MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: Waldemar Rastawicki, Stanisław Kałużewski

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: Zastosowanie odczynu immunoenzymatycznego ELISA do poszukiwania przeciwciał dla lipopolisacharydowych antygenów somatycznych O oraz otoczkowego antygenu Vi pałeczek Salmonella Typhi u osób z epidemicznego ogniska duru brzusznego Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to Salmonella Typhi lipopolysaccharide O and capsular polysaccharide Vi antigens in persons from outbreak of typhoid fever Waldemar Rastawicki, Stanisław Kałużewski Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Przedstawiono wyniki badania poziomu przeciwciał dla antygenu somatycznego O oraz antygenu otoczkowego Vi w próbkach surowicy osób chorych na dur brzuszny oraz osób ze styczności z chorymi na dur brzuszny z ogniska epidemicznego w Kraśniku w latach Przeprowadzone badania wykazały obecność swoistych przeciwciał dla antygenu somatycznego i antygenu Vi odpowiednio u 80% i 53,3% chorych na dur brzuszny oraz 51,4% i 45% osób ze styczności. Ze względu na wysoką czułość i swoistość metody oraz możliwość oznaczania poziomu przeciwciał w poszczególnych klasach immunoglobulin, odczyn ELISA może być stosowany w serodiagnostyce zakażeń wywoływanych przez pałeczki S. Typhi, badaniach epidemiologicznych w ogniskach epidemicznych czy też w badaniu skuteczności szczepień przeciwko durowi brzusznemu. Słowa kluczowe: Salmonella Typhi, dur brzuszny, ELISA, antygen somatyczny, otoczkowy antygen Vi ABSTRACT Introduction: The laboratory diagnosis of typhoid fever is dependent upon either isolation of S. Typhi from a clinical sample or the detection of raised titers of serum antibodies in the Widal test or the passive hemagglutination assay (PHA). In this study we evaluated

2 166 W. Rastawicki, S. Kałużewski Nr 3-4 the usefulness of ELISA for detection of antibodies to S. Typhi lipopolysaccharide O and capsular polysaccharide Vi antigens in the sera of persons from outbreak of typhoid fever. Material and methods: Fifteen serum samples from patients with laboratory confirmed typhoid fever and 140 sera from persons suspected for contact with typhoid fever patients from outbreak in 1974/75 in Poland were tested by ELISA. Additionally, as the control group, we tested 115 sera from blood donors for the presence of S. Typhi anti-lps and anti-vi antibodies. Results:. Anti-LPS and anti-vi antibodies were detected in 80% and 53.3% of sera obtained from patients with laboratory confirmed typhoid fever, respectively. The high percentages of positive results in ELISA were also noted in the group of persons suspected for contact with typhoid fever patients (51.4% and 45%) but not in the group of blood donors (7.8% and 6.1%, respectively). Conclusions: The ELISA could be a useful tool for the serological diagnosis of typhoid fever in patients who have clinical symptoms but are culture negative, especially during massive outbreaks of typhoid fever. Key words: Salmonella Typhi, typhoid fever, ELISA, LPS somatic antigen, capsular polysaccharide Vi antigens WSTĘP Dur brzuszny jest ostrą chorobą zakaźną wywoływaną przez pałeczki duru brzusznego Salmonella enterica serowar Typhi. Choroba charakteryzuje się zróżnicowanymi objawami klinicznymi, stopniowym narastaniem objawów, długotrwałym okresem zdrowienia i skłonnością do nawrotów. Źródłem zakażenia jest zakażony objawowo bądź bezobjawowo człowiek. Materiałem zakaźnym jest przede wszystkim kał, rzadziej mocz. Dur brzuszny szerzy się głównie przez wodę i żywność zanieczyszczone wydalinami zakażonych ludzi. Szczególnie niebezpieczne są skażone ściekami zbiorniki wodne (awarie sieci wodociągowo- -kanalizacyjnej), produkty mleczne oraz jarzyny uprawiane na polach nawożonych odchodami ludzkimi. Możliwe jest także zakażenie bezpośrednie od zakażonego człowieka (14). Serologiczne badanie jest ważnym, chociaż w stosunku do badań bakteriologicznych, drugorzędnym sposobem laboratoryjnego rozpoznawania duru brzusznego. W dotychczasowej praktyce badania te ograniczają się do wykonania odczynu aglutynacji probówkowej (odczynu Widala) oraz odczynu hemaglutynacji biernej z antygenem O i Vi S. Typhi. Wadą odczynów zlepnych jest to, iż wykrywają one przeciwciała dla antygenów pałeczek Salmonella przede wszystkim w klasie immunoglobulin M. W przypadku nawrotów choroby, kolejnych zakażeń lub wykrywania nosicieli duru brzusznego koniecznym jest oznaczanie poziomu przeciwciał także w klasach IgA i IgG (4). Celem podjętych badań była wstępna ocena przydatności odczynu immunoenzymatycznego ELISA do poszukiwania przeciwciał klasy IgA, IgG i IgM dla antygenów somatycznych O oraz antygenu Vi pałeczek Salmonella Typhi u osób pochodzących z epidemicznego ogniska duru brzusznego.

