MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: Waldemar Rastawicki, Karolina Śmietańska, Natalia Rokosz-Chudziak, Marek Jagielski

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: Występowanie przeciwciał dla toksyny krztuścowej i włókienkowej hemaglutyniny Bordetella pertussis w poszczególnych podklasach IgG w przebiegu krztuśca Serum immunoglobulin IgG subclass distribution of antibody responses to pertussis toxin and filamentous hemagglutinin of Bordetella pertussis in patients with whooping cough Waldemar Rastawicki, Karolina Śmietańska, Natalia Rokosz-Chudziak, Marek Jagielski Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie Przeanalizowano częstość występowania przeciwciał podklas IgG1-IgG4 dla toksyny krztuścowej i włókienkowej hemaglutyniny B. pertussis w próbkach surowicy uzyskanych od osób z krztuścem. Przeprowadzone badania wykazały, że w przebiegu krztuśca produkowane są przeciwciała należące do wszystkich podklas IgG dla obydwu użytych antygenów. Najczęściej wykrywano przeciwciała podklasy IgG1, najrzadziej zaś podklasy IgG3. Stwierdzono również, że przeciwciała podklasy IgG4 występowały statystycznie istotnie częściej u mężczyzn niż u kobiet, a częstość ich wykrywania malała wraz z wiekiem badanych osób. Słowa kluczowe: przeciwciała podklasy IgG, toksyna krztuścowa, włókienkowa hemaglutynina, krztusiec ABSTRACT Introduction: The present study was aimed at determining the IgG subclass distribution against pertussis toxin (PT) and filamentous hemagglutinin (FHA) of Bordetella pertussis in patients with whooping cough. Methods: The total number of 222 serum samples obtained from patients suspected in clinical investigation for pertussis were tested separately by in-house ELISA for the presence of IgG antibodies to pertussis toxin and filamentous hemagglutinin. The percentage distribution of specific anti-pt and anti-fha IgG subclass response was calculated only on the basis of group of sera confirmed in the present study as positive for total IgG antibodies (183 sera to PT antigen and 129 to FHA antigen). Paired serum specimens were obtained from 36 patients. Based on the results of determining the level of antibodies in the sera of 40 blood

2 270 W. Rastawicki i inni Nr 4 donors, the cut-off limit of serum antibodies for each subclass was set at arithmetic mean plus two standard deviations. Results: Antibodies of IgG1 to pertussis toxin and filamentous hemagglutinin were diagnosed in 151 (82.5%) and 99 (76.7%), IgG2 in 72 (39.0%) and 50 (38.8%), IgG3 in 17 (9.3%) and 43 (33.3%), IgG4 in 55 (30.1%) and 53 (41.1%) serum samples, respectively. There were no significant differences in percentage of sera with IgG1, IgG2 and IgG3 in relation to age of the patients. However, the frequency of occurrence of IgG4 antibodies was highest in the group of the youngest children to the age of 6 years old (61.8% for PT and 68.0% for FHA), and decrease with age, reaching the minimum in the group of patients above 40 years old (13.2% and 4.2% for PT and FHA, respectively). We also found significantly higher frequency of IgG4 to PT and FHA antigens in men than in women. Statistically significant, essential changes in the pattern of IgG subclass during the course of infection were not found. Conclusions: In conclusion, this study showed that all four subclasses of IgG antibodies to pertussis toxin and filamentous hemagglutinin are produced during whooping cough. Key words: IgG subclass antibodies, pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, whooping cough WSTĘP Przeciwciała klasy IgG stanowią około 70-75% całkowitej puli wszystkich immunoglobulin człowieka. Immunoglobuliny te składają się z dwóch łańcuchów lekkich i dwóch identycznych ciężkich łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniem dwusiarczkowym. Na podstawie typu łańcucha ciężkiego, klasę IgG podzielono na 4 podklasy (IgG1- -IgG4). Występują one odpowiednio w następujących proporcjach: IgG1 66%, IgG2-23%, IgG3-7%, IgG4-4% (4, 9). Dotychczasowa analiza humoralnej odpowiedzi w przebiegu krztuśca u ludzi ograniczała się do głównie do poszukiwania swoistych przeciwciał w klasie immunoglobulin A, G i M. W dostępnej literaturze istnieją jedynie sporadyczne doniesienia na temat badania przeciwciał w poszczególnych podklasach IgG swoistych dla B. pertussis (1, 2, 11, 12). Mając jednakże na uwadze fakt, że w przypadku zakażeń wywoływanych przez inne bakteryjne patogeny analiza taka została przeprowadzona (3, 5, 6, 7, 8, 10), celem zaplanowanych badań była ocena częstości występowania i poziomu przeciwciał należących do poszczególnych podklas IgG dla toksyny krztuścowej i włókienkowej hemaglutyniny w przebiegu krztuśca u ludzi. MATERIAŁ I METODY Próbki surowicy. Przedmiotem badań było 222 próbek surowicy uzyskanych od osób z zakażeniem układu oddechowego podejrzanych w badaniu klinicznym o krztusiec, w których we wcześniej wykonanych badaniach odczynem ELISA firmy Novatec stwierdzono podwyższony poziom swoistych przeciwciał dla antygenów pałeczek B. pertussis. Od 36 osób uzyskano po dwie próbki surowicy w różnym okresie choroby (w odstępie 1-2 miesięcy). Nie dysponowano danymi dotyczącymi przeprowadzonych u tych osób szcze-

3 Nr 4 Podklasy IgG w przebiegu krztuśca 271 pień w kierunku krztuśca. Dodatkowo, w celu wyznaczenia diagnostycznie znamiennego poziomu przeciwciał, przebadano 40 próbek surowicy krwiodawców. Odczyn ELISA. Badania przeprowadzono pośrednim testem immunoenzymatycznym ELISA zgodnie z procedurą podaną uprzednio (5). Jako antygenu w odczynie ELISA użyto niezależnie dwóch preparatów: - toksyny krztuścowej (PT), otrzymanej od Statens Serum Institute w Kopenhadze. Użytkowe stężenie toksyny krztuścowej nanoszonej do dołków płytki metapleksowej wynosiło 0,5 µg/ml. - włókienkowej hemaglutyniny (FHA), zakupionej w Cherwell Innovation Centre, Oxfordshire, Wielka Brytania. Zgodnie z certyfikatem, preparat ten jest wysoce oczyszczoną FHA uzyskaną ze szczepu B. pertussis NC10739/ACTC Użytkowe stężenie włókienkowej hemaglutyniny w odczynie ELISA wynosiło 1 µg/ml. W odczynie ELISA posłużono się mysimi, monoklonalnymi przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (Invitrogen) dla ludzkich immunoglobulin IgG, IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. W wyniku wstępnego miareczkowania przyjęto rozcieńczenie koniugatu anty- -IgG 1/3000, natomiast rozcieńczenie koniugatów anty-igg1, IgG2, IgG3 i IgG4 wynosiło 1/500. Wartość diagnostycznie znamiennego poziomu przeciwciał wyliczano ze średniej arytmetycznej wartości poziomu przeciwciał oznaczonych w 40 próbkach surowicy osób klinicznie zdrowych powiększonej o 2 odchylenia standardowe. Statystyczne opracowanie wyników. Istotność różnic w częstości wykrywania przeciwciał w poszczególnych podklasach IgG w próbkach surowicy osób chorych oceniano testem niezależności chi-kwadrat z zastosowaniem poprawki Yatesa. Za znamienne statystycznie przyjęto różnice, gdzie poziomy istotności p były mniejsze od 0,05 (p<0,05). WYNIKI Przeprowadzone badania wykazały, że przeciwciała klasy IgG dla toksyny krztuścowej w mianie diagnostycznie znamiennym wykryto w 183 (82,4%) próbkach surowicy uzyskanych od osób chorych. Dalsze poszukiwanie przeciwciał w poszczególnych podklasach IgG ograniczono więc wyłącznie do tej grupy próbek surowicy. Przeciwciała podklasy IgG1 stwierdzono w 151 (82,5%) próbkach, podklasy IgG2 w 72 (39,3%), podklasy IgG3 w 17 (9,3%) i podklasy IgG4 w 55 (30,1%) próbkach surowicy. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic (p>0,05) w częstości występowania przeciwciał należących do podklas IgG1, IgG2 i IgG3 w zależności od wieku badanych osób. Zasadniczą, statystycznie istotną różnicę wykazano natomiast podczas poszukiwania przeciwciał podklasy IgG4. Przeciwciała te występowały w 61,8% próbek uzyskanych od dzieci do szóstego roku życia, w 32,6% próbek uzyskanych od osób w wieku 7-20 lat, 18,4% próbek uzyskanych od osób w wieku lat oraz w 13,2% próbek uzyskanych od osób powyżej 40. roku życia (Tabela I). Przeciwciała podklasy IgG3 i IgG4 dla toksyny krztuścowej występowały również trzykrotnie częściej u mężczyzn niż u kobiet. Co ciekawe, zaobserwowano bardzo duże zróżnicowanie w poziomie przeciwciał podklasy IgG4 u poszczególnych badanych osób. Wysoki poziom przeciwciał (co najmniej 2 razy wyższy niż poziom cut off) wykryto aż u 34 osób, z czego 76,5% stanowili mężczyźni.

4 272 W. Rastawicki i inni Nr 4 Tabela I. Występowanie przeciwciał na diagnostycznie znamiennym poziomie dla toksyny krztuścowej u osób z krztuścem w zależności od wieku. Wiek badanych osób (lata) Liczba próbek surowicy Liczba (odsetek) próbek surowicy, w których wykryto przeciwciała w podklasie: IgG1 IgG2 IgG3 IgG (79,4) 14 (41,2) 7 (20,6) 21 (61,8) (93,5) 20 (43,5) 5 (10,9) 15 (32,6) (76,3) 15 (39,5) 2 (5,3) 7 (18,4) > (76,3) 17 (44,7) 3 (7,9) 5 (13,2) W analogicznych badaniach, przeprowadzonych odczynem ELISA z preparatem włókienkowej hemaglutyniny stwierdzono, że przeciwciała klasy IgG na diagnostycznie znamiennym poziomie występowały w 129 (58,1%) próbkach surowicy. Wśród tych próbek, przeciwciała podklasy IgG1 wykazano w 99 (76,7%), przeciwciała podklasy IgG2 w 50 (38,8%), przeciwciała podklasy IgG3 w 43 (33,3%) i przeciwciała podklasy IgG4 w 53 (41,1%) przypadkach. Podobnie jak w przypadku wyników uzyskanych przy zastosowaniu toksyny krztuścowej, istotne różnice w częstości występowania przeciwciał dla włókienkowej hemaglutyniny w zależności od wieku badanych osób stwierdzono tylko podczas poszukiwania przeciwciał podklasy IgG4. Przeciwciała te wykazano w 68,0% próbek surowicy dzieci do 6. roku życia, 56,8% próbek surowicy osób w wieku 7-20 lat, 33,3% próbek surowicy osób w wieku lat i tylko 4,2% próbek surowicy uzyskanych od osób powyżej 60. roku życia (Tabela II). Przeciwciała podklasy IgG4 dla włókienkowej hemaglutyniny istotnie częściej stwierdzano u mężczyzn (56,4%) niż u kobiet (29,1%). Podobnie jak w przypadku wyników uzyskanych w odczynie ELISA z antygenem PT, przeciwciała podklasy IgG4 dla FHA u badanych osób często wykrywano w wysokim poziomie. Tabela II. Występowanie przeciwciał na diagnostycznie znamiennym poziomie dla włókienkowej hemaglutyniny u osób z krztuścem w zależności od wieku. Wiek badanych osób (lata) Liczba próbek surowicy Liczba (odsetek) próbek surowicy, w których wykryto przeciwciała w podklasie: IgG1 IgG2 IgG3 IgG (60,0) 6 (24,0) 6 (24,0) 17 (68,0) (94,6) 21 (56,8) 16 (43,2) 21 (56,8) (83,3) 10 (50,0) 7 (29,2) 8 (33,3) > (50,0) 9 (37,5) 10 (41,7) 1 (4,2) Przeprowadzone badania próbek surowicy uzyskanych dwukrotnie w odstępie 1-2 miesięcy w przebiegu krztuśca od 36 osób nie wykazały statystycznie istotnych różnic w częstości występowania przeciwciał w poszczególnych podklasach IgG dla obydwu użytych antygenów w zależności od okresu choroby. DYSKUSJA Poziom przeciwciał w poszczególnych podklasach IgG dla antygenów pałeczek B. pertussis w surowicy osób z krztuścem opisany został w nielicznych publikacjach. Giammanco

5 Nr 4 Podklasy IgG w przebiegu krztuśca 273 i wsp. (1) zbadał poziom przeciwciał dla toksyny krztuścowej w 89 próbkach surowicy uzyskanych od klinicznie zdrowych, szczepionych dzieci oraz w 131 próbkach uzyskanych od dzieci z przebytym krztuścem. Wyniki badań wykazały, że u nieszczepionych dzieci z przebytym zakażeniem wywołanym przez B. pertussis dominowały przeciwciała podklasy IgG1 i IgG3, natomiast u dzieci szczepionych bezkomórkową szczepionką, zarówno zdrowych jak i po przebytym krztuścu, w największym stężeniu produkowane były przeciwciała podklasy IgG1, IgG2 i IgG4. W badaniach prowadzonych przez Zaitsev i wsp. (12) wykazano obecność przeciwciał podklasy IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 odpowiednio u 85%, 70%, 74% i 68% osób z krztuścem. Według tych autorów, wysoki poziom przeciwciał podklasy IgG3 jest charakterystyczny dla ostrej fazy zakażenia pałeczkami B. pertussis. Zackrisson i wsp. (11) wykryli obecność przeciwciał podklasy IgG1 i IgG3 dla toksyny krztuścowej odpowiednio w 92% i 42% próbek surowicy osób z krztuścem. Poziom tych przeciwciał nie był skorelowany z wiekiem badanych osób. Przeciwciała podklasy IgG2 i IgG4 były obecne