HUMORALNA ODPOWIEDŹ NA REKOMBINOWANE BIAŁKA YEUB, AIL, YADA I INV PAŁECZEK YERSINIA ENTEROCOLITICA W PRZEBIEGU JERSINIOZY U LUDZI

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 21-32 Waldemar Rastawicki HUMORALNA ODPOWIEDŹ NA REKOMBINOWANE BIAŁKA YEUB, AIL, YADA I INV PAŁECZEK YERSINIA ENTEROCOLITICA W PRZEBIEGU JERSINIOZY U LUDZI Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski Metodami rekombinacji genetycznej uzyskano preparaty białek YeuB, Ail, YadA i Inv, których użyto jako antygen w odczynie ELISA i western-blotting do badania humoralnej odpowiedzi w przebiegu jersiniozy. Stwierdzono, że przeciwciała klasy IgA, IgG i IgM dla wszystkich użytych antygenów występowały istotnie częściej u osób z jersiniozą niż u krwiodawców. Odczyn ELISA, w którym jako antygeny zastosowano uzyskane rekombinowane białka, odznaczał się wysoką swoistością i niską czułością w stosunku do odczynu ELISA z antygenem białek wydzielniczych Yop. Czynniki zjadliwości pałeczek Y. enterocolitica kodowane są przez geny umiejscowione zarówno na chromosomie jak i na plazmidzie tych drobnoustrojów. Do jednych z najważniejszych genów zlokalizowanych na chromosomie, odpowiedzialnych za zjadliwość pałeczek Yersinia należą geny inv, ail, yst, myf, yeub, odpowiedzialne odpowiednio za produkcję białka inwazyny (Inv), Ail, enterotoksyny, białka Myf i YeuB (Yersinia-ureasae B). Plazmid zjadliwości pyv o wielkości 70 76-kb koduje z kolei szereg białek wydzielniczych Yop, biorących udział w chorobotwórczości pałeczek Yersinia, wytwarzanych i uwalnianych do podłoża w warunkach hodowli drobnoustrojów w temperaturze 37 o C oraz w pożywce pozbawionej jonów wapnia (5, 9). Innym, nie mniej istotnym czynnikiem zjadliwości zarazka kodowanym przez plazmid pyv, jest białko błony zewnętrznej YadA o masie 44,1-47,1 kda (2). Jak wynika z przeglądu piśmiennictwa istnieje znaczna liczba publikacji dotycząca humoralnej odpowiedzi człowieka na lipopolisacharydy, całe komórki pałeczek Yersinia bądź oczyszczone białka Yop (6, 7, 11, 14, 15). Istnieją natomiast tylko sporadyczne doniesienia mówiące o humoralnej odpowiedzi osób z jersiniozą na inne białka pałeczek Yersinia biorące aktywny udział w patogenezie jersiniozy (1, 4). Celem pracy była ocena humoralnej odpowiedzi na białka YeuB, Ail, YadA i Inv w przebiegu jersiniozy u ludzi w zależności od wieku osób chorych, okresu choroby i zespołu objawów klinicznych.

22 W. Rastawicki Nr 1 MATERIAŁ I METODY Badane grupy ludzi. Osoby chore, podejrzane w badaniu klinicznym o jersiniozę. Do badań przeznaczono próbki surowicy uzyskane od 193 osób chorych, podejrzanych o jersiniozę. Osoby klinicznie zdrowe. Zbadano próbki surowicy uzyskane od 85 klinicznie zdrowych, dorosłych osób w wieku powyżej 20 lat (krwiodawców). Próbki surowicy immunizowanych królików. Badaniu poddano próbki surowicy królików immunizowanych następującymi szczepami bakteryjnymi: Y. enterocolitica O3 (wariant pyv+ i wariant pyv-), Y. enterocolitica O9, Y. enterocolitica O8, Y. enterocolitica O5,27, Y. enterocolitica O5, Y. enterocolitica O6, Y. enterocolitica O7,8, Y. pseudotuberculosis I. Odczyn immunoenzymatyczny ELISA. Odczyn ELISA z antygenem białek wydzielniczych Yop przeprowadzano według procedury podanej uprzednio (14). Identyczną procedurę z niezbędnymi modyfikacjami zastosowano również w przypadku wykonywania odczynu ELISA, w którym jako antygen zastosowano rekombinowane białka YadA, YeuB, Ail i Inv. Preparatyka białek YadA, YeuB, Ail i Inv metodą rekombinacji genetycznej. Fragmenty genów kodujących poszczególne białka pałeczek Yersinia enterocolitica O3 amplifikowano techniką PCR przy użyciu starterów przedstawionych w tabeli I. Produkt PCR rozdzielono w 1% agarozie LMP (BioRad) w celu sprawdzenia wielkości amplifikowanego DNA i jego oczyszczenia. Następnie odzyskano DNA z żelu agarozowego przy użyciu zestawu Gel-out firmy A&A Biotechnology i określono stężenie DNA przy użyciu spektrofotometru DU70 firmy Beckman. Klonowanie produktów PCR do wektora pet30ek/lic i transformację kompetentnych komórek E. coli BL21 (DE3) przeprowadzono zgodnie z zaleceniami producenta (firma Novagen). Transformowany plazmidem pet30ek/lic szczep E. coli BL21 (DE3) namnażano w pożywce LB z dodatkiem 30 mg/l kanamycyny w temp. 37 o C do gęstości OD=0,5 przy 600 nm. Następnie dodawano IPTG (isopropyl-d-thiogalactopyranoside) do końcowego stężenia 1 mm i dalej inkubowano do gęstości OD=1,0 przy długości fali światła 600 nm. Zawiesinę bakteryjną wirowano przez 20 minut przy 7.700 x g. Uzyskany osad, w przypadku preparatyki białek YeuB, zawieszano w lodowatym buforze 1xHis-Bind, rozbijano ultradźwiękami w dezyntegratorze przez 6 minut a następnie wirowano przy 20.000 x g przez 20 minut. Uzyskany supernatant nakładano na kolumny firmy Novagen służące do izolacji i oczyszczania białek z domeną polihistydynową przy wykorzystaniu metod chromatografii bio-powinowactwa. Białka YadA, Inwazynę i Ail uzyskiwano w warunkach denaturujących. W tym celu, osad bakteryjny zawieszano w niewielkiej objętości lodowatego buforu 1 x His-Bind, homogenizowano w dezyntegratorze przez 1 minutę i wirowano przez 15 minut przy obrotach 5.000 x g. Czynność tą powtarzano 3-krotnie. Następnie uzyskany osad zawieszano w lodowatym buforze 1 x His-Bind o ph 7,9 zawierającym 6 M mocznika i inkubowano w łaźni lodowej, przy wytrząsaniu, przez 1 godzinę. Po zwirowaniu nierozpuszczonych białek, klarowny supernatant nakładano na kolumienki i oczyszczano podobnie jak poprzednie białka, z tym, że do wszystkich buforów dodawano mocznika w stężeniu zalecanym przez producenta zestawu Novagen. Do izolacji każdego białka używano osobnych kolumienek. Przed użyciem do opłaszczania płytek polistyrenowych preparat białek rozcieńczano buforem węglanowym o ph 9,6 do zawartości białka około 10 mg/ml.

Nr 1 Humoralna odpowiedź na rekombinowane białka YeuB, Ail, YadA i Inv pałeczek Y. enterocolitica Odczyn western-immunoblotting. Posłużono się tym samym preparatem białek co w odczynie ELISA (białka rekombinowane Ail, YadA, YeuB, Inv). Elektroforezę w 12,5% żelu poliakrylamidowym (płytki o wymiarach 160x190x1,5 mm) prowadzono przy natężeniu prądu 60 ma przez 3,5 godziny. Po zakończeniu elektroforezy żele barwiono barwnikiem Coomassie brilliant blue R250. W celu określenia masy cząsteczkowej elektroforetycznie rozdzielonych białek w każdej serii doświadczenia rozdziałowi poddawano standard masowy firmy Bio-Rad Prestained SDS-Page standard, Low-Range (Nr kat. 161-0305) bądź też SDS-PAGE Broad Range (Nr kat. 161-0318). Przeniesienie ektroforetyczne rozdzielonych białek wydzielniczych Yop na membranę Immobilon PVD (Millipore) wykonywano przy natężeniu 300 ma przez 3 godziny. Po zablokowaniu receptorowej powierzchni membrany 5% roztworem odtłuszczonego krowiego mleka, arkusze inkubowano z ludzkimi, bądź króliczymi surowicami rozcieńczonymi w PBS w stosunku 1:100. Po dokładnym przemyciu paski inkubowano w roztworze odpowiedniego koniugatu (kozie przeciwciała znakowane peroksydazą chrzanową) a następnie w roztworze benzydyny w buforze cytrynianowym z dodatkiem perhydrolu. Reakcję barwną przerywano przez przeniesienie pasków do wody destylowanej. W celu wykazania swoistości badanych białek przeniesione elektroforetycznie na membranę rozdzielone białka Ail, YadA, YeuB, Inv poddano reakcji również z mysimi, monoklonalnymi przeciwciałami IgG 1 (Novagen) dla sekwencji His-Tag kodowanej przez ekspresyjny wektor użyty do klonowania. Przeciwciała te rozpoznają 5 występujących po sobie reszt histydynowych, bez względu na skład sąsiadujących aminokwasów, wiążąc się specyficznie z N-terminalną sekwencją His-Tag. Statystyczne opracowanie wyników. Statystyczną analizę uzyskanych wyników przeprowadzono przy użyciu programu komputerowego Statgraphics wer. 4.1 oraz Instat (Instant Biostatistic). tm WYNIKI Charakterystyka rekombinowanych białek YeuB, Ail, YadA i Inv. Elektroforetyczny rozdział wszystkich rekombinowanych białek, jednocześnie z dwoma różnymi wzorcami masowymi firmy BioRad, w 12,5% żelu poliakrylamidowym umożliwił określenie masy cząsteczkowej badanych białek. I tak, przybliżona masa cząsteczkowa białka YeuB wynosiła 32,5 kda, białka Ail 24,5-25,0 kda, białka YadA 50 kda i białka inwazyny (Inv) około 48,0 kda (Rycina 1). W następnym etapie charakterystyki uzyskanych rekombinowanych białek wykazano, że wszystkie białka posiadały sekwencję His-Tag, a masa cząsteczkowa białek wyliczona na podstawie obrazu uzyskanego w odczynie western-immunoblotting odpowiadała dokładnie masie prążków uzyskanych w elektroforezie w żelu poliakrylamidowym. W celu zbadania antygenowej swoistości uzyskanych białek poddano je reakcji w odczynie western-immunoblotting z 2 próbkami surowicy osób chorych z bakteriologicznie i serologicznie potwierdzoną jersiniozą wywołaną przez pałeczki Y. enterocolitica z grupy O3 i O8, oraz z 2 próbkami surowicy osób klinicznie zdrowych, nie zawierających przeciwciał dla somatycznych antygenów i białek wydzielniczych Yop, a także z 2 odpornościowymi surowicami króliczymi jedną o wysokim poziomie przeciwciał dla Y. enterocolitica O3 23

24 W. Rastawicki Nr 1 113 kda 92,0 kda 52,3 kda 35,3 kda 28,7 kda 21,3 kda 1 2 3 4 5 6 Rycina 1. Elektroforetyczny obraz rekombinowanych białek rozdzielonych w 12,5% żelu poliakrylamidowym barwionym Commasie blue. 1 marker masowy (low range prestained, Bio-Rad), 2 marker masowy (Broad range, Bio-Rad), 3 białko YeuB, 4 białko Ail, 5 białko YadA, 6 białko Inv. i drugą, dla Y. pseudotuberculosis I oraz z 2 surowicami królików nie immunizowanych. Wyniki uzyskane w odczynie western-immunoblotting wykazały, że wszystkie badane białka reagowały zarówno z surowicami osób chorych, z wysokim poziomem przeciwciał dla antygenów pałeczek Y. enterocolitica O3 i O8 jak też z króliczymi surowicami odpornościowymi. Nie wykazano takich reakcji z dwiema próbkami uzyskanymi od osób klinicznie zdrowych ani z surowicami królików nie immunizowanych. Masa cząsteczkowa białek, które reagowały z surowicami, odpowiadała masie białek rozdzielonych w żelu poliakrylamidowym (Rycina 2). Tabela I Oligonukleotydy startery genów kodujących białka Ail, Inwazynę, YadA oraz YeuB pałeczek Yersinia. Gen Białko Starter Sekwencja nukletydów startera Wielkość 5` 3` fragmentu ail Ail aillf gacgacgacaagattattggttatgcacaaagccatg aillr gaggagaagcccggtttagaatcgataccctgcacc 478 bp inva Inwazyna invl1f gacgacgacaagatagaagcgttagagaaccccgctg invl1r gaggagaagcccggtataggtattgaccgccgcttc 1177 bp yada YadA YadALf gacgacgacaagatcccaaatgctgatcctgctttgg YadALr gaggagaagcccggtgtacatgacatccgaggaacc 1251 bp yeub YeuB yeublf gacgacgacaagatgagcacaaagacaaatagcacc yeublr gaggagaagcccggtcgatttgaagccacgttcagc 516 bp

Nr 1 Humoralna odpowiedź na rekombinowane białka YeuB, Ail, YadA i Inv pałeczek Y. enterocolitica 25 113 kda 92 kda 52,3 kda 35,3 kda 28,7 kda 21,3 kda M 1 2 3 4 Rycina 2. Wynik reakcji w odczynie western-immunoblotting rekombinowanych białek pałeczek Yersinia z próbką surowicy uzyskaną od osoby chorej na jersiniozę. M marker masowy, 1 białko YeuB, 2 białko Ail, 3 białko YadA, 4 białko Inv Tabela II Występowanie przeciwciał dla rekombinowanych białek YeuB, Ail, Yad A, Inv oraz wydzielniczych białek Yop w próbkach surowicy królików immunizowanych zawiesiną pałeczek Y. enterocolitica i Y. pseudotuberculosis I. Nr Zawiesina Miano przeciwciał w klasie IgA+G+M dla białek: drobnoustrojów użyta do immunizacji królików YeuB Ail Yad Inv Yop 1 Y. ent. O3 pyv+ 605 143 184 131 1.234 2 Y. ent. O3 pyv+ 750 125 198 161 2.087 3 Y. ent. O3 pyv- 459 112 0 218 0 4 Y. ent. O3 pyv- 370 321 0 138 0 5 Y. ent. O5,27 349 136 117 162 403 6 Y. ent. O5,27 320 147 118 155 295 7 Y. ent.o8 242 190 145 211 366 8 Y. ent.o8 256 124 196 105 392 9 Y. ent.o9 100 114 194 116 122 10 Y. ent.o9 110 147 131 193 351 11 Y.pst. I 123 242 113 143 240 12 Y.pst. I 135 154 187 100 470 13 Y. ent. O5 5 39 16 62 0 14 Y. ent. O5 3 27 18 41 0 15 Y. ent.o7,8 56 54 66 30 0 16 Y. ent.o7,8 27 66 67 35 0 * Pałeczki Y. enterocolitica O3 użyte były w dwóch wariantach: z plazmidem zjadliwości pyv+ i bez plazmidu pyv-. Pozostałe szczepy zjadliwe tylko w wariancie z plazmidem pyv+.

26 W. Rastawicki Nr 1 Dalszą analizę swoistości uzyskanych rekombinowanych białek, jak również preparatu wydzielniczych białek Yop, przeprowadzono przy użyciu odczynu ELISA badając poziom swoistych przeciwciał w próbkach surowicy królików nie immunizowanych i immunizowanych pałeczkami Y. enterocolitica z grup serologicznych O3, O5,27, O8, O9, O5, O6, O7,8 oraz pałeczkami Y. pseudotuberculosis I. Pałeczki Y. enterocolitica O3 użyte były do immunizacji królików w dwóch wariantach: z plazmidem zjadliwości (pyv+) i bez plazmidu (pyv-). Pozostałe szczepy zjadliwe tylko w wariancie z plazmidem pyv. Przeprowadzone badania nie wykazały obecności przeciwciał dla rekombinowanych białek jak również dla białek wydzielniczych Yop pałeczek Yersinia u królików nie immunizowanych. W próbkach surowicy uzyskanych od królików immunizowanych pałeczkami Y. enterocolitica uważanymi za zjadliwe dla człowieka, posiadającymi plazmid zjadliwości pyv (Y. enterocolitica O3, O8, O9, O5,27 oraz Y. pseudotuberculosis I), stwierdzono występowanie przeciwciał dla wszystkich białek kodowanych chromosomalnie (białka YeuB, Ail, Inv) jak i plazmidowo (białka Yad i Yop) (Tabela II). W przypadku królików immunizowanych pałeczkami Y. enterocolitica O3 pozbawionymi plazmidu zjadliwości (wariant pvv-) stwierdzono występowanie przeciwciał wyłącznie dla białek kodowanych przez chromosom pałeczek Yersinia. W surowicy królików immunizowanych pałeczkami Y. enterocolitica należącymi do grup serologicznych O5, O6 i O7,8, uważanymi za niepatogenne dla człowieka, nie wykryto przeciwciał dla białek Yop, natomiast przeciwciała dla rekombinowanych białek YeuB, Ail, Yad i Inv występowały w niskich mianach. Występowanie i poziom przeciwciał w odczynie ELISA dla rekombinowanych białek YeuB, Ail, YadA i Inv u osób z podejrzeniem jersiniozy i krwiodawców. W grupie 193 osób chorych, podejrzanych w badaniu klinicznym o jersiniozę stwierdzono statystycznie istotnie częstsze występowanie przeciwciał dla rekombinowanych białek YeuB, Ail, YadA i Inv niż w grupie 85 klinicznie zdrowych osób (Tabela III). Generalnie, u osób z bólami brzucha i rumieniem guzowatym przeciwciała klasy IgA, IgG i IgM dla rekombinowanych białek wykrywano częściej niż u osób z zapaleniem stawów. Najczęściej u osób z bólami brzucha i zapaleniem stawów wykrywano przeciwciała dla białka Inv (odpowiednio 58,7% i 50,0%) a u osób z rumieniem guzowatym przeciwciała dla białka YadA (58,3%) oraz białek Ail i Inv (50,0%). Przeprowadzone badania pozwoliły stwierdzić, że częstość występowania przeciwciał w mianie diagnostycznie znamiennym dla białek YeuB, Ail, YadA i Inv rosła wraz z wiekiem badanych osób, osiągając najwyższe wartości u osób z grupy wiekowej 21-40 lat. U osób z tej grupy wiekowej przeciwciała dla wszystkich rekombinowanych białek osiągały również najwyższe poziomy miana. Ocenę czułości i swoistości odczynu ELISA, w którym jako antygen zastosowano rekombinowane białka YeuB, Ail, YadA i Inv w odniesieniu do wyników odczynu ELISA z antygenem białek wydzielniczych Yop przedstawiono w tabeli IV. Generalnie, odczyn ELISA z rekombinowanymi białkami charakteryzował się niską czułością i wysoką swoistością w porównaniu do wyników uzyskanych w odczynie ELISA z antygenem białek wydzielniczych Yop. Jak wynika z analizy poszczególnych przypadków chorobowych odpowiedź humoralna w przebiegu jersiniozy może mieć różny obraz. Obserwuje się przypadki klasyczne, gdy w pierwszej badanej próbce surowicy uzyskanej zazwyczaj w ciągu pierwszego bądź dru-

Nr 1 Humoralna odpowiedź na rekombinowane białka YeuB, Ail, YadA i Inv pałeczek Y. enterocolitica 27 Tabela III Występowanie przeciwciał dla rekombinowanych białek YeuB, Ail, YadA, Inv oraz białek wydzielniczych Yop u 193 osób chorych, podejrzanych o jersiniozę, u których wykryto przeciwciała dla somatycznych antygenów pałeczek Y. enterocolitica i/lub białek wydzielniczych Yop oraz u 85 osób zdrowych (krwiodawców). Badana grupa osób (liczba) Osoby z objawami bólów brzucha L = 121 Osoby z zapaleniem stawów L = 60 Osoby z rumieniem guzowatym L = 12 Krwiodawcy L = 85 Antygen Liczba i odsetek osób, u których wykryto przeciwciała w mianie diagnostycznie znamiennym w klasie: IgA IgG IgM IgA lub IgG lub IgM L (%) Chi 2 p L (%) Chi 2 p L (%) Chi 2 p L (%) Chi 2 p YeuB 21 (17,4) 8,0 0,004 29 (24,0) 10,6 <0,001 39 (32,2) 23,6 <0,001 61 (50,4) 40,8 <0,001 Ail 28 (23,1) 9,8 <0,001 28 (23,1) 9,8 <0,001 42 (34,7) 24,2 <0,001 61 (50,4) 35,8 <0,001 YadA 27 (22,3) 7,5 0,006 26 (21,5) 6,9 0,008 28 (23,1) 13,5 <0,001 51 (42,1) 22,5 <0,001 Inv 25 (20,7) 9,2 0,002 42 (34,7) 19,8 <0,001 49 (40,5) 29,1 <0,001 71 (58,7) 49,1 <0,001 YeuB 9 (15,0) 4,6 0,03 10 (16,7) 3,3 0,06 7 (11,7) 2,4 > 0,05 12 (20,0) 4,2 0,03 Ail 10 (16,7) 3,3 0,06 10 (16,7) 3,3 0,06 8 (13,3) 2,4 > 0,05 22 (36,7) 14,3 <0,001 YadA 13 (21,7) 5,4 0,02 14 (23,3) 6,5 0,01 6 (10,0) 1,5 >0,05 20 (33,3) 9,9 0,001 Inv 17 (28,3) 14,0 <0,001 14 (23,3) 6,5 0,01 11 (18,3) 4,3 0,03 30 (50,0) 27,8 <0,001 YeuB 2 (16,7) - >0,05 4 (33,3) - 0,01 4 (33,3) - 0,004 5 (41,7) - 0,003 Ail 4 (33,3) - 0,01 5 (41,7) - 0,002 2 (16,7) - >0,05 6 (50,0) - 0,001 YadA 5 (41,7) - 0,003 5 (41,7) - 0,003 2 (16,7) - >0,05 7 (58,3) - <0,001 Inv 4 (33,3) - 0,007 4 (33,3) - 0,01 3 (25,0) - 0,05 6 (50,0) - 0,001 YeuB 3 (3,5) - - 5 (5,9) - - 3 (3,5) - - 6 (7,1) - - Ail 5 (5,9) - - 5 (5,9) - - 4 (4,7) - - 8 (9,4) - - YadA 6 (7,1) - - 6 (7,1) - - 3 (3,5) - - 9 (10,6) - - Inv 4 (4,78) - - 6 (6,0) - - 5 (5,9) - - 8 (8,4) - -

28 W. Rastawicki Nr 1 Tabela IV Czułość i swoistość odczynu ELISA, w którym jako antygen zastosowano rekombinowane białka YeuB, Ail, YadA, Inv w porównaniu do odczynu ELISA, w którym jako antygen zastosowano wydzielnicze białka Yop. Odczyn ELISA Czułość (%) Swoistość (%) z antygenem IgA IgG IgM IgA IgG IgM YeuB 22,1 24,7 28,3 95,6 96,7 94,6 Ail 26,1 24,7 29,3 97,1 95,4 95,5 YadA 32,7 28,2 22,9 95,5 95,6 95,6 Inv 26,6 35,2 38,3 95,8 92,3 93,6 giego tygodnia od wystąpienia objawów klinicznych nie wykrywa się przeciwciał dla białek YeuB, Ail, YadA i Inv, a następnie ich poziom gwałtownie narasta, lub gdy bezpośrednio po wystąpieniu objawów klinicznych, w pierwszej badanej próbce surowicy chorego stwierdza się znaczny ich poziom, a następnie obserwuje się stopniowy spadek miana przeciwciał. Taka dynamika przeciwciał najczęściej obserwowana była w przypadku powikłań jersiniozy, takich jak reaktywne zapalenie stawów i rumień guzowaty oraz w tych przypadkach z objawami ze strony układu pokarmowego, w których doszło już do powiększenia węzłów chłonnych krezki, objawiających się klinicznie intensywnym bólem w prawym dole biodrowym. DYSKUSJA Głównym celem podjętych badań było uzyskanie metodami inżynierii genetycznej wybranych białek pałeczek Y. enterocolitica biorących aktywny udział w patogenezie jersiniozy oraz ocena humoralnej odpowiedzi człowieka na te antygeny w przebiegu zakażenia. Jednym z białek, które uzyskano metodą rekombinacji genetycznej w przeprowadzonych badaniach było białko YeuB. We wcześniejszych badaniach Mertz i wsp. (12) opisali u szczepów Y. enterocolitica O3 białko o masie 19 kda, które po dostawowym wprowadzeniu szczurom indukowało u nich stan zapalny stawów. Autorzy ci wykryli również odczynem ELISA obecność przeciwciał w mianie diagnostycznie znamiennym (x + 3SD) dla tego białka u 43% osób chorych z udokumentowanym zakażeniem wywołanym przez pałeczki Y. enterocolitica O3. Co ciekawe nie stwierdzono obecności tych przeciwciał o osób zakażonych pałeczkami Y. enterocolitica należącymi do innych niż O3 grup serologicznych. W następnych latach, Skurnik i wsp. (16) sklonowali to białko i zidentyfikowali go jako małą β-podjednostkę ureazy pałeczek Y. enterocolitica (białko YeuB). Według tych autorów, białko to po uwolnieniu się z cytoplazmy komórek bakteryjnych może funkcjonować jako artrogenny lub immunogenny czynnik oraz wiązać się do cząsteczki HLA-B27 obecnej na limfocytach T. Jednakże późniejsze badania przeprowadzone przez Gripenberg-Lerche i wsp. (8) na mutantach pałeczek Y. enterocolitica O3 i O8 pozbawionych białka YeuB udowodniły, że białko to nie jest konieczne do indukcji zapalenia stawów u szczurów. Odpowiedź humoralną na białko o masie cząsteczkowej 19 kda pałeczek Y. enterocolitica (YeuB) osób z reaktywnym zapaleniem stawów badali również Appel i wsp. (1). Przeciwciała klasy IgG dla białka YeuB wykrywali u 93% osób z reaktywnym zapaleniem stawów i 55% osób z niesklasyfikowanym seronegatywnym zapaleniem stawów. Przeciwciała klasy IgA dla białka YeuB wykrywali odczynem western-immunoblotting odpowied-

Nr 1 Humoralna odpowiedź na rekombinowane białka YeuB, Ail, YadA i Inv pałeczek Y. enterocolitica nio u 56% i 36% osób. U osób z zapaleniem stawów, wywołanym przez inne niż pałeczki Yersinia czynniki etiologiczne, jak również u osób zdrowych przeciwciała dla białka YeuB wykrywano w podobnym odsetku: przeciwciała klasy IgG u 26% a przeciwciała klasy IgA u 8% badanych osób. Przeprowadzone równolegle badania odczynem ELISA wykazały obecność przeciwciał klasy IgG dla wydzielniczych białek Yop u 62% osób z reaktywnym zapaleniem stawów i 46% z niesklasyfikowanym seronegatywnym zapaleniem stawów a przeciwciał klasy IgA odpowiednio u 46% i 35% osób. W badaniach tych u 32% osób z grupy kontrolnej wykrywano przeciwciała klasy IgG natomiast u 13% przeciwciała klasy IgA. U prawie wszystkich osób, u których występowały przeciwciała dla białka YeuB występowały także przeciwciała dla wydzielniczych białek Yop. W badaniach własnych wykorzystano sekwencję nukleotydów genu yeub kodującego białko YeuB, zamieszczoną przez Skurnik i wsp. (16) w Gen-Bank (Z18865). Przeprowadzone badania odczynem western-immunoblotting i ELISA wykazały obecność przeciwciał dla białka YeuB w próbkach surowicy wybranych osób z jersiniozą wywołaną zarówno przez pałeczki Y. enterocolitica O3, O8, O9 jak i Y. pseudotuberculosis I. Przeciwciała te znacznie częściej i w wyższych mianach wykrywano jednak u chorych osób z objawami bólów brzucha (43,3%) i rumienia guzowatego (41,7%) niż u osób z jersiniozą powikłaną zapaleniem stawów (16,7%). Taki obraz humoralnej odpowiedzi sugeruje, że białko YeuB nie jest charakterystyczne wyłącznie dla pałeczek Y. enterocolitica O3, a wykrycie w badanych próbkach surowicy obecności przeciwciał dla tego białka nie jest skorelowane z wystąpieniem u tych osób objawów zapalenia stawów. Innym niezmiernie interesującym białkiem, które uzyskano metodą rekombinacji genetycznej, jest białko inwazyna (Inv) kodowane przez chromosomalny gen inv. Przeprowadzone przez Young i wsp. (18) sekwencjonowanie genu inv u pałeczek Y. enterocolitica i Y. pseudotuberculosis wykazało 73% podobieństwo w budowie nukleotydowej tego genu u obydwu drobnoustrojów oraz 77% podobieństwo sekwencji aminokwasowej kodowanych białek. Inwazyna u pałeczek Y. pseudotuberculosis posiada masę 103 kda a u pałeczek Y. enterocolitica masę 92 kda (10, 18,). Białko to znajduję się w błonie zewnętrznej ściany komórkowej a jego produkcja zachodzi w temperaturze poniżej 30 o C (10, 13). Fortineau i wsp. (4) uzyskali białko inwazynę o masie 120 kda klonując gen inv pałeczek Y. pseudotuberculosis do szczepu E. coli J:L369. W swoich badaniach sprawdzali humoralną odpowiedź na inwazynę u 15 osób chorych na jersiniozę oraz u myszy zakażonych doustnie zjadliwymi szczepami pałeczek Y. pseudotuberculosis. Swoistość uzyskanego białka sprawdzali następnie w odczynie western-immunoblotting z monoklonalnymi przeciwciałami uzyskanymi poprzez immunizację myszy szczepem E. coli wykazujących nadprodukcję natywnej inwazyny. Surowice kontrolne, uzyskane od zdrowych, nowonarodzonych myszy nie wykazywały reakcji z klonowanym białkiem. W żadnej surowicy uzyskanej