MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2017, 69: Waldemar Rastawicki, Kornelia Gielarowiec, Anna Chróst

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2017, 69: Występowanie przeciwciał dla rekombinowanych białek i lipopolisacharydów werotoksycznych pałeczek Escherichia coli (VTEC) w poszczególnych podklasach IgG u dzieci z zespołem hemolityczno-mocznicowym Serum immunoglobulin IgG subclass distribution of antibody responses to recombinant proteins and lipopolysaccharides of verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) in children with haemolytic-uraemic syndrome Waldemar Rastawicki, Kornelia Gielarowiec, Anna Chróst Zakład Bakteriologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny w Warszawie Określono częstość występowania i poziom przeciwciał podklas IgG1-IgG4 dla LPS oraz rekombinowanych białek werotoksycznych pałeczek E. coli u dzieci z zespołem hemolityczno-mocznicowym. Przeprowadzone badania wykazały, że w przebiegu zakażenia VTEC najczęściej wykrywano przeciwciała podklasy IgG1 i IgG2 dla LPS, następnie dla intyminy i białka Tir oraz dla werotoksyny 2b. Przeciwciała podklasy IgG3, a zwłaszcza podklasy IgG4 dla rekombinowanych białek w badanych próbkach surowicy diagnozowano znacznie rzadziej. Słowa kluczowe: przeciwciała podklasy IgG, E. coli O157, E. coli non-o157, VTEC ABSTRACT Introduction: The present study was aimed at determining the IgG subclass distribution against LPS and recombinant proteins of verocytotoxin-producing E.coli (VTEC) in children with haemolytic-uraemic syndrome. Materials and Methods: The total number of 17 serum samples obtained from children with bacteriologically and/or serologically confirmed VTEC infections were tested by in-house ELISA for the presence of IgG1-IgG4 antibodies. As the antigen in ELISA were used LPS of E. coli serotype O157, O26, O111, O121, O145 and recombinants proteins: verocytotoxin 2b, intimin and Tir. Results: In the present study most frequently and in the highest levels antibodies of subclass IgG1 and IgG2 to LPS, intimin and Tir protein were diagnosed. The arithmetic means of OD 450 of antibodies IgG3 and IgG4 to these antigens were over two-times lower than antibodies IgG1 measured in all of tested serum samples. Antibodies of subclass IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 in diagnostically significant level to verocytotoxin 2b were diagnosed only in 8, 3, 4 and 3 serum samples for 17 tested, respectively.

2 128 W. Rastawicki, K. Gielarowiec, A. Chróst Conclusions: In conclusion, IgG1 and IgG2 antibodies to LPS, intimin and Tir protein are predominating IgG subclass diagnosed in children with haemolytic-uraemic syndrome. Key words: IgG subclass antibodies, E. coli O157, E. coli non-o157, VTEC WSTĘP Dane epidemiologiczne z wielu państw Europy pokazują, że werotoksyczne pałeczki E. coli (VTEC) stanowią istotne zagrożenie dla zdrowia publicznego (4). Odpowiedzialne są one za wywoływanie krwotocznego zapalenia okrężnicy, zespołu hemolityczno-mocznicowego (haemolytic ureamic syndrome HUS), czy małopłytkowej plamicy zakrzepowej (thrombotic thrombocytopenic purpura TTP). Szczególnie niebezpiecznym powikłaniem zakażenia werotoksycznymi pałeczkami E. coli u małych dzieci jest HUS, definiowany jako triada objawów klinicznych: niedokrwistość hemolityczna z fragmentacją krwinek czerwonych, małopłytkowość i ostra niewydolność nerek. Różna etiopatogeneza stanowi podstawę klasyfikacji zespołu na trzy postaci: D+HUS typowa postać z biegunką poprzedzającą, atypowa postać D-HUS bez poprzedzającej biegunki oraz wtórna postać HUS (10). Pałeczki VTEC należą do różnych grup serologicznych, najczęściej do grupy O157, rzadziej do innych, umownie określanych mianem non O157, takich jak: O26, O103, O111, O121, O145 czy O104 (11). Do wywołania pełnych objawów zakażenia konieczne jest posiadanie przez te szczepy różnych czynników zjadliwości, w tym przede wszystkim werotoksyny I i/lub II, kodowanych na mobilnym elemencie genetycznym (fagu). Klasyczne, najczęściej izolowane szczepy VTEC powstają poprzez nabycie faga przez enteropatogenny szczep E. coli (EPEC), stąd najczęściej posiadają one takie dodatkowe mechanizmy wirulencji jak intymina, białko Tir, białko Esp czy hemolizyna (1, 7). Diagnostyka zakażeń wywoływanych przez werotoksyczne pałeczki E. coli sprowadza się głównie do zastosowania metod hodowlanych, polegających na izolacji bakterii z próbek kału pacjenta i następnie określeniu ich chorobotwórczych właściwości. Trzeba mieć jednak na uwadze, że pałeczki VTEC ze względu na bardzo krótki okres przebywania w układzie pokarmowym (kilka dni), morfologiczne podobieństwo do innych niechorobotwórczych pałeczek E. coli i częstą utratę genów kodujących werotoksyny w wyniku pasażowania, są trudne do izolacji w warunkach rutynowo prowadzonej diagnostyki bakteriologicznej. Z tego względu poszukiwanie swoistych przeciwciał może być przydatne zarówno w rutynowej, bieżącej diagnostyce jak również w retrospektywnych badaniach dotyczących rozpowszechnienia zakażeń wywoływanych przez pałeczki VTEC w populacji (2, 3). We wcześniej przeprowadzonych badaniach wykazaliśmy, że w przebiegu HUS u dzieci dochodzi do wytwarzania wysokiego poziomu swoistych przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM, zarówno dla lipopolisacharydów jak i dla rekombinowanych białek: werotoksyny 2b, intyminy i białka Tir (8, 9). Szczególnie wysoki poziom w przebiegu zakażenia osiągają przeciwciała klasy IgG, które stanowią około 70-75% całkowitej puli wszystkich immunoglobulin człowieka. Ze względu na typ łańcucha ciężkiego, przeciwciała klasy IgG można podzielić na cztery podklasy IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 (5, 6). Jak dotąd brak jest w dostępnym piśmiennictwie danych dotyczących udziału przeciwciał należących do poszczególnych podklas IgG w odpowiedzi humoralnej w przebiegu naturalnego zakażenia

3 Przeciwciała podklas IgG dla VTEC u dzieci z HUS 129 werotoksycznymi pałeczkami E. coli. Z tego względu, celem prezentowanej pracy była ocena występowania przeciwciał dla pałeczek VTEC w poszczególnych podklasach IgG w próbkach surowicy dzieci z zespołem-hemolityczno mocznicowym. MATERIAŁ I METODY Próbki surowicy. Przedmiotem badań było 17 próbek surowicy uzyskanych od dzieci z objawami zespołu hemolityczno-mocznicowego, w których we wcześniej wykonanych, rutynowych badaniach odczynem ELISA, stwierdzono podwyższony poziom przeciwciał klasy IgG dla LPS oraz rekombinowanych białek pałeczek E. coli. Od siedmiu badanych osób wyizolowano z kału werotoksyczne pałeczki E. coli. Odczyn ELISA. Badania przeprowadzono pośrednim testem immunoenzymatycznym ELISA zgodnie z procedurą podaną uprzednio (8, 9). Odczyn wykonywano na polistyrenowych płytkach Maxi-Sorp firmy Nunc opłaszczonych zawiesiną rekombinowanych białek oraz lipopolisacharydów. Rekombinowane białko Tir, fragment białka intyminy i werotoksynę 2b uzyskano metodami inżynierii genetycznej przy użyciu wektora pet30ek/lic firmy Novagen i oczyszczono metodą chromatografii metalopowinowactwa (IMAC) przy wykorzystaniu złoża Ni 2+ - IDA (His Bind Resing firmy Novagen). Preparaty lipopolisacharydów uzyskano zmodyfikowaną metodą Boivina ze szczepów E. coli należących do następujących grup serologicznych: O26, O111, O121, O145 oraz O157. W odczynie ELI- SA posłużono się mysimi, monoklonalnymi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (Invitrogen) dla ludzkich immunoglobulin IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. W wyniku wstępnego miareczkowania przyjęto rozcieńczenie koniugatów anty-igg1 1/400 i IgG2- -IgG4 1/250. Wartość diagnostycznie znamiennego poziomu przeciwciał wyliczano ze średniej arytmetycznej wartości poziomu przeciwciał oznaczonych w próbkach surowicy osób klinicznie zdrowych powiększonej o 3 odchylenia standardowe. WYNIKI I DYSKUSJA W tabeli I przedstawiono poziom przeciwciał w poszczególnych podklasach IgG dla rekombinowanych białek: werotoksyny 2b, białka Tir i intyminy oraz dla antygenów LPS w 17 próbkach surowicy uzyskanych od osób z zespołem hemolityczno-mocznicowym. U sześciu osób (pacjenci nr 1-6), we wcześniej wykonanych rutynowych badaniach odczynem ELISA, wykryto wysoki poziom przeciwciał klasy IgG, IgA i IgM dla pałeczek E. coli z grupy serologicznej O157. Dwie pierwsze próbki surowicy zostały uzyskane od osób z bakteriologicznie potwierdzonym zakażeniem wywołanym przez werotoksyczne szczepy pałeczek E. coli O157 (pacjent nr 1 i 2). W przeprowadzonych badaniach, we wszystkich 6 próbkach surowicy stwierdzono wysoki poziom przeciwciał podklasy IgG1 i IgG2 dla antygenu LPS. Przeciwciała podklasy IgG3 i IgG4 osiągały niższy poziom, aczkolwiek w większości przypadków diagnostycznie znamienny. U osób z zakażeniem wywołanym przez werotoksyczne pałeczki E. coli O157 stwierdzano również z reguły wysoki poziom przeciwciał podklasy IgG1 dla intyminy, białka Tir oraz werotoksyny 2b. Diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał podklasy IgG2 i IgG3 najczęściej wykazywano dla intyminy, rzadziej dla białka Tir i werotoksyny.