3 Nr 3-4 Przydatność odczynu ELISA w serodiagnostyce duru brzusznego 167 MATERIAŁ I METODY Do badań wykorzystano 155 próbek surowicy pochodzących od osób podejrzanych o zakażenie pałeczkami S. Typhi bądź osób z bliskiego kontaktu z takimi chorymi, z ogniska epidemicznego duru brzusznego w Kraśniku w latach U 15 osób z tej grupy, dur brzuszny został potwierdzony uprzednio wykonanymi badaniami bakteriologicznymi lub serologicznymi, przeprowadzonymi odczynem Widala bądź hemaglutynacji biernej. Nie dysponowano danymi dotyczącymi objawów klinicznych czy też wyników uprzednio przeprowadzonych badań bakteriologicznych bądź serologicznych w kierunku zakażenia pałeczkami S. Typhi u pozostałych 140 osób z ogniska epidemicznego w Kraśniku osoby te zakwalifikowano do grupy osób ze styczności z chorymi na dur brzuszny. Próbki surowicy od czasu uzyskania do momentu badania były przetrzymywane w zamrożeniu bądź jako liofilizaty w chłodni. Dodatkowo, badaniom poddano 115 próbek surowicy uzyskanych od krwiodawców - klinicznie zdrowych dorosłych osób. Próbki te otrzymano w latach z Regionalnego Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa w Warszawie. Odczyn immunoenzymatyczny ELISA. W badaniach wykorzystano zestaw ELISA opracowany we własnym zakresie. Test ELISA przeprowadzano na metapleksowych płytkach firmy Nunc zgodnie z metodyką opisaną w poprzednich publikacjach, oznaczając poziom przeciwciał klasy IgA, IgG oraz IgM (11). W odczynie ELISA wykorzystano preparat antygenu somatycznego przygotowany ze szczepu S. Typhi O-901 oraz preparat antygenu Vi uzyskany ze szczepu S. Typhi 6S zmodyfikowaną metodą Boivina (7). W wyniku przeprowadzonego miareczkowania metodą szachownicy ustalono użytkowe stężenie wszystkich preparatów antygenowych na 25 µg/ml. W badaniach zastosowano koniugaty firmy Dako (Polyclonal Rabbit Anti-Human IgA/IgG/IgM/HRP) w stężeniu użytkowym od 1/1500 do 1/ W każdej serii doświadczenia badano surowicę kontrolną o wysokim poziomie przeciwciał dla użytych preparatów antygenowych. Wyznaczanie wartości cut-off. Wartość cut-off ustalono na poziomie średniej arytmetycznej poziomu przeciwciał (OD 450 ) w próbkach surowicy uzyskanych od 115 krwiodawców powiększonej o dwa odchylenia standardowe. Statystyczne opracowanie wyników. Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzono przy użyciu programu Instat (Instat Biostatistic). Istotność różnic w częstości wykrywania przeciwciał w próbkach surowicy osób należących do różnych grup oceniano testem niezależności chi-kwadrat z zastosowaniem poprawki Yatesa. Za znamienne statystycznie przyjęto różnice, gdzie poziomy istotności p były mniejsze od 0,05 (p<0,05). WYNIKI Częstość występowania przeciwciał dla antygenu somatycznego pałeczek S. Typhi w próbkach surowicy osób z ogniska epidemicznego duru brzusznego w Kraśniku oraz osób klinicznie zdrowych krwiodawców z Warszawy przedstawiono w tabeli 1. Przeciwciała dla antygenu somatycznego najczęściej wykrywano u osób chorych, z laboratoryjnie potwierdzonym durem brzusznym (80,0%). Przeciwciała te wykrywano również u przeszło połowy osób ze styczności z chorymi na dur brzuszny. Zarówno u osób chorych jak i osób ze styczności najczęściej wykrywano przeciwciała klasy IgM (odpowiednio 60,0% oraz 46,4%).

4 168 W. Rastawicki, S. Kałużewski Nr 3-4 Tabela 1. Częstość występowania przeciwciał dla antygenu somatycznego pałeczek Salmonella Typhi w próbkach surowicy osób z laboratoryjnie potwierdzonym durem brzusznym z ogniska epidemicznego w Kraśniku, osób ze styczności z chorymi na dur brzuszny z Kraśnika oraz osób klinicznie zdrowych krwiodawców z Warszawy. Grupa badanych osób Osoby z laboratoryjnie potwierdzonym durem brzusznym Osoby ze styczności z chorymi na dur brzuszny Osoby klinicznie zdrowe - krwiodawcy z Warszawy Liczba próbek Liczba (odsetek) próbek surowicy dodatnich w odczynie ELISA z antygenem somatycznym pałeczek S. Typhi IgA IgG IgM IgA/IgG/IgM 15 5 (33,3%) 8 (53,3%) 9 (60,0%) 12 (80,0%) (27,1%) 47 (33,6%) 65 (46,4%) 72 (51,4%) (3,5%) 6 (5,2%) 3 (2,6%) 9 (7,8%) W tabeli 2 przedstawiono częstość występowania przeciwciał dla antygenu Vi pałeczek S. Typhi w próbkach surowicy osób z durem brzusznym z ogniska epidemicznego w Kraśniku, osób ze styczności z chorymi na dur brzuszny z Kraśnika oraz osób klinicznie zdrowych krwiodawców z Warszawy. Podobnie jak w przypadku oznaczeń wykonanych odczynem ELISA z antygenem somatycznym, najczęściej wykrywano przeciwciała dla antygenu Vi u osób chorych na dur brzuszny (53,3%), nieco rzadziej u osób ze styczności (45,0%). Przeciwciała dla antygenu Vi najczęściej należały do klasy IgG. Statystyczna analiza istotności różnic między wynikami oznaczeń poziomu przeciwciał u osób chorych, osób ze styczności i osób zdrowych wykazała, że odczynem ELISA istotnie częściej (p<0,05) wykrywano przeciwciała w mianie diagnostycznie znamiennym, zarówno dla antygenu somatycznego jak i antygenu Vi pałeczek Salmonella, u osób chorych na dur brzuszny i u osób ze styczności niż u krwiodawców. Tabela 2. Częstość występowania przeciwciał dla antygenu Vi pałeczek Salmonella Typhi w próbkach surowicy osób laboratoryjnie potwierdzonym durem brzusznym z ogniska epidemicznego w Kraśniku, osób ze styczności z chorymi na dur brzuszny z Kraśnika oraz osób klinicznie zdrowych krwiodawców z Warszawy. Grupa badanych osób Osoby z laboratoryjnie potwierdzonym durem brzusznym Osoby ze styczności z chorymi na dur brzuszny Osoby klinicznie zdrowe - krwiodawcy z Warszawy Liczba próbek Liczba (odsetek) próbek surowicy dodatnich w odczynie ELISA z antygenem Vi pałeczek S. Typhi IgA IgG IgM IgA/IgG/IgM 15 4 (26,7%) 6 (40,0%) 3 (20,0%) 8 (53,3%) (21,4%) 48 (34,3%) 36 (25,7%) 63 (45,0%) (3,5%) 4 (3,5%) 4 (3,5%) 7 (6,1%)

5 Nr 3-4 Przydatność odczynu ELISA w serodiagnostyce duru brzusznego 169 DYSKUSJA Laboratoryjna diagnostyka duru brzusznego opiera się zarówno na wykryciu pałeczek S. Typhi w próbkach materiału klinicznego jak też na wykazaniu podwyższonego poziomu przeciwciał dla antygenu somatycznego oraz antygenu rzęskowego w odczynie aglutynacji probówkowej (odczynie Widala). Badania bakteriologiczne, będące złotym standardem w diagnostyce duru, mogą dawać, zwłaszcza u bezobjawowych nosicieli czy też osób, u których stosowano wcześniejszą antybiotykoterapię, wyniki fałszywie ujemne. Z drugiej strony, mogą występować fałszywie dodatnie wyniki odczynu Widala u osób zamieszkałych na terenach endemicznych dla duru brzusznego (8). Z tego względu, za diagnostycznie znamienny należałoby przyjąć co najmniej czterokrotny wzrost poziomu przeciwciał w dwóch kolejnych próbkach surowicy. Od szeregu lat podejmowane są udane próby zastąpienia odczynu Widala, odczynem immunoenzymatycznym ELISA, umożliwiającym oznaczenie poziomu przeciwciał dla antygenów somatycznych osobno w klasach IgA, IgG i IgM (10, 12, 13). Badania te wykazały, ze odczyn ELISA, charakteryzujący się wysoką czułością i swoistością, zwłaszcza podczas poszukiwania przeciwciał klasy IgG, może być efektywną metodą w diagnostyce duru brzusznego. Niewątpliwą zaletą zastosowania odczynu ELISA jest również fakt, że przy użyciu tej metody możliwe jest zbadania dużej liczby próbek surowicy w krótkim czasie, co może mieć znaczenie w przypadku wystąpienia masowych ognisk epidemicznych duru brzusznego. Zazwyczaj jako antygen w odczynie ELISA stosowany jest lipopolisacharydowy antygen somatyczny O. Trzeba mieć na uwadze, że ze względu na podobieństwo budowy antygenowej pałeczek Salmonella możliwe są nieswoiste reakcje krzyżowe z przeciwciałami skierowanymi dla pałeczek Salmonella należących innych serotypów. W serodiagnostyce duru brzusznego wykonywanej odczynem ELISA, oprócz antygenu somatycznego, został także wykorzystany antygen rzęskowy H (3, 5). Według Jesudason i wsp. (5) czułość i swoistość odczynu ELISA z antygenem somatycznym O wynosiła odpowiednio 89,4% i 94,9%, natomiast z antygenem rzęskowym H 68,1% oraz 97,4%. Badania serologiczne wykonywane odczynem ELISA mogą być także przydatne do badania nosicielstwa pałeczek duru brzusznego. Przez szereg lat wykorzystywano do tego celu odczyn hemaglutynacji biernej z preparatem antygenu Vi. Przyjęcie diagnostycznie znamiennego miana przeciwciał (>80) dla antygenu Vi w tym odczynie pozwoliło odróżnić nosicieli pałeczek duru brzusznego od zdrowych osób nie będących nosicielami (6). Autorzy ci podkreślają jednakże, że w serodiagnostyce nosicielstwa S. Typhi należy się liczyć z pewnym odsetkiem nosicieli, u których nie wykrywa się w surowicy przeciwciał anty Vi, lub poziom tych przeciwciał jest bardzo niski. Przykładowo, Losonsky i wsp. (9) wykryli odczynem ELISA obecność przeciwciał dla antygenu Vi u 81% nosicieli pałeczek S. Typhi i tylko u 12% osób z ostrą postacią duru brzusznego. Dur brzuszny występuje endemicznie w Indiach i Pakistanie, w Afryce, w Dalekowschodniej Azji, na Środkowym Wschodzie oraz w Ameryce Południowej i Środkowej. W krajach europejskich, w tym w Polsce, dur brzuszny występuje obecnie sporadycznie. Ze względu jednak na intensywny ruch turystyczny, istnieje możliwość, że dur brzuszny może być do Polski zawleczony. Z tego względu, szczepienia przeciw durowi brzusznemu są zalecane nie tylko pracownikom służb komunalnych, ale także osobom wyjeżdżającym

6 170 W. Rastawicki, S. Kałużewski Nr 3-4 do krajów, gdzie dur brzuszny występuje endemicznie (14). W przypadku wykonywania szczepień ochronnych celowe jest monitorowanie poszczepiennej odpowiedzi immunologicznej. Idealnym narzędziem służącym temu celowi może być odczyn ELISA, który charakteryzuje się wysoką czułością i swoistością oraz umożliwia precyzyjne określenie poziomu poszczepiennych przeciwciał dla antygenów pałeczek S. Typhi w poszczególnych klasach immunoglobulin. Przykładem takiego zastosowania tej metody, jest odczyn ELISA z antygenem Vi opracowany przez Ferry i wsp. (2). W odczynie tym, u zdrowych, nieszczepionych dorosłych osób średnia wartość poziomu przeciwciał dla antygenu Vi wynosiła 5,3 jednostek/ml natomiast u zdrowych dzieci 1,4 jednostek/ml. W grupie osób poddanych szczepieniu polisacharydową szczepionką Vi S. Typhi średni poziom przeciwciał wzrastał z wartości 3,9 do 39,2 jednostek/ml. Według tych autorów, trzykrotny wzrost poziomu przeciwciał dla antygenu Vi po szczepieniu jest dowodem na skuteczność przeprowadzonych szczepień przeciwko durowi brzusznemu (2). Prezentowana praca jest próbą zastosowania odczynu immunoenzymatycznego ELISA, z antygenami uzyskanymi we własnym zakresie, do poszukiwania swoistych przeciwciał dla antygenów S. Typhi u osób podejrzanych o dur brzuszny. Ze względu na obecnie sporadyczne występowanie tych zakażeń w Polsce, w prezentowanej pracy do badań przeznaczono próbki surowicy uzyskane podczas ogniska epidemicznego duru brzusznego w Kraśniku w latach Brak danych epidemiologicznych, danych z wywiadu lekarskiego czy też konkretnych wyników uprzednio wykonanych badań laboratoryjnych utrudnił dokładną ocenę przydatności opracowanego odczynu ELISA do badania osób chorych na dur brzuszny czy też nosicieli pałeczek S. Typhi. Z tego względu, celowe wydaje się kontynuowanie badań nad przydatnością odczynu ELISA zarówno do serodiagnostyki duru brzusznego jak też do badania skuteczności szczepień przeciwko Salmonella Typhi wykonywanych na terenie kraju. PIŚMIENNICTWO 1. Barret TJ, Blake PA, Brown SL. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of human antibodies to Salmonella typhi Vi antigen. J Clin Microbiol 1983; 17: Ferry BL, Misbah SA, Stephens P i inni. Development of an anti-salmonella typhi Vi ELISA: assessment of immunocompetence in healthy donors. Clin Exp Immunol 2004; 136: House D, Wain J, Ho VA i inni. Serology of typhoid fever in an area of endemicity and its relevance to diagnosis. J Clin Microbil 2001; 39: Jagielski M, Kałużewski S. Serodiagnostyka duru brzusznego i durów rzekomych. Wyd. Metod. PZH Warszawa Jesudason MV, Sridharan G, Arulselvan R i inni. Diagnosis of typhoid fever by the detection of anti-lps and anti-flagellin antibodies by ELISA. Indian J Med Res 1998; 107: Kałużewski S, Zaleska M. Serologiczna diagnostyka nosicielstwa Salmonella typhi niektóre aspekty metodyki i interpretacji odczynu hemaglutynacji biernej z antygenem Vi. Med Dośw Mikrobiol 1975; 27: Kopacka B. Immunologiczne i immunochemiczne badania nad antygenami Salmonella ze szczególnym uwzględnieniem antygenów O i Vi Salmonella typhi. Wyd. Metod. PZH, Warszawa Levine M,M, Grados O, Woodward WE i inni. Diagnostic value of the Widal test in areas endemic for typhoid fever. Am J Trop Med Hyg. 1978; 27:

7 Nr 3-4 Przydatność odczynu ELISA w serodiagnostyce duru brzusznego Losonsky GA, Ferreccio C, Kotloff KL i inni. Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for serum Vi antibodies for detection of chronic Salmonella typhi carriers. J Clin Microbiol 1987; 25: Nardiello S, Pizzella T, Russo M, Galanti B. Serodiagnosis of typhoid fever by enzyme-linked immunosorbent assay determination of anti-salmonella typhi lipopolysaccharides antibodies. J Clin Microbil 1984; 20: Rastawicki W. Humoralna odpowiedź na wybrane antygeny pałeczek Yersinia enterocolitica i Yersinia pseudotuberculosis w przebiegu jersiniozy u ludzi. I. Występowanie i poziom przeciwciał dla somatycznych antygenów pałeczek Yersinia oraz wydzielniczych białek Yop wykrytych odczynem ELISA. Med Dośw Mikrobiol 2006; 58: Sippel JE, Hanafy HM, Diab AS i inni. Serodiagnosis of typhoid fever in pediatric patients by anti-lps ELISA. Trans R Soc Trop Med Hyg 1987; 81: Sippel J, Bukhtiari N, Awan MB i inni. Indirect immunoglobulin G (IgG) and IgM enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) and IgM capture ELISA for detection of antibodies to lipopolysaccharides in adult typhoid fever patients in Pakistan. J Clin Microbiol 1989; 27: Szczepienia Info. Portal internetowy: Otrzymano: 20 VII 2015 r Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP PZH w Warszawie

8