 1. Umieścić szkiełka w kąpieli ksylenowej i inkubować przez 5 (±1) minut. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć czynność. 2. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w 96% etanolu na 2 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć czynność. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 10/28

3. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w 70% etanolu na 2 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć czynność. 4. Strząsnąć nadmiar płynu i zanurzyć preparaty w rozcieńczonym buforze Wash Buffer (patrz INSTRUKCJA UśYCIA, część A.2) na przynajmniej 2 minuty. Rozpocząć procedurę barwienia zgodnie z instrukcją podaną w części B.3.a lub B.3.b Etap 1, Obróbka wstępna. Po kaŝdych 200 preparatach naleŝy przygotować świeŝe roztwory ksylenu i alkoholu. MoŜna stosować zamienniki ksylenu. UWAGA: Odczynniki i instrukcje dostarczane w zestawie opracowano w celu uzyskania optymalnej wydajności. Dodatkowe rozcieńczenie odczynników bądź nieprzestrzeganie czasu lub temperatury inkubacji moŝe spowodować uzyskanie błędnych lub sprzecznych wyników. RóŜnice w przygotowaniu tkanek oraz w procedurach technicznych w laboratorium uŝytkownika mogą stanowić przyczynę uniewaŝnienia wyników badania. Opcjonalna dodatkowa inkubacja próbek: Przed odparafinowaniem i nawodnieniem preparaty naleŝy inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 60 C na płycie grzejnej, płycie w piecu hybrydyzacyjnym lub w urządzeniu Dako Hybridizer. Zamiast tego moŝna inkubować preparaty przez 1 2 dni w temperaturze 37 C, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze 60 C. Następnie przejść do etapu odparafinowania i nawodnienia. UWAGA: Ten etap jest opcjonalny. Preparaty poddawane wydłuŝonej inkubacji mogą ograniczyć ewentualny szum tła. B.3 Protokół barwienia Przejść do jednego z dwóch wariantów protokołu, B.3.a lub B3.b. Nie naleŝy stosować zamiennie etapów zawartych w obu procedurach: Protokół barwienia B.3.a opisuje półdniową procedurę, którą naleŝy przeprowadzić dla sond FISH rozcieńczonych w buforze hybrydyzacyjnym z węglanem etylenu. Protokół barwienia B.3.b opisuje dwudniową procedurę, którą naleŝy przeprowadzić dla sond FISH rozcieńczonych w buforze hybrydyzacyjnym z formamidem. B.3.a Protokół barwienia dla sond FISH rozcieńczonych w buforze hybrydyzacyjnym z węglanem etylenu Etap 1: Obróbka wstępna (z uŝyciem kuchenki mikrofalowej, łaźni wodnej, komory ciśnieniowej Pascal) Obróbkę wstępną moŝna przeprowadzić za pomocą łaźni wodnej, jak opisano w metodzie A) lub, alternatywnie, za pomocą kuchenki mikrofalowej z funkcją detekcji, co opisano w metodzie B) bądź stosując komorę ciśnieniową Pascal opisaną w metodzie C). Metoda A: Obróbka wstępna z uŝyciem łaźni wodnej Pojemniki do barwienia, np. naczynia Couplina, napełnić rozcieńczonym roztworem Pre-Treatment Solution (patrz INSTRUKCJA UśYCIA, część A.1). Naczynia do barwienia z rozcieńczonym roztworem Pre-Treatment Solution umieścić w łaźni wodnej. Podgrzać łaźnię wodną i roztwór Pre- Treatment Solution do 95 99 C. Aby zapewnić dokładny pomiar, naleŝy zmierzyć temperaturę wewnątrz naczynia przy uŝyciu skalibrowanego termometru. Barwiacze nakryć pokrywami, aby ustabilizować temperaturę i zapobiec parowaniu. Zanurzyć odparafinowane skrawki o temperaturze pokojowej w podgrzanym roztworze Pre- Treatment Solution znajdującym się w naczyniach do barwienia. Ponownie sprawdzić temperaturę i inkubować przez 10 (±1) minut w temperaturze 95 99 C. Wyjąć całe naczynie zawierające preparaty z łaźni wodnej. Usunąć pokrywę i odstawić preparaty na 15 minut do ostygnięcia w roztworze Pre-Treatment Solution w temperaturze pokojowej. Preparaty przenieść na 3 minuty do naczynia z rozcieńczonym buforem Wash Buffer (patrz INSTRUKCJA UśYCIA, część A.3) w temperaturze pokojowej (20 25 C). (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 11/28

Wymienić bufor Wash Buffer i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. UWAGA: Roztwór Pre-Treatment Solution jest przeznaczony wyłącznie do jednorazowego uŝycia. Nie uŝywać ponownie. Metoda B: Obróbka wstępna przy uŝyciu kuchenki mikrofalowej z funkcją detekcji Plastikowe naczynie napełnić rozcieńczonym roztworem Pre-Treatment Solution o temperaturze pokojowej (20 25 C). Zanurzyć odparafinowane skrawki w Pre-Treatment Solution, przykryć naczynie pokrywką z otworami i umieścić w kuchence mikrofalowej. Wybrać funkcję czujnika gotowania i zaprogramować ją tak, aby pracowała przez 10 minut po osiągnięciu temperatury wrzenia*. Po zakończeniu 10-minutowej inkubacji wyjąć naczynie z preparatami, zdjąć pokrywkę i studzić w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Przenieść preparaty do naczynia z rozcieńczonym buforem Wash Buffer i moczyć przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (20 25 C). Wymienić bufor Wash Buffer i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. * Wykorzystanie kuchenki mikrofalowej z funkcją detekcji oznacza, Ŝe musi ona posiadać czujnik i programy, które wstępnie podgrzeją roztwór Pre-Treatment Solution do punktu wrzenia i następnie będą utrzymywać wymaganą temperaturę obróbki wstępnej (powyŝej 95 ºC), jednocześnie odmierzając wstępnie zadany czas (10 (±1) minut). Niektóre modele kuchenek mikrofalowych z funkcją detekcji mogą nie posiadać moŝliwości swobodnego wprowadzania odliczanego czasu. JeŜeli konkretny model posiada jedynie gotowe programy, pamiętaj, aby wybrać program, który podtrzymuje wymaganą temperaturę obróbki wstępnej (powyŝej 95 ºC) przez przynajmniej 10 (±1) minut i ręcznie zatrzymaj program po 10 (±1) minutach. UWAGA: Roztwór Pre-Treatment Solution jest przeznaczony wyłącznie do jednorazowego uŝycia. Nie uŝywać ponownie. Metoda C: Obróbka wstępna przy uŝyciu komory ciśnieniowej Pascal Do pojemnika komory wlać 500 ml wody dejonizowanej. Plastikowe naczynie napełnić 250 ml roztworu Pre-Treatment Solution. Zanurzyć odparafinowane skrawki w roztworze Pre-Treatment Solution i umieścić naczynie w pojemniku komory. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze 121 C. Zwolnić ciśnienie po schłodzeniu do 90 C. Informacje na temat prawidłowej obsługi znajdują się w podręczniku uŝytkownika komory ciśnieniowej Pascal. Po upuszczeniu ciśnienia wyjąć pojemnik. Usunąć pokrywy i odstawić preparaty na 15 minut do ostygnięcia w roztworze Pre- Treatment Solution w temperaturze pokojowej. Przenieść preparaty do naczynia z rozcieńczonym buforem Wash Buffer (zob. INSTRUKCJA UśYCIA, część A.2). Namaczać skrawki przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wymienić bufor Wash Buffer i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. Przejść do etapu 2. UWAGA: Roztwór Pre-Treatment Solution jest przeznaczony tylko do jednorazowego uŝycia. Nie uŝywać ponownie. Nie uŝywać hermetycznie zamkniętych pojemników do obróbki wstępnej w kuchence mikrofalowej. Podczas podgrzewania wzrasta w nich ciśnienie, co moŝe spowodować wybuch lub obraŝenia podczas otwierania. W kuchence mikrofalowej moŝna zastosować metalowy stojak na preparaty, jeśli pozostaje on zanurzony w roztworze Pre-Treatment Solution podczas całego procesu podgrzewania. Nie umieszczać metalowych przedmiotów w kuchence mikrofalowej w Ŝadnym innym przypadku. Przestrzegać instrukcji dostarczonych przez producenta kuchenki mikrofalowej. NaleŜy unikać ciągłego gotowania roztworu Pre-Treatment Solution podczas 10-minutowej inkubacji. NaleŜy regularnie sprawdzać pomiar temperatury za pomocą skalibrowanego termometru w celu weryfikacji odpowiednich warunków termicznych. Etap 2: Pepsyna gotowa do uŝytku (RTU) lub roztwór pepsyny Inkubację z pepsyną moŝna przeprowadzić poprzez bezpośrednie dodanie do preparatów kropli gotowej do uŝycia pepsyny w temperaturze pokojowej (20 25 C) (Metoda A) lub w temperaturze 37 C (Metoda B). Innym sposobem jest zanurzenie preparatów w roztworze pepsyny i inkubacja w temperaturze 37 (±2) C (Metoda C). Metoda A i Metoda B: Strząsnąć nadmiar buforu. UŜywając bezkłaczkowego materiału (np. wacika lub płatka gazy), ostroŝnie przetrzeć dookoła próbkę kliniczną, w celu usunięcia nadmiaru płynu oraz utrzymania odczynników w określonym miejscu. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 12/28

Dodać 5 8 kropli (250 µl) schłodzonego (2 8 C) produktu Pepsin (fiolka 2A), tak aby pokryć próbkę. Pepsynę naleŝy zawsze przechowywać w temperaturze 2 8 C. Metoda A: Pepsyna, gotowa do uŝycia inkubacja w temperaturze 20 25 C Inkubować przez 5 15 minut w temperaturze pokojowej (20 25 C). W przypadku większości preparatów wystarcza inkubacja 5-15 minutowa, jednakŝe optymalny czas inkubacji moŝe zaleŝeć od sposobu utrwalania tkanek i/lub grubości próbki i powinien zostać określony przez uŝytkownika. Strząsnąć nadmiar pepsyny i przez 3 minuty moczyć preparaty w rozcieńczonym buforze Wash Buffer (patrz INSTRUKCJA UśYCIA, część A.3), w temperaturze pokojowej (20 25 C). Wymienić rozcieńczony bufor Wash Buffer i moczyć preparaty przez kolejne 3 minuty. Przejść do odwodnienia. Metoda B: Pepsyna, gotowa do uŝycia inkubacja w temperaturze 37 C Umieścić próbkę z dodanym produktem Pepsin na płycie grzejnej w temperaturze 37 C np. urządzenia Dako Hybridizer inkubować przez 3 5 minut. W przypadku większości preparatów wystarcza inkubacja 3 5 minutowa, jednakŝe optymalny czas inkubacji moŝe zaleŝeć od sposobu utrwalania tkanek i/lub grubości próbki i powinien zostać określony przez uŝytkownika. Strząsnąć nadmiar produktu Pepsin i przez 3 minuty moczyć skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer, w temperaturze pokojowej (20 25 C). Wymienić bufor Wash Buffer i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. Przejść do odwodnienia. Odwodnić skrawki tkankowe w gradiencie stęŝeń etanolu: 2 minuty w etanolu 70%, 2 minuty w etanolu 85% i 2 minuty w etanolu 96%. Pozostawić preparaty do całkowitego wysuszenia. Metoda C: Roztwór pepsyny zanurzanie preparatów w roztworze pepsyny o temperaturze 37 C Zestaw zawiera odczynniki wystarczające na przeprowadzenie czterech osobnych zanurzeń (60 ml roztworu pepsyny, mały pojemnik na sześć preparatów) lub pojedyncze zanurzenie (240 ml roztworu pepsyny, duŝy pojemnik na 24 preparaty). Przygotować roztwór pepsyny zgodnie z opisem w części A.5. Przykryć pojemnik pokrywą i odczekać, aŝ roztwór pepsyny uzyska w łaźni wodnej temperaturę 37 (±2) C. Upewnić się, czy doszło do ustabilizowania temperatury. Upewnić się, Ŝe temperatura w pojemniku jest odpowiednia za pomocą skalibrowanego termometru. Strząsnąć nadmiar buforu do przemywania. Zanurzyć preparaty w roztworze pepsyny o temperaturze 37 (±2) C i inkubować przez 20 30 minut. W przypadku większości preparatów wystarcza inkubacja 20 30 minutowa, jednakŝe optymalny czas inkubacji moŝe zaleŝeć od sposobu utrwalania tkanek i/lub grubości próbki i powinien zostać określony przez uŝytkownika. Strząsnąć nadmiar pepsyny i przez 3 minuty moczyć skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer, w temperaturze pokojowej (20 25 C). Wymienić bufor Wash Buffer i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. Przejść do odwodnienia. Odwodnić skrawki tkankowe w gradiencie stęŝeń etanolu: 2 minuty w etanolu 70%, 2 minuty w etanolu 85% i 2 minuty w etanolu 96%. Pozostawić preparaty do całkowitego wysuszenia. Etap 3: Sonda FISH rozcieńczona w buforze hybrydyzacyjnym z węglanem etylenu (dostarczonym przez uŝytkownika) UWAGA: Mieszanki sond FISH rozcieńczone w buforze hybrydyzacyjnym z węglanem etylenu naleŝy przechowywać pomiędzy uŝyciem w temperaturze -18 C. Przechowywanie w tempe raturze -18 C powoduje rozdzielenie buforu na dwie fazy. D latego przed uŝyciem naleŝy odczekać, aŝ mieszanka sondy osiągnie temperaturę pokojową (20 25 C), a następnie wymieszać. Rozmrozić mieszankę sondy FISH w temperaturze pokojowej (20 25 C) nie dłuŝej niŝ przez 30 minut (chronić przed silnym źródłem światła), a następnie zwirować fiolkę przez 15 sekund na mieszadle wirowym z prędkością 2500 obr./min. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 13/28

NałoŜyć odpowiednią ilość mieszanki sondy, tj. 10 µl, na środku skrawka tkankowego. Natychmiast nałoŝyć szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm, tak aby mieszanka sondy rozprowadziła się równomiernie pod szkiełkiem. Unikać pęcherzyków powietrza. W razie zaobserwowania pęcherzyków powietrza, delikatnie ostukać preparat pincetą, tak aby usunąć je z tkanek. Uszczelnić szkiełko nakrywkowe za pomocą szczeliwa Coverslip Sealant, nakładając je wokół brzegów szkiełka. Szczeliwo nakładać zarówno na szkiełko nakrywkowe, jak i podstawowe, tak aby utworzyć uszczelkę wokół szkiełka nakrywkowego. Sprawdzić, czy szczeliwo pokrywa cały brzeg szkiełka nakrywkowego. Przygotować Dako Hybridizer* (nr kat. S2450 lub S2451) do hybrydyzacji. Upewnić się, Ŝe Humidity Control Strips (nr kat. S2452) są nasycone i optymalne do uŝycia. Uruchomić urządzenie Hybridizer i wybrać następujący program: Denaturacja w temp. 66 C przez 10 minut, a następnie hybrydyzacja w temp. 45 C przez 60 120 minut. Umieścić skrawki w Hybridizer, upewnić się, Ŝe pokrywa jest właściwie zamknięta i uruchomić program. Szczegółowe informacje znajdują się w instrukcji obsługi urządzenia Hybridizer firmy Dako. * Do denaturacji i hybrydyzacji moŝna uŝywać urządzeń, które umoŝliwiają utrzymanie warunków denaturacji i hybrydyzacji identycznych z opisanymi powyŝej: Umieścić preparaty na płaskiej metalowej lub kamiennej powierzchni (płycie grzejnej lub płycie w piecu hybrydyzacyjnym) wstępnie podgrzanej do temperatury 66 (±1) C. Denaturować przez dokładnie 10 minut. Umieścić szkiełka we wstępnie ogrzanej nawilŝonej komorze hybrydyzacyjnej. Przykryć komorę pokrywą i inkubować w temperaturze 45 (±2) C przez 60 120 minut. Etap 4: Głębokie płukanie (Stringent Wash) Dwa pojemniki do barwienia, np. naczynia Coplina, napełnić rozcieńczonym roztworem buforu Stringent Wash Buffer (patrz INSTRUKCJA UśYCIA, część A.2). Zaleca się stosowanie minimum 100 ml lub 15 ml roztworu na preparat w kaŝdym z naczyń. Jeden z pojemników do barwienia zawierających rozcieńczony bufor Stringent Wash Buffer o temperaturze pokojowej umieścić pod okapem wyciągowym, a drugi w łaźni wodnej. Podgrzać łaźnię wodną i rozcieńczony bufor Stringent Wash Buffer do temperatury 63 (±2) C. Upewnić się, Ŝe doszło do ustabilizowania temperatury. Naczynie nakryć pokrywą, aby ustabilizować temperaturę i zapobiec parowaniu. Aby zagwarantować dokładność pomiaru, temperaturę wewnątrz łaźni wodnej zmierzyć przy uŝyciu wykalibrowanego termometru. Bufor Stringent Wash Buffer zawiera detergent i moŝe mętnieć w temperaturze 63 C; nie wpływa to jednak na jego jakość działania. Przy uŝyciu pincety lub rękawic wyciągnąć preparaty z komory hybrydyzacyjnej i delikatnie usunąć szczeliwo Coverslip Sealant oraz szkiełko nakrywkowe, a następnie pojedynczo umieszczać preparaty w naczyniu do płukania wstępnego o temperaturze pokojowej. Po usunięciu wszystkich szkiełek nakrywkowych preparaty przenieść z naczynia do płukania wstępnego o temperaturze pokojowej do naczynia łaźni wodnej o temperaturze 63 (±2) C. Niezwłocznie po przeniesieniu preparatów do łaźni wodnej o temperaturze 63 (±2) C wypełnionej rozcieńczonym buforem Stringent Wash Buffer naleŝy uruchomić licznik czasu. Przeprowadzić głębokie płukanie przez dokładnie 10 minut. Wyjąć preparaty z rozcieńczonego roztworu Stringent Wash Buffer i przez 3 minuty moczyć w rozcieńczonym buforze Wash Buffer w temperaturze pokojowej (20 25 C). Zmienić rozcieńczony bufor Wash Buffer i moczyć preparaty przez kolejne 3 minuty. Odwodnić skrawki tkankowe w gradiencie stęŝeń etanolu: 2 minuty w etanolu 70%, 2 minuty w etanolu 85% i 2 minuty w etanolu 96%. Pozostawić preparaty do całkowitego wysuszenia. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 14/28

Etap 5: Zatapianie preparatu NałoŜyć 15 µl odczynnika Fluorescence Mounting Medium zawierającego filtr DAPI (fiolka 5) na powierzchnię docelową preparatu i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. UWAGA: Odczyt odczynu moŝna przeprowadzić po 15 minutach od momentu zatopienia lub przed upływem 7 dni. JednakŜe w przypadku kontaktu ze światłem lub wysokimi temperaturami moŝe dochodzić do utraty zabarwienia. Aby zminimalizować płowienie barwy, preparaty naleŝy przechowywać w ciemności w temperaturze -18 8 C. B.3.b.Protokół barwienia dla sond FISH rozcieńczonych w buforze hybrydyzacyjnym z formamidem DZIEŃ 1 Etap 1: Obróbka wstępna (z uŝyciem kuchenki mikrofalowej, łaźni wodnej, komory ciśnieniowej Pascal) Obróbkę wstępną moŝna przeprowadzić za pomocą łaźni wodnej, jak opisano w metodzie A) lub, alternatywnie, za pomocą kuchenki mikrofalowej z funkcją detekcji, co opisano w metodzie B) bądź stosując komorę ciśnieniową Pascal opisaną w metodzie C). Metoda A: Obróbka wstępna z uŝyciem łaźni wodnej Napełnić naczynia do barwienia rozcieńczonym roztworem Pre-Treatment Solution (zob. INSTRUKCJA UśYCIA, część A.1). Naczynia do barwienia z rozcieńczonym roztworem Pre- Treatment Solution umieścić w łaźni wodnej. Podgrzać łaźnię wodną i roztwór Pre-Treatment Solution do 95 99 C. Aby zapewnić dokładny pomiar, naleŝy zmierzyć temperaturę wewnątrz naczynia przy uŝyciu skalibrowanego termometru. Naczynia nakryć pokrywami (bez otworów), aby ustabilizować temperaturę i zapobiec parowaniu. Zanurzyć odparafinowane skrawki we wstępnie podgrzanym roztworze Pre-Treatment Solution. Ponownie sprawdzić temperaturę, zamknąć pokrywę łaźni wodnej i inkubować przez 10 (±1) minut w temperaturze 95 99 C. Wyjąć całe naczynie zawierające preparaty z łaźni wodnej. Zdjąć pokrywkę (nie wyjmować preparatów). Odczekać 15 minut, aŝ w temperaturze pokojowej nastąpi schłodzenie preparatów w roztworze Pre-Treatment Solution. Przenieść preparaty do naczynia z rozcieńczonym buforem Wash Buffer (zob. INSTRUKCJA UśYCIA, część A.2) na 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wymienić bufor Wash Buffer i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. Przejść do etapu 2. Metoda B: Obróbka wstępna przy uŝyciu kuchenki mikrofalowej z funkcją detekcji Plastikowy pojemnik wypełnić rozcieńczonym roztworem Pre-Treatment Solution o temperaturze pokojowej (20 25 C). Zanurzyć odparafinowane skrawki w roztworze i zamknąć pokrywę. Pokrywa musi mieć otwory umoŝliwiające wyrównywanie ciśnień. Umieścić pojemnik z preparatami w kuchence mikrofalowej i ogrzać. Przed ogrzewaniem upewnij się, Ŝe zewnętrzne powierzchnie pojemnika oraz wnętrze kuchenki mikrofalowej są suche. Inkubować w temperaturze tuŝ poniŝej punktu wrzenia (nie mniej niŝ 95 C) przez 10 minut. Po inkubacji zdjąć pokrywkę (nie wyjmować preparatów). Odstawić preparaty na 15 minut do ostygnięcia w roztworze Pre-Treatment Solution w temperaturze pokojowej (20 25 C). Preparaty muszą być zakryte buforem podczas całej procedury obróbki wstępnej. Przenieść preparaty do naczynia z rozcieńczonym buforem Wash Buffer (zob. INSTRUKCJA UśYCIA, część A.2) na 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wymienić bufor Wash Buffer i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. Przejść do etapu 2. Metoda C: Obróbka wstępna przy uŝyciu komory ciśnieniowej Pascal Do pojemnika komory wlać 500 ml wody dejonizowanej. Plastikowe naczynie napełnić 250 ml roztworu Pre-Treatment Solution. Zanurzyć odparafinowane skrawki w roztworze Pre-Treatment Solution i umieścić naczynie w pojemniku komory. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 15/28

121 C. Zwolnić ciśnienie po schłodzeniu do 90 C. Informacje na temat prawidłowej obsługi znajdują się w podręczniku uŝytkownika komory ciśnieniowej Pascal. Po upuszczeniu ciśnienia wyjąć pojemnik. Usunąć pokrywy i odstawić preparaty na 15 minut do ostygnięcia w roztworze Pre- Treatment Solution w temperaturze pokojowej. Przenieść preparaty do naczynia z rozcieńczonym buforem Wash Buffer (zob. INSTRUKCJA UśYCIA, część A.2). Namaczać skrawki przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wymienić bufor Wash Buffer i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. Przejść do etapu 2. UWAGA: Roztwór Pre-Treatment Solution jest przeznaczony tylko do jednorazowego uŝycia. Nie uŝywać ponownie. Nie uŝywać hermetycznie zamkniętych pojemników do obróbki wstępnej w kuchence mikrofalowej. Podczas podgrzewania wzrasta w nich ciśnienie, co moŝe spowodować wybuch lub obraŝenia podczas otwierania. W kuchence mikrofalowej moŝna zastosować metalowy stojak na preparaty, jeśli pozostaje on zanurzony w roztworze Pre-Treatment Solution podczas całego procesu podgrzewania. Nie umieszczać metalowych przedmiotów w kuchence mikrofalowej w Ŝadnym innym przypadku. Przestrzegać instrukcji dostarczonych przez producenta kuchenki mikrofalowej. NaleŜy unikać ciągłego gotowania roztworu Pre-Treatment Solution podczas 10- minutowej inkubacji. NaleŜy regularnie sprawdzać pomiar temperatury za pomocą skalibrowanego termometru w celu weryfikacji odpowiednich warunków termicznych. Etap 2: Pepsyna gotowa do uŝycia (RTU) lub roztwór pepsyny Inkubację z pepsyną moŝna przeprowadzić poprzez bezpośrednie dodanie do preparatów kropli gotowej do uŝycia pepsyny w temperaturze pokojowej (20 25 C) (Metoda A) lub w temperaturze 37 C (Metoda B). Innym sposobem jest zanurzenie preparatów w roztworze pepsyny i inkubacja w temperaturze 37 (±2) C (Metoda C) Metoda A i Metoda B: Strząsnąć nadmiar buforu. Posługując się chusteczką niepozostawiającą włókien (np. ściereczką wchłaniającą lub gazikiem) ostroŝnie otrzeć szkiełko wokół próbki tak, by usunąć pozostałości płynu i utrzymać odczynniki w obszarze zawierającym materiał. Nanieść 5 8 kropli (250 µl) schłodzonego (2 8 C) produktu Pepsin (fiolka 2A) w sposób zapewniający pokrycie próbki. Produkt Pepsin naleŝy zawsze przechowywać w temperaturze 2 8 C. Metoda A: Pepsyna, gotowa do uŝycia inkubacja w temperaturze 20 25 C Inkubować przez 5 50 minut w temperaturze pokojowej (20 25 C). Trwająca 10 20 minut inkubacja w temperaturze pokojowej będzie odpowiednia dla większości preparatów, jednak uŝytkownik powinien ustalić optymalny czas inkubacji. Strząsnąć nadmiar produktu Pepsin i przez 3 minuty moczyć skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer (patrz INSTRUKCJA UśYCIA, część A.3), w temperaturze pokojowej (20 25 C). Wymienić rozcieńczony bufor Wash Buffer i moczyć preparaty przez kolejne 3 minuty. Przejść do etapu 3, Sonda FISH, lub (opcjonalnie) dobrać optymalny czas trawienia wg opisu zamieszczonego w Dodatku 2. Metoda B: Pepsyna, gotowa do uŝycia inkubacja w temperaturze 37 C Umieścić próbki z pepsyną w temperaturze 37 C w urządzeniu Dako Hybridizer lub na wstępnie podgrzanej płycie grzejnej. Inkubować przez 2 6 minut w temperaturze 37 C. Będzie to odpowiednie dla większości próbek przygotowanych zgodnie z opisem w części Przygotowanie materiału. UŜytkownik powinien ustalić optymalny czas inkubacji, który zaleŝy od typu tkanki, sposobu utrwalenia tkanki, grubości preparatu i czasu wstępnej inkubacji preparatu. Czynniki te mogą wydłuŝyć Ŝądany czas trawienia do 7 15 minut lub nawet więcej. W przypadku pierwszego uŝycia naleŝy określić optymalny czas trawienia, testując reprezentatywną tkankę przez 1, 3, 6, 12 i 18 minut. Strząsnąć produkt Pepsin i przez 3 minuty moczyć skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer (patrz INSTRUKCJA UśYCIA, część A.3), w temperaturze pokojowej (20 25 C). (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 16/28

Wymienić rozcieńczony bufor Wash Buffer i moczyć preparaty przez kolejne 3 minuty. Przejść do etapu 3, Sonda FISH, lub (opcjonalnie) dobrać optymalny czas trawienia wg opisu zamieszczonego w Dodatku 2. Metoda C: Roztwór pepsyny zanurzanie preparatów w roztworze pepsyny o temperaturze 37 C Zestaw zawiera ilość odczynników wystarczającą na cztery oddzielne serie (60 ml roztworu pepsyny, mały pojemnik na sześć preparatów) lub jedną serię (240 ml roztworu pepsyny, duŝy pojemnik na 24 preparaty). Przygotować roztwór pepsyny zgodnie z opisem w części A.5. Przykryć pojemnik pokrywą i odczekać, aŝ roztwór pepsyny uzyska w łaźni wodnej temperaturę 37 (±2) C. Upewnić się, czy doszło do ustabilizowania temperatury. Upewnić się, Ŝe temperatura w pojemniku jest odpowiednia za pomocą skalibrowanego termometru. Strząsnąć nadmiar buforu do przemywania. Zanurzyć preparaty w roztworze pepsyny o temperaturze 37 (±2) C i inkubować przez 20 30 minut. W przypadku większości preparatów wystarcza inkubacja 20 30 minutowa, jednakŝe optymalny czas inkubacji moŝe zaleŝeć od sposobu utrwalania tkanek i/lub grubości próbki i powinien zostać określony przez uŝytkownika. Strząsnąć nadmiar roztworu pepsyny i przez 3 minuty moczyć skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer w temperaturze pokojowej (20 25 C). Wymienić bufor Wash Buffer i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. Przejść do etapu 3, Sonda FISH, lub (opcjonalnie) dobrać optymalny czas trawienia wg opisu zamieszczonego w Dodatku 2. UWAGA: Zaleca się postępowanie wg procedury opisanej w części Przygotowanie materiału. Tkanki zbyt słabo wytrawione mogą być przyczyną braku sygnałów lub występowania tylko sygnałów zakłóconych, często o wysokim poziomie zielonego cytozolowego sygnału tła. Etap 3: Sonda FISH (dostarczona przez uŝytkownika) UWAGA: W przypadku stosowania odczynników z zestawu Dako Histology FISH Accessory Kit (kod 5799) z odczynnikami z zestawu o kodzie K5731 naleŝy postępować zgodnie z procedurą opisaną w ulotce dołączonej do zestawu K5731. Kolejny etap naleŝy przeprowadzać pod wyciągiem. W przypadku ekspozycji na silne światło jakość sond znakowanych fluorochromem moŝe pogorszyć się. Nie naleŝy wykonywać pozostałej części tej procedury w miejscu silnie oświetlonym, np. bezpośrednio nasłonecznionym. Odwodnić skrawki tkankowe w gradiencie stęŝeń etanolu: 2 minuty w etanolu 70%, 2 minuty w etanolu 85% i 2 minuty w etanolu 96% (patrz SPOSÓB UśYTKOWANIA, część A.4). Pozostawić preparaty do całkowitego wysuszenia. NałoŜyć odpowiednią ilość sondy znakowanej fluorochromem, np. 10 µl sondy Dako FISH, pośrodku skrawka tkankowego. Natychmiast nakryć sondę szkiełkiem 18 mm x 18 mm (lub np. 22 mm x 22 mm) i pozwolić, by sonda rozlała się równomiernie pod szkiełkiem. Unikać pęcherzyków powietrza. W razie zaobserwowania pęcherzyków usunąć je, delikatnie pukając pincetą. Uszczelnić szkiełko nakrywkowe, nakładając na jego brzegi szczeliwo Coverslip Sealant. Szczeliwo nakładać zarówno na szkiełko nakrywkowe, jak i podstawowe, tak aby utworzyć uszczelkę wokół szkiełka nakrywkowego. Szczeliwo do szkiełek nakrywkowych powinno uszczelniać szkiełko nakrywkowe na całym jego obwodzie. W przypadku stosowania sond Dako FISH umieścić preparaty w urządzeniu Dako Hybridizer (nr kat. S2450/S2451) i ustawić denaturację na 82 C przez 5 minut i hybrydyzację na 45 C, na całą noc (14 20 h). Przejść do procedury Dzień 2, Etap 4, Głębokie płukanie (Stringent Wash). Więcej informacji znajduje się w podręczniku uŝytkownika urządzenia Hybridizer. UWAGA: Płyta grzejna, piec hybrydyzacyjny i komora hybrydyzacyjna mogą być stosowane zamiennie, patrz niŝej. Umieścić preparat na płaskiej metalowej lub kamiennej powierzchni (płyta grzejna lub płyta pieca hybrydyzacyjnego) podgrzanej do temperatury 82 (±2) C. Przeprowadzać denaturację przez 5 minut, przez cały czas utrzymując temperaturę płyty powyŝej 80 C. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 17/28

Umieścić szkiełka we wstępnie ogrzanej nawilŝonej komorze hybrydyzacyjnej. W przypadku stosowania sond Dako FISH naleŝy przykryć komorę pokrywą i inkubować do następnego dnia (14 20 godzin) w temperaturze 45 (±2) C. DZIEŃ 2 Etap 4: Głębokie płukanie (Stringent Wash) Dwa pojemniki do barwienia z rozcieńczonym roztworem buforu Stringent Wash Buffer (patrz INSTRUKCJA UśYCIA, część A.2). Jeśli w jednym naczyniu umieszczonych jest 1 6 preparatów, potrzebne będzie co najmniej 100 ml rozcieńczonego buforu Stringent Wash Buffer. Jeśli w naczyniu znajduje się więcej niŝ 6 preparatów, naleŝy uŝyć co najmniej 15 ml buforu na jeden preparat. Jeden z pojemników do barwienia zawierających rozcieńczony bufor Stringent Wash Buffer o temperaturze pokojowej umieścić pod okapem wyciągowym, a drugi w łaźni wodnej. Podgrzać łaźnię wodną i rozcieńczony bufor Stringent Wash Buffer do temperatury 65 (±2) C. Upewnić się, Ŝe doszło do ustabilizowania temperatury. Naczynie nakryć pokrywą, aby ustabilizować temperaturę i zapobiec parowaniu. Zmierzyć temperaturę w naczyniu za pomocą skalibrowanego termometru, aby zapewnić uzyskanie prawidłowej temperatury. Wyjąć preparaty z komory hybrydyzacyjnej. Za pomocą pincety delikatnie usunąć szczeliwo Coverslip Sealant i zdjąć szkiełko nakrywkowe, a następnie przenieść preparat do naczynia tymczasowego o temperaturze pokojowej. Po usunięciu wszystkich szkiełek nakrywkowych preparaty przenieść z naczynia do płukania wstępnego o temperaturze pokojowej do naczynia łaźni wodnej o temperaturze 65 (±2) C. Zamknąć naczynie pokrywką i następnie zamknąć pokrywką łaźnię wodną. Prowadzić głębokie płukanie przez dokładnie 10 minut w temperaturze 65 (±2) C. Wyciągnąć preparaty z rozcieńczonego roztworu buforu Stringent Wash Buffer i przez 3 minuty moczyć w rozcieńczonym buforze Wash Buffer w temperaturze pokojowej (20 25 C). Zmienić rozcieńczony bufor Wash Buffer i moczyć preparaty przez kolejne 3 minuty. Odwodnić skrawki tkankowe w gradiencie stęŝeń etanolu: 2 minuty w etanolu 70%, 2 minuty w etanolu 85% i 2 minuty w etanolu 96% (patrz SPOSÓB UśYTKOWANIA, część A.4). Poczekać, aŝ preparaty całkowicie wyschną na powietrzu. Etap 5: Zatapianie preparatu Na obszar docelowy na powierzchni preparatu nałoŝyć 15 µl środka Fluorescence Mounting Medium (fiolka 5) zawierającego niebieski fluorescencyjny barwnik kontrastowy.i przykryć szkiełkiem nakrywkowym (np. 24 mm x 50 mm lub 24 mm x 60 mm). Odczekać, aŝ środek przykryje równomiernie całą próbkę. UWAGA: Odczyt odczynu moŝna przeprowadzić po 15 minutach od momentu zatopienia lub przed upływem 7 dni. Pod wpływem światła lub wysokich temperatur preparaty blakną. Dlatego naleŝy je przechowywać w ciemności, w temperaturze -18 8 C. Kontrola jakości 1. Sygnał musi być jasny, wyraźny i łatwy do oceny. 2. Do kontroli serii testów naleŝy uŝyć tkanki prawidłowej, o której wiadomo, Ŝe daje dobre wyniki w badaniu FISH. 3. W tkankach prawidłowych sygnały fluorescencyjne powinny być wyraźnie widoczne, co stanowić będzie potwierdzenie hybrydyzacji sond FISH w obszarach docelowych. 4. Brak sygnałów w komórkach tkanki prawidłowej wskazuje na nieprawidłowy przebieg testu w takiej sytuacji wyniki naleŝy uznać za niewaŝne. 5. W wyniku pocięcia tkanki w niektórych komórkach prawidłowych liczba sygnałów będzie niŝsza od oczekiwanej. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 18/28

6. Przy uŝyciu filtra DAPI naleŝy sprawdzić, czy jądro komórkowe pozostało nienaruszone i jest jednorodnie wybarwione. DuŜa liczba cieni komórkowych i ogólnie zaburzona morfologia jąder świadczy o zbyt długim trawieniu lub denaturacji preparatu, co moŝe być przyczyną utraty lub fragmentacji sygnałów. Barwienie obwodowe, dziury w komórkach (filtr DAPI) i/lub silnie zielone cytozolowe tło obserwowane przy uŝyciu podwójnego filtra Texas Red/FITC moŝe wskazywać na niedotrawienie, które moŝe być przyczyną utraty sygnału. Próbki takie naleŝy traktować jako niewaŝne. 7. RóŜnice w sposobie utrwalania, obróbki i zatapiania tkanek w laboratorium uŝytkownika mogą prowadzić do zmienności uzyskiwanych wyników, co powoduje konieczność przeprowadzania regularnej oceny kontroli wewnętrznych. Interpretacja wyników NaleŜy przeanalizować kilka obszarów preparatu, aby uwzględnić ewentualną niejednorodność. Wybrać obszar o równomiernie rozmieszczonych jądrach komórkowych. Rozpocząć analizę w lewej górnej ćwiartce wybranego obszaru i postępując od lewej do prawej, zliczać sygnały na granicach poszczególnych jąder, przestrzegając poniŝszych wskazówek. Nastawiać ostrość w górę i w dół, aby znaleźć wszystkie sygnały w obrębie poszczególnych jąder. Nie brać pod uwagę jąder bez sygnałów. Nie uwzględniać jąder wymagających oceny subiektywnej. Pominąć jądra dające sygnał o słabym nasileniu oraz o nieswoistym lub silnym tle. UŜytkownik musi ustalić, ile jąder naleŝy zliczyć dla kaŝdej sondy. Unikać obszarów o niejednoznacznych granicach jądra komórkowego. Ograniczenia 1. Optymalny czas inkubacji w przypadku trawienia pepsyną zaleŝy od sposobu utrwalenia tkanek i/lub grubości wycinka oraz musi zostać określony i zweryfikowany przez uŝytkownika. 2. Opis zastosowań sond FISH zamieszczono w ulotkach poszczególnych sond dołączonych do informacji o produkcie. 3. Metoda FISH to wieloetapowy proces wymagający specjalistycznego przeszkolenia w zakresie doboru odpowiednich odczynników, tkanek, sposobu utrwalania i obróbki, przygotowania preparatów FISH oraz interpretacji wyników barwienia. 4. W metodzie FISH wyniki zaleŝą od przygotowania i obróbki tkanki przed barwieniem. Niewłaściwe utrwalanie, płukanie, suszenie, ogrzewanie, krojenie preparatów lub zanieczyszczenie innymi tkankami bądź płynami moŝe wpływać na hybrydyzację sondy. Przyczyną uzyskania niezgodnych wyników moŝe być stosowanie zmiennych metod utrwalania i zatapiania lub występowanie nieprawidłowości nieodłącznie związanych z tkankami. 5. W celu uzyskania optymalnych i powtarzalnych wyników preparaty tkankowe muszą być całkowicie odparafinowane. Proces usuwania parafiny powinien być zakończony na początku procesu barwienia. (Patrz INSTRUKCJA UśYTKOWANIA, rozdział B.2). 6. NaleŜy uŝywać wyłącznie łaźni wodnej, bloku grzewczego i pieca hybrydyzacyjnego o skalibrowanych ustawieniach temperatury. UŜywanie sprzętu innego typu moŝe skutkować odparowaniem mieszanki sond podczas hybrydyzacji i musi być zatwierdzone przez uŝytkownika. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 19/28

Rozwiązywanie problemów Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 1. Brak sygnałów lub słabe sygnały 1a. Niewłaściwy czas trawienia. 1a. NaleŜy upewnić się, Ŝe badane są skrawki utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie. Wskazane moŝe być wydłuŝenie czasu trawienia, np. do 7 15 minut lub nawet dłuŝej w temperaturze 37 C. Patrz część B.3.a lub B.3.b, Etap 2, Rozwiązywanie problemów punkt 4d i 4e oraz Dodatek 2. 1b. Podczas transportu lub przechowywania zestaw naraŝony był na działanie wysokich temperatur. 1c. Nieodpowiednie warunki obróbki wstępnej. 1d. Nieodpowiednie warunki denaturacji. 1e. Nieodpowiednia temperatura hybrydyzacji. 1b. NaleŜy kontrolować warunki przechowywania. NaleŜy upewnić się, Ŝe w otrzymanej partii towaru obecny był suchy lód. Upewnić się, Ŝe fiolki 2A i 5 były przechowywane w temperaturze 2 8 C, a fiolka 5 była przechowywana w ciemności. 1c. Upewnić się, Ŝe przestrzegano zalecanej temperatury i czasu obróbki wstępnej. Ponadto w razie potrzeby moŝna zoptymalizować czas trawienia, patrz część B.3.a lub B.3.b, Etap 2. Temperatura obróbki wstępnej powinna być jak najbliŝsza punktowi wrzenia, aby sygnały były silniejsze. NaleŜy upewnić się, czy pepsyna przechowywana jest we właściwej temperaturze. Zob. część B.1. 1d. Upewnić się, Ŝe przestrzegano zalecanej temperatury i czasu denaturacji. 1e. W przypadku stosowania sond Dako FISH naleŝy przeprowadzać hybrydyzację w temperaturze 45 (±2) C. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 20/28

2. Obszary poza sygnałem 1f. Odparowanie buforu sondy w trakcie hybrydyzacji. 1g. Nieodpowiednie warunki głębokiego płukania. 1h. Mikroskop nie działa prawidłowo - ZałoŜono niewłaściwy filtr - Nieodpowiednia lampa - Przestarzała lampa rtęciowa - Wypalone filtry - Zabrudzone i/lub pęknięte soczewki kolektora - Nieodpowiedni olej immersyjny 1f. Zapewnić wystarczającą wilgotność w komorze hybrydyzacyjnej. UŜywać urządzenia Dako Hybridizer (nr kat. S2450/S2451) i pasków kontroli wilgotności Hybridizer Humidity Control Strips (nr kat. S2452). UŜyć szczeliwa Coverslip Sealant. Patrz Rozwiązywanie problemów, punkt 5a i 5b. 1g. Przestrzegać zalecanej objętości, temperatury i czasu głębokiego płukania i koniecznie zdjąć szkiełka nakrywkowe przed głębokim płukaniem. 1h. Sprawdzić mikroskop i upewnić się, Ŝe uŝywane są filtry odpowiednie dla stosowanych fluorochromów, nie są zuŝyte oraz Ŝe lampa rtęciowa jest odpowiedniego typu i nie była eksploatowana dłuŝej, niŝ wynosi jej oczekiwana Ŝywotność (patrz Załącznik 1). Do fluorescencji uŝyć właściwego olejku immersyjnego. W razie wątpliwości naleŝy skontaktować się z lokalnym przedstawicielem firmy produkującej mikroskopy. 1i. Stłumione (wyblakłe) sygnały. 1i. Unikać zbyt długiego badania pod mikroskopem i minimalizować kontakt ze światłem. 2a. Za mała ilość sondy. 2a. Upewnić się, czy objętość sondy jest wystarczająco duŝa, aby pokryć obszar pod szkiełkiem nakrywkowym. 2b. W trakcie nakładania sondy lub zatapiania pod szkiełko dostały się pęcherzyki powietrza. 2b. Unikać pęcherzyków powietrza. W razie zaobserwowania pęcherzyków usunąć je, delikatnie pukając pincetą. 2c. Słabe odparafinowanie. 2c. Upewnić się, Ŝe parafina została całkowicie usunięta ze skrawków. Zob. część B.2. 3. Nadmierne wybarwienie tła 3a. Niewłaściwy czas trawienia. Silnie zielone cytozolowe tło 3a. NaleŜy upewnić się, Ŝe badane są skrawki utrwalone (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 21/28

moŝe wskazywać na niedotrawienie. w formalinie i zatopione w parafinie Wskazane moŝe być wydłuŝenie czasu inkubacji, tj. do 7 15 minut w temperaturze 37 C. Patrz część B.3.a lub B.3.b. Etap 2, Rozwiązywanie problemów punkt 4e i Załącznik 2. 3b. Skrawki wyschły w B.3. 3b. Przestrzegać instrukcji i unikać wyschnięcia preparatów, chyba Ŝe zalecono inaczej. 3c. Niecałkowicie usunięta parafina. 3d. Za niska temperatura podczas głębokiego płukania. 3e. PrzedłuŜona ekspozycja części hybrydyzowanej na silne źródło światła. 3f. Przeterminowane szkiełka lub szkiełka nieodpowiednie mogą być przyczyną nadmiernie czerwonego zabarwienia Czerwone niebo. 3c. Stosować procedury deparafinizacji i uwodnienia, przedstawione w części B.2 3d. Upewnić się, Ŝe przestrzegano zalecanej temperatury głębokiego płukania. 3e. Unikać zbyt długiego badania pod mikroskopem i minimalizować kontakt ze światłem. 3f. UŜyć zalecanych typów szkiełek i upewnić się, Ŝe nie są przeterminowane. Patrz sekcja Skrawki zatapiane w parafinie. 4. Zaburzona morfologia jąder lub słaby odczyn jądrowy 3g. Niefluorescencyjny olejek immersyjny wymieszany ze środkiem Fluorescence Mounting Medium. 4a. Nieodpowiednie warunki obróbki wstępnej mogą być przyczyną zmętnienia lub zamazania. 4b. Gotowanie podczas obróbki wstępnej moŝe doprowadzić do zniszczenia morfologii i utraty sygnału. 4c. Nieprawidłowe trawienie enzymem Pepsyną. 3g. Podczas zatapiania uŝyć zgodnie z zaleceniami duŝych szkiełek nakrywkowych. Patrz część B.3.a lub B.3.b, Etap 5. Zapobiega to mieszaniu olejku immersyjnego ze środkiem do zatapiania, pozwala uniknąć autofluorescencji i przypadkowemu zdjęciu szkiełka nakrywkowego przez obiektyw mikroskopu. 4a. Upewnić się, Ŝe przestrzegano zalecanej temperatury i czasu obróbki wstępnej. Patrz równieŝ Rozwiązywanie problemów, punkt 4b e. 4b. Unikać gotowania. Patrz część B.3, etap 1. Patrz równieŝ Rozwiązywanie problemów, punkt 4d. 4c. NaleŜy przestrzegać zalecanych czasów inkubacji z pepsyną. Zob. sekcja B.3, Etap 2, Dodatek 2. Patrz (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 22/28

równieŝ Rozwiązywanie problemów, punkty 1a, 1c, 4d i 4e. 5. Po hybrydyzacji, szkiełko nakrywkowe silnie przylega do szkiełka podstawowego i jest trudne do usunięcia. 4d. Zbyt długie trawienie pepsyną doprowadzi do rozpuszczenia tkanki i braku sygnałów. Zbyt silne wytrawienie tkanek moŝe doprowadzić do pojawienia się cieni komórkowych lub jąder pierścieniowatych z ogólnie zaburzoną morfologią jąder. 4e. Zbyt krótkie trawienie pepsyną moŝe doprowadzić do braku sygnałów. Zbyt słabe wytrawienie tkanki moŝe być przyczyną obwodowego barwienia jąder i prześwitów w jądrach (filtr DAPI); wysokiego poziomu zielonego cytozolowego sygnału tła (podwójny filtr Texas Red/FITC). NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe jądra w tkankach zbyt słabo wytrawionych posiadają dobrą morfologię w porównaniu z tkankami wytrawionymi zbyt silnie. 4f. Za wysoka temperatura denaturacji. 4g. Nieodpowiednie warunki hybrydyzacji. 5a. Szkiełko nakrywkowe nieprawidłowo uszczelnione na szkiełku podstawowym. 4d. NaleŜy skrócić czas inkubacji z pepsyną. Patrz część B.3.a lub B.3.b, Etap 2 i Dodatek 2. Upewnić się, Ŝe uŝyto skrawków o grubości 2 6 µm. Patrz równieŝ Rozwiązywanie problemów, punkty 1a, 1c, 4b i 4e. 4e. WydłuŜ czas inkubacji pepsyny do np. 2-3 krotności zastosowanego czasu trawienia. Zob. takŝe punkty 1a, 1c 3a, 4a i 4d w tabeli Rozwiązywanie problemów. 4f. Upewnić się, Ŝe przestrzegano zalecanej temperatury denaturacji. 4g. Patrz Rozwiązywanie problemów, punkty 1f i 5b. 5a. JeŜeli szkiełko nakrywkowe silnie przylega do szkiełka podstawowego, nie stosować siły do usunięcia go. Zanurzyć szkiełko w pojemniku zawierającym rozcieńczony bufor Stringent Wash Buffer w temperaturze pokojowej na pięć minut i następnie zdjąć szkiełko. Postępować zgodnie z zaleceniami dotyczącymi uszczelniania szkiełek nakrywkowych zawartymi w części B.3.a lub B.3.b, Etap 3. Patrz równieŝ Rozwiązywanie problemów, punkty 1f i 5b. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 23/28

6. Zbyt wysoki poziom zieleni w preparacie, z uwzględnieniem obszarów bez tkanek FFPE 5b. Nieodpowiednie warunki hybrydyzacji. Mogą być przyczyną osłabienia lub braku sygnałów, zniszczenia tkanki i wybarwienia tła. 6. UŜycie przeterminowanych lub niezalecanych szkiełek 5b. Zapewnić wystarczającą wilgotność w komorze hybrydyzacyjnej. UŜyć urządzenia Dako Hybridizer (nr kat S2450/S2451) i pasków kontroli wilgotności Hybridizer Humidity Control Strips (nr kat. S2452). Postępować zgodnie z instrukcjami w ulotce dołączonej do opakowania Hybridizer Humidity Control Strips. Patrz zalecane warunki hybrydyzacji w części B.3.a lub B.3.b, Etap 3. Patrz równieŝ Rozwiązywanie problemów, punkty 1f i 5a. 6. Upewnić się, Ŝe powlekane szkiełka (Dako Silanized Slides, nr kat. S3003 lub szkiełka powlekane poli-l-lizyną) nie są przeterminowane. UWAGA: Jeśli problemu nie daje się przypisać Ŝadnej z powyŝszych przyczyn bądź jeśli zalecane postępowanie jest nieskuteczne, naleŝy się skontaktować z Działem Pomocy Technicznej Dako w celu uzyskania dalszej pomocy. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 24/28

Dodatek 1 Histology FISH Accessory Kit, nr kat. K5799 Charakterystyka mikroskopu fluorescencyjnego Firma Dako zaleca stosowanie z zestawem Histology FISH Accessory Kit wymienionego niŝej wyposaŝenia, gdy uŝywane są sondy Dako FISH: 1. Typ mikroskopu Mikroskop epifluorescencyjny. 2. Lampa Lampa rtęciowa o mocy 100 W (z reguły naleŝy wymieniać ją co 200 godzin). 3. Obiektywy Do badania przesiewowego tkanek nadają się suche obiektywy fluorescencyjne, powiększające 10X, lub fluorescencyjne z olejkiem immersyjnym, powiększające 16X. Do silnego powiększenia i zliczania sygnałów zalecane są wyłącznie obiektywy fluorescencyjne z olejkiem immersyjnym, np. 63X lub 100X. 4. Filtry Filtry są projektowane indywidualnie dla określonych fluorochromów i tak muszą być dobierane. Firma Dako zaleca uŝywanie z sondami Dako FISH konkretnego filtru DAPI razem z wysokiej jakości filtrem podwójnym Texas Red/FITC. Filtr DAPI, np. filtr Omega Optical # XF06 lub filtr Chroma # 31000. Filtr podwójny Texas Red/FITC, np. Omega Optical # XF53 lub Chroma # 51006. Filtry pojedyncze Texas Red i FITC, np. odpowiednio filtr Omega Optical # XF102-2 oraz XF202, moŝna stosować w celu potwierdzenia. Fluorochrom Częstotliwość fali wzbudzającej Częstotliwość fali emitowanej FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Do kaŝdego typu mikroskopu stosowane są charakterystyczne filtry. UŜywanie odpowiednich filtrów ma decydujące znaczenie dla interpretacji. Bardziej szczegółowe informacje moŝna uzyskać od producenta mikroskopu lub przedstawiciela firmy Dako lub na stronie internetowej Dako. 5. Olejek Niefluoryzujący olejek immersyjny Środki ostroŝności Poszczególne fluorochromy wymagają róŝnego osprzętu. W przypadku sond Dako FISH nie jest zalecana lampa rtęciowa 50 W, nie moŝna uŝywać filtrów rodaminowych i nie zaleca się uŝywania filtrów potrójnych. Mikroskop, który nie został zoptymalizowany, moŝe spowodować trudności w odczytywaniu sygnałów fluorescencyjnych. WaŜne jest, aby źródła światła nie były przeterminowane oraz były właściwie ustawione i zogniskowane. Klienci powinni monitorować stopień zuŝycia lampy rtęciowej i parametry mikroskopu oraz przestrzegać zaleceń producenta dotyczących konserwacji tych urządzeń. NaleŜy dołoŝyć starań, aby próbka była wystawiona moŝliwie najmniej na światło wzbudzające, w celu zminimalizowania zanikania fluorescencji. Zalecamy, by przed rozpoczęciem hybrydyzacji FISH omówić konfigurację konkretnego mikroskopu z przedstawicielem jego producenta lub sięgnąć do odpowiedniej literatury. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 25/28

Dodatek 2 Etap opcjonalny optymalizacja czasu trawienia enzymem Pepsyną Ten opcjonalny etap umoŝliwia ocenę wpływu trawienia pepsyną na preparat i pomaga w optymalizacji czasu trawienia w Etapie 2, Pepsynowaniu. Aby sprawdzić, czy przyjęty czas trawienia pepsyną jest wystarczający, naleŝy wypłukany i wytrawiony pepsyną skrawek tkankowy wybarwić 10 µl jodku propidyny (400 ng/ml, barwnik dostarczany przez uŝytkownika). Umieścić szklane szkiełko nakrywkowe 22 mm x 22 mm na jodku propidyny i pozwolić, by barwnik równomiernie przykrył spodnią stronę szkiełka. Inkubować przez 1 minutę. Korzystając z mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem podwójnym Texas Red/FITC (zob. Załącznik 1), ocenić czerwony odczyn jądrowy wywołany przezjodek propidyny. Jeśli trawienie trwało wystarczająco długo, powinny być widoczne czerwone jądra z dobrze zaznaczonymi brzegami. Usunąć jodek propidyny, mocząc skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer dwa razy po 3 minuty w temperaturze pokojowej (20 25 C) i przejść do części B3, Protokół wykonania odczynu, Etap 3, Sonda FISH. Jeśli jądra nadal samoistnie fluoryzują na zielono i nie zostały wybarwione na czerwono w reakcji z jodkiem propidyny, konieczne jest powtórzenie cyklu trawienia: Moczyć skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer dwa razy po 3 minuty w temperaturze pokojowej (20 25 C), aby usunąć jodek propidyny. Nanieść 5 8 kropli (250 µl) schłodzonego (2 8 C) produktu Pepsin (fiolka 2) w sposób zapewniający pokrycie próbki. Produkt Pepsin naleŝy zawsze przechowywać w temperaturze 2 8 C. Umieścić preparaty w temperaturze 37 C na wstępnie podgrzanej płycie grzejnej lub w urządzeniu Dako Hybridizer. Inkubować przez 10 minut, jeśli trawienie było zupełnie lub częściowo nieskuteczne. Czas 10 minut jest jedynie orientacyjny uŝytkownik powinien sam określić optymalny czas. Ponownie namoczyć skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer dwa razy po 3 minuty w temperaturze pokojowej (20 25 C), aby usunąć produkt Pepsin. Ponownie nanieść 10 µl jodku propidyny (400 ng/ml) na 1 minutę. Ocenić odczyn i moczyć skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer dwa razy po 3 minuty w temperaturze pokojowej (20 25 C). W razie potrzeby powtórzyć cykl lub przejść do części B.3.a lub B.3.b, Protokół barwienia, Etap 3, Sonda FISH. UWAGA: Zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 20 badań. Zastosowanie buforu Wash Buffer i Pepsyny w tym opcjonalnym etapie spowoduje zmniejszenie liczby testów, jaką moŝna wykonać przy uŝyciu jednego zestawu. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 26/28

Piśmiennictwo 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 CFR 7163, February 28, 1992. 2. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company; 1980. 3. Brown RSD, Edwards J, Bartlet JW, Jones C, Dogan A. Routine acid decalcification of bone marrow samples can preserve DNA for FISH and CGH studies in metastatic prostate cancer. J Histochem Cytochem 2002 50:113-5. 4. Alers JC, Krijtenberg P-J, Visser KJ, van Dekken H. Effect of bone decalcification procedures on DNA in situ hybridization and comparative genomic hybridization: EDTA is highly preferable to a routinely used acid decalcifier. J Histochem Cytochem 1999 47:703-9. 5. Provan AB, Hodges E, Smith AG, Smith JL. Use of paraffin wax embedded bone marrow trepine biopsy specimens as a source of archival DNA. J Clin Pathol 1992 45:763-5. 6. Sarsfield P, Wickham CL, Joyner MV, Ellard S, Jones DB, Wilkins BS. Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol Pathol 2000 53:336. 7. Reineke T, Jenni B, Abdou MT, Frigerio S, Zubler P, Moch H, Tinguely M. Ultrasonic decalcification offers new perspectives for rapid FISH, DNA, and RT-PCR analysis in bone marrow trephines. Am J Surg Pathol 2006 30: 892-6. 8. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; 1981. (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 27/28

Objaśnienie symboli Nu mer kata lo gowy Temperatura przechowywania Numer serii Wyrób medyczn y do diagnostyki in vitro Nie wystawiać na działa nie promieni słon ecznych (zob. rozd ział Prze chowywanie) ZuŜyć przed Spra wdzić w instrukcji uŝycia Zawiera ilość materiału wystarczającą do <n > badań Producent Piktogram GHS (przestrzegać zaleceń zawartych w części dotyczącej środkó w ostroŝności) Piktogram GHS (przestrzegać zaleceń zawartych w części do tyc zącej środ ków ostroŝności) Piktogram GHS (przestrzegać za le ceń zawartych w części dotyczącej środków ostroŝności) Piktogram GHS (przestrzegać zaleceń zawartych w części dotyczącej środkó w ostroŝności) Piktogram GHS (przestrzegać zaleceń zawartych w części do tyc zącej środ ków ostroŝności) Wyprodukowano przez: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 Tel. +45 44 85 95 00 DK-2600 Glostrup Fax +45 44 85 95 95 Dania www.dako.com (128942-001) P04094PL_02_K579911-2/2015.10 s. 28/28