4 130 W. Rastawicki, K. Gielarowiec, A. Chróst Tabela I. Poziom przeciwciał oznaczony odczynem ELISA (OD 450 ) w poszczególnych podklasach IgG dla rekombinowanych białek: werotoksyny 2b, białka Tir, intyminy oraz dla antygenów LPS w próbkach surowicy osób z zespołem hemolityczno-mocznicowym. Nr pacjenta/serotyp E. coli/izolacja Werotoksyna 2b Tir Intymina LPS IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 / O157 / Tak 0,66 0,26 0,28 0,15 1,04 0,34 0,28 0,13 1,72 0,59 0,17 0,19 1,90 1,59 0,82 0,41 Nr 2 / O157 / Tak 0,70 0,53 0,44 0,20 1,15 0,50 0,41 0,22 0,66 0,35 0,37 0,17 1,75 1,41 1,29 0,42 Nr 3 / O157 / Nie 0,76 0,28 1,03 0,13 1,50 0,35 0,33 0,13 1,82 0,35 0,67 0,15 1,64 0,80 1,11 0,29 Nr 4 / O157 / Nie 0,50 0,28 0,33 0,18 0,79 0,31 0,17 0,12 1,00 0,17 0,21 0,10 1,50 0,71 0,20 0,21 Nr 5 / O157 / Nie 0,97 0,42 1,37 0,18 1,91 0,77 0,34 0,23 1,92 0,79 1,77 0,17 1,53 1,64 0,59 0,35 Nr 6 / O157 / Nie 0,97 0,65 0,40 0,25 1,08 0,52 0,30 0,20 1,69 0,35 0,29 0,14 1,73 1,59 0,70 0,44 Nr 7 / O26 / Nie 0,49 0,28 0,25 0,15 0,57 0,29 0,17 0,12 1,15 0,43 0,19 0,11 0,77 0,71 0,23 0,13 Nr 8 / O26 / Tak 0,32 0,29 0,22 0,13 0,62 0,25 0,14 0,12 1,49 0,37 0,14 0,10 0,91 0,34 0,22 0,14 Nr 9 / O26 / Tak 0,52 0,30 0,25 0,16 0,78 0,29 0,16 0,13 1,37 0,31 0,22 0,13 1,43 0,48 0,61 0,15 0 / O145 / Nie 0,59 1,05 0,23 0,16 0,37 0,30 0,16 0,12 1,02 0,40 0,12 0,11 0,70 0,47 0,20 0,15 1 / O145 / Tak 0,90 0,68 0,82 0,25 0,94 0,48 0,27 0,19 1,79 1,44 0,47 0,18 0,79 0,53 0,77 0,18 2 / O145 / Nie 0,56 0,49 0,34 0,26 1,57 0,57 0,31 0,32 1,52 0,35 0,20 0,31 1,24 0,55 0,39 0,24 3 / O145 / Nie 0,73 0,36 0,76 0,21 1,94 0,50 0,30 0,28 1,91 0,85 0,45 0,26 1,67 1,48 1,17 0,14 4 / O145 / Nie 0,38 0,26 0,52 0,17 1,83 0,40 0,15 0,22 1,45 0,23 0,13 0,15 0,97 0,51 0,36 0,18 5 / O111 / Tak 0,53 0,44 0,20 0,18 1,34 0,53 0,15 0,21 1,28 0,45 0,13 0,14 0,38 0,34 0,16 0,12 6 / O111 / Tak 0,49 0,41 0,22 0,16 0,91 0,43 0,18 0,21 1,13 0,35 0,13 0,15 0,37 0,24 0,15 0,11 7 / O111 / Nie 0,71 0,50 0,52 0,28 1,53 0,50 0,39 0,47 1,17 0,35 0,24 0,20 0,28 0,22 0,21 0,20 Wartość cut off 0,65 0,65 0,65 0,25 0,90 0,50 0,30 0,25 1,00 0,35 0,45 0,25 0,90 0,45 0,55 0,35

5 Przeciwciała podklas IgG dla VTEC u dzieci z HUS 131 U pozostałych 11 osób chorych, z zakażeniem wywołanym przez pałeczki E. coli z grupy serologicznej O26, O145 lub O111, najczęściej wykrywano przeciwciała podklasy IgG1 i IgG2 dla intyminy, następnie dla białka Tir oraz lipopolisacharydów, najrzadziej zaś dla werotoksyny. Przeciwciała podklasy IgG3 oraz IgG4 w tej grupie badanych osób wykrywano sporadycznie na diagnostycznie znamiennym poziomie. Pomimo, że w przypadku pacjentów nr 8, 9, 11, 15 i 16 zakażenie przez werotoksyczne pałeczki E. coli zostało potwierdzone wyizolowaniem szczepu i określeniem w PCR obecności genów kodujących werotoksyny, odczynem ELISA wykryto podwyższony poziom przeciwciał podklasy IgG1-IgG4 dla werotoksyny 2b tylko u jednej osoby (pacjent nr 11). Tak więc, pomimo tego że szczep posiadał determinanty genetyczne werotoksyny i był zdolny do wywołania zespołu hemolityczno-mocznicowego to u osób zakażonych nie wykryto przeciwciał skierowanych dla tego białka. Co istotne, u pozostałych osób zakażonych szczepami non- -O157 wykryto natomiast diagnostycznie znamienny poziom przeciwciał dla białka Tir bądź intyminy. Przeciwciała poszczególnych podklas IgG różnią się między sobą nie tylko budową lecz także właściwościami biologicznymi. Podczas zakażenia, białkowe antygeny drobnoustrojów najsilniej stymulują produkcję przeciwciał podklasy IgG1 i IgG3, znacznie słabiej klasy IgG4 oraz IgG2, natomiast antygeny lipopolisacharydowe najsilniej stymulują z kolei wytwarzanie przeciwciał podklasy IgG2 (5, 6). Tak więc, wykazanie w prezentowanych badaniach dominacji przeciwciał podklasy IgG1 dla antygenów białkowych w surowicy osób chorych było zgodne z oczekiwaniem. Ciekawy wydaje się natomiast fakt wykrycia w surowicy badanych osób równie wysokiego poziomu przeciwciał podklasy IgG2 i IgG1 dla LPS. Prezentowane przez nas wyniki badań wykazały, że w przebiegu zakażenia pałeczkami VTEC produkowane są przeciwciała należące do wszystkich czterech podklas IgG. Najwyższe poziomy osiągają przeciwciała skierowane dla LPS i to nie tylko podklasy IgG2 ale także IgG1. Trzeba jednak mieć na uwadze, że wykazanie u chorych osób obecności przeciwciał dla LPS z określonych serotypów nie świadczy bezpośrednio o zakażeniu szczepami werotoksycznymi. W badanych próbkach surowicy dzieci z HUS stwierdzano także wysoki poziom przeciwciał podklasy IgG1 i IgG2 dla intyminy i białkatir. Przeciwciała podklasy IgG3, a zwłaszcza IgG4, dla rekombinowanych białek, wykrywano w znacznie niższych poziomach. *Badania wykonane w ramach zadania statutowego 5/EM.1 NIZP-PZH na rok 2017 PIŚMIENNICTWO 1. Chart H, Cheasty T. Human infections with Verocytotoxin-producing Escherichia coli O years of E. coli O157 serodiagnosis. J Med Microbiol 2008; 57: Chart H, Jenkins C. The serodiagnosis of infections caused by verocytotoxin-producing Escherichia coli. J App Microbiol 1999; 86: Chart H, Perry N, Cheasty T, Wright P. The kinetics of antibody production to antigens of Escherichia coli O157 in a pregnant woman with haemolytic uraemic syndrome. J Med Microbiol 2002; 51:522-5.

6 132 W. Rastawicki, K. Gielarowiec, A. Chróst 4. EFSA, European Food Safe Authority Journal. The Community Summery Report on Trends and Zoonotic Agents and Food-borne Outbreak in the European Union in Journal 2010; 8: Hamilton RG. Human IgG subclass measurements in the clinical laboratory. Clin Chem 1987; 33: Jakóbisiak M. Przeciwciała, str W: Immunologia. Red. Gołąb J, Jakóbisiak M, Lasek. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa Jenkins C, Chart H, Smith HR i inni. Antibody response of patients infected with Verocytotoxin producing Escherichia coli to protein antigens encoded on the LEE locus. J Med Microbiol 2000; 49: Rastawicki W, Rokosz-Chudziak N. Ocena przydatności odczynu immunoenzymatycznego ELISA do poszukiwania przeciwciał dla lipopolisacharydów enterokrwotocznych pałeczek Escherichia coli (EHEC) u osób z zaburzeniami układu pokarmowego i zespołem hemolityczno-mocznicowym. Med Dośw Mikrobiol 2014; 66: Rastawicki W, Śmietańska K, Chróst A i inni. Wykorzystanie wybranych, rekombinowanych białek w serodiagnostyce zakażeń wywoływanych przez werotoksyczne pałeczki Escherichia coli (VTEC) u ludzi. Med Dośw Mikrobiol 2016; 68: Sieniawska M, Wyszyńska T. Nefrologia dziecięca. Tom 2. Biblioteka lekarza Specjalisty. Warszawa Szych J. W etiologia, obraz kliniczny i diagnostyka ostrych zakażeń i zarażeń przewodu pokarmowego oraz zatruć pokarmowych. Pod redakcją Marka Jagielskiego. Biblioteka Diagnosty Laboratoryjnego. Fundacja Pro Pharmacia Futura, Warszawa 2011, str Otrzymano: 19 VI 2017 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie