Identyfikacja pałeczek Yersinia enterocolitica z wykorzystaniem spektroskopii mas typu MALDI-TOF

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2012, 64: Identyfikacja pałeczek Yersinia enterocolitica z wykorzystaniem spektroskopii mas typu MALDI-TOF Rapid identification of Yersinia enterocolitica by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) Katarzyna Zacharczuk 1, Agnieszka Sulikowska 2, Ewa Nowacka 2, Jolanta Szych 1, Rafał Gierczyński 1 1 Zakład Bakteriologii. Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny, 2 ALAB Laboratoria Sp. z o.o. Pałeczki Yersinia enterocolitica reprezentujące bioserotypy 1B/O8, 4/O3 oraz 2/O9 identyfikowano przy użyciu spektrometru masowego typu MALDI- -TOF MS. Wszystkie badane szczepy na podstawie uzyskanych profili jonów białkowych i peptydowych zostały prawidłowo zaklasyfikowane na poziomie gatunku. ABSTRACT Introduction: Yersinia enterocolitica includes both human pathogenic and non-pathogenic strains. The pathogenic strains belong to two evolutionary lineages: European and American, of mild- and high- pthogenicity, respectively. Y. enterocolitica European bioserotypes 4/O3 and 2/O9 are one of the major etiological agents of human yersiniosis worldwide. American lineage Y. enterocolitica bioserotype 1B/O8 has recently emerged in Europe. Since 2004 this high-pathogenicity bioserotype is increasingly isolated from humans in Poland. The rapid and accurate identification of pathogenic Y. enterocolitica strains is essential for diagnostic purposes. The aim of this study was to assess the usefulness of commercially available MALDI-TOF mass spectroscopy for Y. enterocolitica identification and subtyping. Methods: A total of 33 strains of Y. enterocolitica belonging to bioserotype: 1B/O8 (n=2), 4/O3 (n=25) and 2/O9 (n=6) isolated from clinical specimens in Poland and 10 reference Y. enterocolitica 1B/O8 strains (Institute Pasteur, France) were used in this study. The identification of the Y. enterocolitica strains by MALDI-TOF MS was performed on MALDI Biotyper system (Bruker Daltonics, USA) with flexcontrol TM 3.0 software (Bruker Daltonics) according with the manufacturer s instruction.

2 124 K. Zacharczuk i inni Results: All of the tested Y. enterocolitica strains were correctly identified at the species level. However, American and European strains were not differentiated. Conclusions: Our data indicate that MALDI-TOF MS can be used as a first-line method for rapid identification of Y. enterocolitica strains at the species level in clinical microbiology laboratories. WSTĘP Gram-ujemne pałeczki należące do gatunku Yersinia enterocolitica charakteryzują się znacznym zróżnicowaniem cech fenotypowych i genotypowych. Na podstawie różnic we właściwościach biochemicznych oraz struktury antygenowej wyróżniono 6 grup biochemicznych oraz blisko 70 grup antygenowych. Gatunek ten obejmuje zarówno szczepy chorobotwórcze jak i niechorobotwórcze dla człowieka. Patogenne dla ludzi drobnoustroje należą do biotypów: 1B, 2, 3, 4, 5 oraz zaledwie do kilku grup serologicznych: O3; O5,27; O8; O9 (4, 6, 15). Chorobotwórcze szczepy pałeczek Y. enterocolitica są czynnikiem etiologicznym ostrej, odzwierzęcej choroby - jersiniozy, przebiegającej najczęściej pod postacią zapalenia żołądkowo-jelitowego lub zapalenia jelit. Według raportu Europejskiego Urzędu ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) z 2011 roku, pałeczki Y. enterocolitica są po pałeczkach Campylobacter i Salmonella (1, 4) drobnoustrojem najczęściej wywołującym zakażenia przewodu pokarmowego w Europie, w tym również w Polsce. Obecnie na świecie najczęściej od osób zakażonych pałeczkami Y. enterocolitica izolowane są szczepy należące do bioserotypu 4/O3 oraz 2/O9 (1, 6, 8) reprezentujące europejską linię filogenetyczną tego gatunku. Jednakże, w Europie, a w szczególności w Polsce, w latach odnotowywano narastanie liczby zachorowań na jersiniozę w wyniku zakażenia pałeczkami Y. enterocolitica bioserotypu 1B/O8 (11, 13). Drobnoustroje te są zaliczane do amerykańskiej linii filogenetycznej Y. enterocolitica, która obejmuje wysoce chorobotwórcze szczepy tego gatunku (8, 17). Charakteryzują się one zwiększoną zjadliwość wobec myszy laboratoryjnych oraz obecnością dodatkowych czynników chorobotwórczości (m.in.: fosfolipaza A, białka efektorowe Ysp, yersiniabaktyna), z których większość jest kodowana przez geny zlokalizowane w chromosomowej wyspie patogenności HPI (high-pathogenicity island). Ich działanie zwiększa potencjał chorobotwórczy tych bakterii (4, 9). Dotychczas pałeczki należące do bioserotypu 1B/O8 występowały głównie na terenie USA i były izolowane sporadycznie w Japonii (4, 12). W kolejnych latach doszło do rozprzestrzenienia się tej grupy drobnoustrojów w Polsce, a częstość wywoływanych zakażeń potwierdzona w badaniach bakteriologicznych i serologicznych systematycznie wzrastała (7, 17). Ze względu na możliwość cięższego przebiegu jersiniozy w wyniku zakażenia wywołanego przez wysoce chorobotwórcze pałeczki Y. enterocolitica 1B/O8 szybka identyfikacja tych pałeczek ma istotne znaczenie dla doboru właściwego toku leczenia i efektywnego nadzoru epidemiologicznego (7). Aktualnie stosowane, klasyczne metody fenotypowe są pracochłonne oraz czasochłonne, gdyż określenie biotypu pałeczek Y. enterocolitica może trwać nawet ponad 48 godzin. Istnieje więc potrzeba poszukiwania nowych metod

3 Spektroskopia MALDI-TOF w identyfikacji Y. enterocolitica 125 analitycznych, które pozwoliłyby na uzyskanie wyników w możliwie krótkim czasie przy maksymalnym ograniczeniu kosztów badań. Obecnie, oprócz kosztownych testów genetycznych, w diagnostyce mikrobiologicznej coraz powszechniej stosowana jest technologia MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectroscopy) wykorzystująca metodę spektrometrii masowej w połączeniu z laserową desorpcją / jonizacją matrycy oraz analizą czasu przelotu jonów (2, 14). Metoda ta opiera się na analizie unikatowego i charakterystycznego dla danego drobnoustroju, profilu białkowego i porównaniu go z wzorcowymi profilami białek szczepów referencyjnych, co umożliwia identyfikację badanego szczepu. Metoda ta znalazła obecnie zastosowanie w identyfikacji wielu gatunków bakterii, a także grzybów (3, 5). Zastosowanie technologii MALDI-TOF MS pozwala na skrócenie czasu identyfikacji wyizolowanych drobnoustrojów, do ok min przy niskim jednostkowym koszcie analizy (14). Celem pracy była ocena przydatności metody MALDI-TOF do identyfikacji chorobotwórczych dla człowieka szczepów Y. enterocolitica oraz sprawdzenie możliwości określenia ich przynależności do europejskiej lub amerykańskiej linii filogenetycznej. MATERIAŁY I METODY Szczepy bakteryjne. W badaniach posłużono się 43 szczepami Yersinia enterocolitica pochodzącymi z kolekcji Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH (n=33) i kolekcji Instytutu Pasteura, Francja, (n=10) reprezentującymi bioserotypy: 1B/O8, 4/O3 oraz 2/O9. Przygotowanie próbek do identyfikacji. Analiza spektrogramów. Szczepy bakteryjne Y. enterocolitica namnażano na podłożu stałym TSA przez 18 godz. w temp 27º C. Materiał w postaci pojedynczych kolonii nanoszono plastykową ezą do dołków metalowej płytki aparatu MALDI Biotyper. Następnie do każdego dołka dodawano 1µl komercyjnego preparatu matrix (kwas α-cyjano-4-hydroksy-cynamonowy) dostarczanego przez firmę Bruker Daltonics, USA i pozostawiono do wyschnięcia (max.15 min.). Analizę badanych materiałów przeprowadzono w aparacie MALDI Biotyper (seria Microflex, Bruker Daltonics, USA). Uzyskany dla każdego z badanych szczepów Y. enterocolitica, spektrogram przedstawiający profil jonów białkowych i peptydowych analizowano przy użyciu specjalistycznego oprogramowania informatycznego (FlexControl TM 3.0, Maldi Biotyper Automation Control version ), stanowiącego integralną częścią aparatu MALDI Biotyper. WYNIKI I OMÓWIENIE Uzyskany dla każdego z badanych szczepów profil jonów białkowych i peptydowych (spektrogram) został automatycznie porównany do wzorcowych profili referencyjnych drobnoustrojów, w tym 11 szczepów Y. enterocolitica, dostępnych w bazie danych (Bruker, Daltonics) przeznaczonej do rutynowej identyfikacji szczepów na poziomie gatunku. Podczas analizy zastosowano parametry opracowane przez producenta i postępowano zgodnie z jego zaleceniami. Wszystkie badane szczepy, reprezentujące bioserotypy: 1B/O8, 4/O3 oraz 2/O9, zostały prawidłowo zaklasyfikowane do gatunku Y. enterocolitica. Wynik ten pozwala stwierdzić, że urządzenie MALDI Biotyper (Bruker Daltonics, USA) może być

4 126 K. Zacharczuk i inni przydatne do szybkiej identyfikacji pałeczek Y. enterocolitica należących do bioserotypów obejmujących szczepy chorobotwórcze dla człowieka zwłaszcza, gdy badaniu poddaje się masę bakteryjną uzyskaną z pojedynczej kolonii. W kolejnym etapie analizy wyników porównywano spektrogramy poszczególnych badanych szczepów w celu ustalenia, czy istnieją znaczące różnice pomiędzy spektrogramami amerykańskich i europejskich biotypów Y. enterocolitica. Widma analizowano pod kątem obecności pików, których obecność, wysokość i pole powierzchni oraz charakterystyczny rozkład umożliwiłby różnicowanie pałeczek Y. enterocolitica na poszczególne bioserotypy lub linie filogenetyczne. Uzyskany dendrogram podobieństwa spektrogramów badanych szczepów Y. enterocolitica składał się z trzech głównych grup. Jednakże, każda z tych grup zawierała szczepy różnych bioserotypów użytych w pracy (Ryc.1.). Identyfikacja pików (biomarkerów) charakterystycznych dla danego bioserotypu pałeczek Y. enterocolitica nie była możliwa. Uzyskane w badaniach własnych wyniki są zgodne z obserwacjami poczynionymi przez zespół Ayyadurai i wsp. (2), który oceniał przydatność spektrometru mas typu MALDI - TOF Ryc1. Dendrogram podobieństwa badanych szczepów Y. enterocolitica należących do bioserotypów: 4/O3; 1B/O8 i 2/O9 utworzony na podstawie analizy spektrogramów otrzymanych przy użyciu metody spektroskopii mas typu MALDI-TOF (MALDI Biotyper, Bruker Daltonics). Skala przedstawia szacunkowe podobieństwo. Oznaczenie bioserotypów (BS) poszczególnych szczepów: A- bioserotyp 4/O3; B bioserotyp 1B/O8; C- bioserotyp 2/ O9.

5 Spektroskopia MALDI-TOF w identyfikacji Y. enterocolitica 127 do identyfikacji pałeczek z rodzaju Yersinia. Co ciekawe, zespół ten stwierdził użyteczność technologii MALDI TOF w różnicowaniu szczepów Y. pestis do trzech głównych biotypów: Antiqua, Medivalis, Orientalis. Z kolei Stephen i wsp. (16) uznali, iż technologia MALDI- -TOF MS jest narzędziem pozwalającym nie tylko na klasyfikację pałeczek Y. enterocolitica do gatunku, co jest zgodne z otrzymanymi wynikami własnymi, ale także na określenie ich biotypu. Autorzy w swoich badaniach posłużyli się szczepami Y. enterocolitica należącymi do biotypu: 2, 4 i 1A, przy czym nie uwzględnili wysoce chorobotwórczych szczepów bioserotypu 1B/O8. Z tego względu wyniki uzyskane przez ten zespół nie dają więc podstawy do jednoznacznego stwierdzenia, iż MALDI-TOF MS pozwala na identyfikację pałeczek Y. enterocolitica na poziomie biotypu. Należy podkreślić, że w celu różnicowania pałeczek Y. enterocolitica do poszczególnych biotypów Stephen i wsp. (16) posłużyli się pikami charakterystycznymi dla spektrogramów pałeczek określonego biotypu (biomarkerami), które zostały przez tych autorów wyselekcjonowane na drodze analiz bioinformatycznych. Natomiast w badaniach własnych stosowano jedynie bazę biomarkerów zdefiniowanych przez producenta aparatu MALDI Biotyper Microflex (Bruker Daltonics, USA). Kolejną publikacją mogącą wskazywać na kluczową rolę doboru biomarkerów w różnicowaniu pałeczek Y. enterocolitica jest praca zespołu Kraushaar i wsp. (10). Autorzy ci stosując spektrometrię mas efektywnie różnicowali uznawane za niepatogenne dla człowieka pałeczki Y. enterocolitica z biotypu 1A od innych chorobotwórczych szczepów tego gatunku, w tym należących do bioserotypu 1B/O8. Zdaniem autorów możliwe to było poprzez zastosowanie odpowiednio dobranego algorytmu i 12 wyselekcjonowanych biomarkerów. Wyniki uzyskane przez oba wyżej wymienione zespoły wskazują na znaczny analityczny potencjał metody MALDI-TOF i mogą sugerować, że dalsze dopracowanie baz danych i algorytmów różnicujących może zwiększyć przydatność tej technologii w diagnostyce mikrobiologicznej już w najbliższej przyszłości. W bakteriologicznej diagnostyce jersiniozy prawidłowe oznaczenie biotypu wyizolowanego szczepu Y. enterocolitica jest kluczowe, gdyż szeroko rozpowszechnione w przyrodzie niechorobotwórcze pałeczki tego gatunku są często izolowane z próbek kału osób zdrowych. Podsumowując wyniki własne oraz dane piśmiennictwa można stwierdzić, że metoda MALDI-TOF MS może być z powodzeniem stosowana do rutynowej identyfikacji pałeczek Y. enterocolitica w diagnostycznych laboratoriach mikrobiologicznych, zwłaszcza jako metoda przesiewowa. Użycie tej metody może pozwolić na skrócenie czasu wykonywania badania i obniżenie jego kosztów materiałowych. Jednakże używanie tej metody do ustalania biotypu pałeczek Y. enterocolitica w rutynowych badaniach diagnostycznych nie może być w obecnej chwili polecane. Baza systemu analitycznego MALDI Biotyper wymaga dalszych udoskonaleń, które mogą w przyszłości zaowocować możliwością efektywnego subtypowania pałeczek Y. enterocolitica. PIŚMIENNICTWO 1. Anonymous. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-born outbreaks in EFSA Journal 2011; 9(3): 2090 [378 pp.]. 2. Ayyadurai S, Flaudrops C, Raoult D, Drancourt M. Rapid identification and typing of Yersinia pestis and other species by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI- -TOF) mass spectrometry. BMC Microbiol 2010; 10: 285.

6 128 K. Zacharczuk i inni 3. Azarko J, Wendt U. Spektroskopia masowa - nowa metoda identyfikacji drobnoustrojów. Nowa Klinika 2011; 18: Bottone EJ. Yersinia enterocolitica: overview and epidemiologic correlates. Microb Infect 1999; 1: Emonet S, Shah HN, Cherkaaoui A, Schrenzel J. Application and use of various mass spectroscopy methods in clinical microbiology. Clin Microbiol Infect 2010; 16: Fredriksson-Ahoma M, Stolle A, Korkeala H. Molecular epidemiology of Yersinia enterocolitica infections. FEMS Immunol Med Microbiol 2006; 47: Furman S, Napiórkowska A, Sadkowska-Todys M. Jersinioza w Polsce w 2009 roku. Przegl Epidemiol 2011; 65: Gierczyński R, Szych J, Rastawicki W i inni. Molecular characterization of human clinical isolates of Yersinia enterocolitica bioserotype 1B/O8 in Poland: emergence and dissemination of three highly related clones. J Clin Microbiol 2009; 47: Haller JC, Carlton S, Pederson KJ, Pierson DE. A chromosomally encoded type III secretion pathway in Yersinia enterocolitica is important in virulence. Mol Microbiol 2002; 36: Kraushaar B, Dieckmann R, Wittwer M i inni. Characterization of a Yersinia enterocolitica biotype 1A strain harbouring an ail gene. J Appl Microbiol 2011; 4: Rastawicki W, Szych J, Gierczyński R, Rokosz N. A dramatic increase of Yersinia enterocolitica serogrup O:8 infections in Poland. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009a; 28: Rastawicki W, Gierczyński R. Expression, purification and characterization of the humoral immune response to recombinant MyfA protein of Y. enterocolitica. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009b; 28: Schubert S, Bockemuhl J, Brendler U, Heesemann J. First isolation of virulent Yersinia enterocolitica O8, biotype 1B in Germany. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2003; 22: Seng P, Drancourt M, Gouriet F i inni. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis 2009; 49: Skurnik M, Toivonem S. Identification of distinct lipopolysaccharide patterns among Yersinia enterocolitica and Y. enterocolitica like bacteria. Biochemistry (Moscow) 2011; 76: Stephan R, Cernela N, Ziegler D i inni. Rapid species specific identification and subtyping of Yersinia enterocolitica by MALDI-TOF mass spectrometry. J Microbiol Methods 2011; 87: Szych J. Jersinioza - nowe zagrożenie mało znaną chorobą. Nowa Klinika 2011; 18: Otrzymano: 19 VI 2012 r. Adres Autora: , Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii, NIZP-PZH kzacharczuk@pzh.gov.pl