zarówno od osób chorych, zakażonych pałeczkami Y. enterocolitica i Y. pseudotuberculosis jak i immunizowanych myszy nie wykryli przeciwciał dla inwazyny. Według tych autorów, brak przeciwciał dla tego białka wynika z faktu, że ekspresja inwazyny zachodzi wyłącznie w temperaturze poniżej 30 o C. Tak więc, pałeczki Yersinia dzięki obecności inwazyny wyprodukowanej jeszcze przed wniknięciem drobnoustrojów do organizmu człowieka przenikają przez nabłonek jelitowy i dostają się do tkanki limfatycznej gdzie w temperaturze 37 o C nie zachodzi już synteza tego białka i jego prezentacja układowi immunologicznemu (4). 29

30 W. Rastawicki Nr 1 W badaniach własnych przeprowadzonych odczynem western-immunoblotting jak i odczynem ELISA przy użyciu jako antygenu rekombinowanego białka Inv uzyskano odmienne wyniki niż w pracy Fortineau i wsp. (4). Przeciwciała te wykryto zarówno w surowicy królików immunizowanych pałeczkami Y. enterocolitica i Y. pseudotuberculosis I jak również w surowicy osób z jersiniozą, z wysokim poziomem przeciwciał dla somatycznych antygenów pałeczek Y. enterocolitica i Y. pseudotuberculosis I oraz białek wydzielniczych Yop. Częstość występowania przeciwciał dla rekombinowanego białka Inv u osób jersiniozą z objawami bólów brzucha, zapalenia stawów i rumienia guzowatego była dość wysoka i wahała się od 41,7% do 50,4%. Porównując wyniki badań własnych i Fortineau i wsp. (4) nasuwa się przypuszczenie, że obserwowane różnice w obydwu doświadczeniach mogły wynikać z liczby badanych próbek surowicy. W dostępnym piśmiennictwie brak jest doniesień na temat humoralnej odpowiedzi człowieka na białka Ail i YadA. Uzyskane wyniki badań dowodzą jednak, że w przebiegu jersiniozy wytwarzane są przeciwciała dla tych białek. Co ciekawe, poziom przeciwciał dla wszystkich rekombinwanych białek nie był ściśle skorelowany z poziomem przeciwciał dla białek wydzielniczych Yop. I tak, u niektórych chorych, z wysokim poziomem przeciwciał dla białek Yop, nie stwierdzano podwyższonego poziomu przeciwciał dla rekombinowanych białek YeuB, Ail, Inv i Yad. Z drugiej strony, przeciwciała dla tych białek występowały jedynie sporadycznie u klinicznie zdrowych osób. Podsumowując wyniki badań należy stwierdzić, że wysoka swoistość rekombinowanych białek YeuB, Ail, Inv i Yad wskazuje na ich przydatność w odwoławczych badaniach humoralnej odpowiedzi na antygeny pałeczek Yersinia. Niestety, ze względu na niską czułość odczynu ELISA wykonywanego przy ich zastosowaniu, nie można polecić ich do rutynowej serodiagnostyki jersiniozy. W. Rastawicki HUMORAL RESPONSE TO RECOMBINANT YEUB, AIL, YADA AND INV PROTEINS OF YERSINIA ENTEROCOLITICA IN PATIENTS WITH YERSINIOSIS SUMMARY Recombinant YeuB, Ail, YadA and Inv proteins of Y. enterocolitica were expressing in E. coli BL21 (DE3) using the pet-30 Ek/LIC expression vector. Purification was accomplished by immobilized metal (Ni2+) affinity column chromatography (His-trap). The study population consisted of 193 patients with Y. enterocolitica infection and 85 blood donors. The results of the study revealed that antibodies to all recombinant proteins in diagnostically significant titers were diagnosed only in about half of the tested patients with yersiniosis confirmed by routine ELISA with Yop proteins as antigen. However, statistical analysis of the results showed that the frequency of detecting antibodies among the patients with yersiniosis was significantly higher in relation to blood donors (P<0.05). All the patients showed a roughly parallel development of the IgA, IgG and IgM-class antibodies during the acute phase of the infection. A maximum level of all three classes of immunoglobulins was registered during the second or third week after the beginning of clinical symptoms. More frequently the elevated antibody levels were detected among patients with gastrointestinal symptoms than with reactive arthritis.

Nr 1 Humoralna odpowiedź na rekombinowane białka YeuB, Ail, YadA i Inv pałeczek Y. enterocolitica PIŚMIENNICTWO 31 1. Appel H, Mertz A, Distler A i inni. The 19 kda protein of Yersinia enterocolitica O3 is recognized on the cellular and humoral level by patients with Yersinia induced reactive arthritis. J Rheumatol 1999; 26: 1964-71. 2. Bölin I, Norlander L, Wolf-Watz H. Temperature-inducible outer membrane protein of Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica is associated with the virulence plasmid. Infect Immun 1982; 37: 506-12. 3. Bottone EJ. Yersinia enterocolitica: overview and epidemiologic correlates. Microbes Infect 1999; 1: 323-33. 4. Fortineau N, Luc Beretti J, Berche P, Simonet M. Lack of antibody response to invasin in humans with Yersiniosis. Clin Diagnc Lab Immunol 1994, 1: 235-7. 5. Gemski P, Lazere JR, Casey T. Plasmid associated with pathogenicity and calcium dependency of Yersinia enterocolitica. Infect Immun 1980; 27: 682-5. 6. Granfors K, Viljanen MK, Toivanen A. Measurement of immunoglobulin M, immunoglobulin G and immunoglobulin A antibodies against Yersinia enterocolitica by enzyme-linked immunosorbent assay: comparison of lipopolysaccharide and whole bacterium as antigen. J Clin Microbiol 1981; 14: 6-14. 7. Granfors K, Lahesmaa-Rantala R, Ståhlberg TH, Toivanen A. Comparison of bacteria with and without plasmid-encoded proteins as antigens for measurement of immunoglobulin M, G, and A antibodies to Yersinia enterocolitica by enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin Microbiol 1989; 27: 583-5. 8. Gripenberg-Lerche C, Zhang L, Ahtonen P, Toivanen P, Skurnik M. Construction of urease-negative mutants of Yersinia enterocolitica serotypes O:3 and O:8: Role of urease in virulence and arthritogenicity. Infect Immun 2000, 68: 942-7. 9. Heesemann J, Gross U, Schmidt N, Laufs R. Immunochemical analysis of plasmid-encoded proteins released by enteropathogenic Yersinia sp. Grown in calcium-deficient media. Infect Immun 1986; 54: 561-7. 10. Isberg RR, Voorhis L, Falkow S. Identification of invasin: a protein that allows enteric bacteria to penetrate cultured mammalian cells. Cell 1987; 50: 769-78. 11. Mäki-Ikola O, Heesemann J, Lahesmaa R i inni. Combined use of released proteins and lipopolysaccharide in enzyme-linked immunosorbent assay for serologic screening of Yersinia infections. J Infec Dis 1991; 163: 409-12. 12. Mertz AKH, Batsford SR, Curschellas E i inni. Cationic Yersinia antigen-induced chronic allergic arthritis in rats- a model for reactive arthritis in human. J Clin Invest 1991; 88: 632-42. 13. Pepe JC, Miller L. The Yersinia enterocolitica inv gene product is an outer membrane protein that shares epitopes with Yersinia pseudotuberculosis invasin. J Bacteriol 1990, 172: 3780-9. 14. Rastawicki W, Gierczyński R, Jagielski M. Wykorzystanie wydzielniczych białek Yop pałeczek Yersinia w serologicznej diagnostyce jersiniozy. I. Antygen do odczynu immunoenzymatycznego. Med Dośw Mikrobiol 2003; 55: 125-33. 15. Rastawicki W, Kałużewski S, Jagielski M, Gierczyński R. Porównanie przydatności testu ELISA opracowanego we własnym zakresie i komercyjnego testu ELISA firmy Mikrogen do serologicznej diagnostyki zakażeń wywoływanych przez pałeczki z rodzaju Yersinia. Med Dośw Mikrobiol 2001; 53: 357-62. 16. Skurnik M, Batsford S, Mertz A i inni. The putative arthritogenic cationic 19-kilodalton antigen of Yersinia enterocolitica is a urease B-subunit. Infect Immun 1993, 61: 2498-504. 17. Wiśniewski J, Bielecki J. Mechanizmy wirulencji bakterii z rodzaju Yersinia. Post Mikrobiol 1996, 35, 213-41.

32 W. Rastawicki Nr 1 18. Young VB, Miller VL, Falkow S, Schoolnik GK. Sequence, localization and function of the invasin protein of Yersinia enterocolitica. Mol Microbiol 1990, 4: 1119-28. Otrzymano: 22 I 2009 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH e-mail: wrastawicki@pzh.gov.pl