tylko w odpowiednio 5% i 10% próbek surowicy. Autorzy ci wykazali duże różnice w poziomie przeciwciał podklasy IgG4 u badanych chorych osób. Według Hendrikx i wsp. (2) w przebiegu krztuśca indukowane są przeciwciała, zarówno dla toksyny krztuścowej, włókienkowej hemaglutyniny i pertaktyny, głównie podklasy IgG1. Przeciwciała podklasy IgG2, IgG3 i IgG4 występowały w niewielkim odsetku próbek surowicy osób z krztuścem. Autorzy ci nie stwierdzili istotnych różnic w częstości występowania przeciwciał w poszczególnych podklasach IgG w zależności od wieku badanych osób. W podsumowaniu uzyskanych wyników należy stwierdzić, że w przebiegu krztuśca indukowane są przeciwciała należące do wszystkich czterech podklas IgG. Podobnie jak w badaniach innych autorów, zdecydowanie najczęściej wykrywano przeciwciała podklasy IgG1. Ciekawym spostrzeżeniem jest fakt stosunkowo częstego wykrywania przeciwciał podklasy IgG4 zwłaszcza, że był on wyraźnie skorelowane z wiekiem i płcią badanych osób. Dodatkowo, przeciwciała tej podklasy bardzo często występowały w wysokich poziomach. W przeprowadzonych badaniach nie wykazano istotnych różnic w poziomie przeciwciał należących do poszczególnych podklas IgG w zależności od okresu choroby. Jednakże analiza ta została przeprowadzona jedynie na wybranych próbkach surowicy uzyskanych dwukrotnie w niewielkich odstępach czasowych. Praca została wykonana w ramach zadania nr 7/EM.1/2013 PIŚMIENNICTWO 1. Giammanco A, Taormina S, Chiarini A i inni. Analogous IgG subclass response to pertussis toxin in vaccinated children, healthy or affected by whooping cough. Vaccine 2003; 21: Hendrikx LH, Schure RM, Öztürk K i inni. Different IgG-subclass distributions after whole-cell and acellular pertussis infant primary vaccinations in helathy and pertussis infected children. Vaccine 2011; 29: Islam D, Wretlind B, Ryd M i inni. Immunoglobulin subclass distribution and dynamics of Shigella-specific antibody responses in serum and stool samples in shigellosis. Infect Immun 1995; 63: Jakóbisiak M. Przeciwciała, str W: Immunologia. Red. Gołąb J, Jakóbisiak M, Lasek. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005.

6 274 W. Rastawicki i inni Nr 4 5. Rastawicki W, Jakubczak A. Serum immunoglobulin IgG subclass distribution of antibody responses to Yop proteins and lipopolysaccharide of Yersinia enterocolitica in patients with yersiniosis. Pol J Microbiol 2007; 56: Rastawicki W, Rokosz N, Jagielski M. Występowanie przeciwciał dla antygenów Mycoplasma pneumoniae w poszczególnych podklasach IgG w przebiegu mykoplazmoza. Med. Dośw Mikrobiol 2009; 61: Schenk K, Michaelsen TE. IgG subclass distribution of serum antibodies against lipopolysaccharide from Bacteroides gingivalis in periodontal health and disease. Acta Pathol Microbiol Scand 1987; 95: Shackelford PG, Granoff DM, Nelson SJ. Subclass distribution of human antibodies to Haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide. J Immunol 1987; 138: Spiegelberg HL. Biological activities of immunoglobulins of different classes and subclasses. Adv Immunol 1974; 303: Widhe M, Ekerfelt C, Forsberg P. IgG subclasses in Lyme borreliosis: A study of specific IgG subclass distribution in an interferon-g-predominated disease. Scand J Immunol 1998; 47: Zackrisson G, Lagergard T, Trollfors B. Subclass compositions of immunoglobulin G to pertussis toxin in patients with whooping cough, in healthy individuals, and in recipients of a pertussis toxoid vaccine. J Clin Microbiol 1989; 27: Zaitsev EM, Krasnoproshina LI, Mazurova IK i inni. Isotypes of anti-pertussis antibodies in pertussis patients at different stages of the disease. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol 2011; 3:53-6. Otrzymano: 21 X 2013 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie