IDENTYFIKACJA cdna I CHARAKTERYSTYKA GENU OHP2 (One Helix Protein 2) Pharbitis nil CHOIS

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2008 z. 524: 521-528 IDENTYFIKACJA cdna I CHARAKTERYSTYKA GENU OHP2 (One Helix Protein 2) Pharbitis nil CHOIS Karol Stawski, GraŜyna Dąbrowska, Anna Goc Zakład Genetyki, Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Wstęp W roślinach zielonych rolę anten energetycznych, zarówno fotosystemu I jak i fotosystemu II, pełnią białka LHC (ang. Light-Harvesting Complex), które wiąŝą się z róŝnymi rodzajami barwników (chlorofile, ksantofile), będących bardzo wydajnymi fotoreceptorami, charakteryzujących się zdolnością do absorpcji kwantów światła. Typowe białka LHC posiadają trzy helisy transbłonowe (MSH, ang. Membrane- Spanning Helix), z których pierwsza i trzecia są do siebie podobne i ewolucyjnie konserwowane. U roślin wyŝszych i zielenic rodzina białek LHC składa się z więcej niŝ 20 róŝnych członków, których pierwotną funkcją jest absorpcja energii świetlnej i przenoszenie jej do fotochemicznego centrum reakcji, ale pośród tej grupy moŝna równieŝ wyróŝnić białka zaangaŝowane w rozpraszanie nadmiaru zaabsorbowanej energii, które chronią aparat fotosyntetyczny przed fotouszkodzeniem [LI i in. 2000; MONTANÉ, KLOPPSTECH 2000]. Do nich zalcza się: - białka PsbS (ang. Photosystem II Subunit) zasocjowane z PS II, zawierajęce cztery MSH, - białka ELIP (ang. Early Light-Induced Proteins), która obejmuje białka zawierające trzy MSH, - białka SEP (ang. Stress-Enhanced Proteins) z dwiema MSH, - białka OHP (ang. One-Helix Proteins), u prokariota zwane HLIP (ang. High- Light-Induced Proteins), posiadające pojedynczą MSH. Białka OHP wykazujące wysoką homologię do białek HLIP cyjanobakterii. Geny OHP są ciągle jeszcze mało poznane. U eukariota dotychczas zostały opisane dla Arabidopsis thaliana (roślina dnia długiego) [JANSSON i in. 2000; ANDERSSON i in. 2003] i Pharbitis nil (roślina dnia krótkiego) [DĄBROWSKA i in. 2002]. MoŜna przypuszczać, Ŝe białka OHP jak i HLIP pełnią waŝną funkcję w rozpraszaniu nadmiaru energii, a tym samym chronią rośliny przed fotozniszczeniem. Wystawienie roślin na działanie światła, które przewyŝsza moŝliwości zaadoptowania tej energii fotochemicznie prowadzi do inaktywacji fotosystemów i produkcji reaktywnych form tlenu, które są przyczyną fotoinhibicji [NIYOGI 1999]. Celem niniejszej pracy było zidentyfikowanie genu OHP2 Pharbitis nil CHOIS w celu dokładniejszej charakterystyki rodziny białek OHP i określenia stopnia zaangaŝowania genu w odpowiedź na stres świetlny. Materiały i metody Materiał roślinny

522 K. Stawski, G. Dąbrowska, A. Goc Materiał badawczy stanowiły liścienie siewek wilca wielokwiatowego (Pharbitis nil CHOIS) odmiany Violet (Marutane Seed Co., Kyoto, Japan). Nasiona skaryfikowano chemicznie przy uŝyciu kwasu siarkowego i następnie moczono przez około 24 godzin, w wodzie destylowanej w temperaturze 26 C, w celu spęcznienia. Spęczniałe nasiona wysiewano do doniczek z mieszaniną wilgotnego piasku i wermikulitu (1 : 2) i inkubowano przez 6 dni w komorze klimatyzacyjnej, na świetle ciągłym (100 µmol m -2 s -1 ) w temperaturze 26 C. Po upływie 6 dni część doniczek przestawiano do ciemności na okres szesnastu godzin. Izolacja RNA, synteza i amplifikacja cdna NawaŜkę świeŝej tkanki rozcierano w ciekłym azocie, w wypraŝonym moździerzu i izolowano zgodnie z protokołem [CHOMCZYŃSKI, SACCHI 1987]. Ilość wyizolowanego RNA określano spektrofotometrycznie w urządzeniu GENEQUANT (Pharmacia). Do syntezy cdna uŝywano 2 µg RNA, które oczyszczano 1 jednostką DNazy I (Sigma) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odwrotną transkrypcję prowadzono w temperaturze 42 C przy uŝyciu 100 jednostek enzymu MMLV (Promega) ze starterami oligo d(t), (IBB PAN). Amplifikację cdna PnOHP2 prowadzono za pomocą specyficznych starterów zaprojektowanych do sekwencji EST P. nil o numerze CJ769605 (PnOHP2_R 5 ATGCCGGTAA CATCATCTCC 3 i PnOHP2_F 5 TTCAGGTTGGAGGACAGACA 3 ) w objętości 50 µl w reakcji PCR. Ustalono następujące warunki PCR: 30 cykli - 95 C (45 s), 56 C (45 s), 72 C (45 s). Badanie ekspresji genu (półilościowy RT-PCR) Odwrotna transkrypcja połączona z reakcją PCR pozostaje nadal jedną z najbardziej czułych metod detekcji często nawet bardzo rzadkich transkryptów mrna, a odpowiednio zoptymalizowana pozwala na wyznaczenie ilości cdna genu w próbie. Ilość kopii badanej cząsteczki PnOHP2 była badana w przebiegającej wykładniczo reakcji PCR w Ŝelu agarozowym z EtBr po wizualizacji w UV. Jako transkrypt referencyjny wykorzystano gen β-aktyny, gdyŝ naleŝy on do genów metabolizmu podstawowego, który wraz z cdna OHP2 amplifikowano równocześnie z uŝyciem specyficznych starterów (AC1 5 ACTACCAT GTTCCCCGGTAT 3 i AC2 5 CCGGACTCATCATACTCTGC 3 ). Klonowanie produktu RT-PCR genu PnOHP2 do wektora ptz57r/t Klonowanie wykonano zestawem InsTAclone TM PCR CloninG Kit (Fermentas). Do transformacji wykorzystywano komórki E. coli JM107 ukompetentnione chemicznie zestawem TransformAid TM Bacterial Transformation System (Fermentas). Selekcję kolonii prowadzono na poŝywce S-GAl TM /LB Agar Blend (Sigma) z ampicyliną o stęŝeniu 50 µg m -1. Z bakterii po całonocnej hodowli, na poŝywce płynnej LB z ampicyliną (50 µg ml -1 ), izolowano DNA plazmidowe metodą lizy alkalicznej. Obecność wstawki oraz jej orientację sprawdzono z wykorzystaniem reakcji PCR, prowadząc reakcję z parą starterów komplementarnych do wstawki (PnOHP2_R i PnOHP2_F) lub jednocześnie do wektora (uniwersalny starter T7) i wstawki (PnOHP2_R lub PnOHP2_F) Sekwencjonowanie i analiza uzyskanej sekwencji Sekwencjonowanie cdna genu PnOHP2, sklonowanego w wektorze ptz57r/t, przeprowadzono w Pracowni Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oligonukleotydów

IDENTYFIKACJA cdna I CHARAKTERYSTYKA GENU... 523 Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie. Do analizy sekwencji uŝyto programów BLAST i CLUSTALW. Wyniki W celu znalezienia homologów genu OHP2 rzodkiewnika (A. thaliana), (GenBank no. AY057393) w genomie P. nil CHOIS sekwencję OHP2 porównano z danymi zawartymi w bazie danych EST (ang. Expressed Sequence Tags) P. nil naleŝącej do NCBI (National Center for Biotechnology Information). Porównanie wykazało, Ŝe najwyŝszą homologię na poziomie sekwencji nukleotydowej OHP2 A. thaliana wykazuje względem sekwencji o numerze CJ769605 (74 % zgodności na odcinku 391 pz). Sekwencja ta wielkości 711 pz została przepisana na sekwencję aminokwasową przy uŝyciu programu TRANSLATE. W sekwencji zidentyfikowano otwartą ramkę odczytu (nukleotydy 97-592) o długości 165 aminokwasów (rys. 1). Otrzymana sekwencja aminokwasowa EST P. nil została uŝyta do przeszukania bazy sekwencji białek zawartych w NCBI. Przeprowadzona analiza potwierdziła wysoką homologię białek OHP2 P. nil i A. thaliana. Podobieństwo między nimi wynosiło 73% (rys. 2). Rys. 1. Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa klonu cdna PnOhp2 wyizolowanego z cdna roślin Pharbitis nil hodowanych przez 6 dni w warunkach ciągłego światła Fig. 1. Nucleotide and amino acid sequence of PnOhp2 cdna clone isolated from cdna of Pharbitis nil plants grown for 6 days in constant light

524 K. Stawski, G. Dąbrowska, A. Goc W celu potwierdzenia ekspresji genu OHP2 w liścieniach P. nil CHOIS zaprojektowano specyficzne startery do sekwencji EST o numerze CJ769605 (PnOHP2_R i PnOHP2_F). Na bazie cdna, przygotowanego z mrna wyizolowanego z roślin wzrastających przez 6 dni na świetle ciągłym w temperaturze 26 C, wykonano reakcję PCR. Uzyskany produkt wklonowano do wektora ptz57r/t. W wyniku sekwencjowania cdna genu PnOHP2 otrzymano sekwencję o długości 528 pz, którą za pomocą programu CLUSTALW porównano z sekwencją EST o numerze CJ769605. Wykonana analiza wykazała ich 100% zgodność, co potwierdziło prawidłowość przyjętej wcześniej sekwencji aminokwasowej białka PnOHP2 (rys. 1). Wykonano analizę ekspresji PnOHP2 w liścieniach P. nil CHOIS z wykorzystaniem techniki półilościowego RT-PCR w dwóch wariantach świetlnych: światło ciągłe i szesnastogodzinna ciemność (rys. 3). Badanie wykazało spadek aktywności genu PnOHP2 w czasie subiektywnej nocy. Rys. 3. Analiza ekspresji OHP2 P. nil, wykonana techniką półilościowego RT-PCR, w liścieniach roślin hodowanych na świetle ciągłym (K) lub w szesnastogodzinnej ciemności (16) Fig. 3. Expression analysis of P. nil OHP2, by semiquantitative RT-PCR, in cotyledons of plants growing in constant light (K) or 16 hour darkness (16) Dyskusja Znane są obecnie u A. thaliana (rośliny dnia długiego) dwa geny naleŝące do rodziny OHP, oznaczone jako OHP1 i OHP2, które ulegają ekspresji zarówno w warunkach niskiego jak i wysokiego natęŝenia światła, ale których aktywność wzrasta proporcjonalnie do intensywności światła. Akumulacja białek i transkryptów genu OHP2 jest wywoływana wyłącznie przez stres świetlny. Wiadomo, Ŝe inne rodzaje stresu takie jak: zasolenie, deficyt wody czy niska temperatura nie mają wpływu na poziom tego białka w tylakoidach [ANDERSSON i in. 2003]. U P. nil znaleziono do tej pory tylko jeden gen OHP, kodujący 116 reszt aminokwasowych, którego sekwencja jest homologiczna do genu OHP1 A. thaliana [DĄBROWSKA i in. 2002]. Przeprowadzone badania umoŝliwiły poznanie kolejnego członka tej rodziny białek. Zidentyfikowany gen PnOHP2 jest regulowany prawdopodobie światłem (rys. 3). Koduje białko składające się z 165 aminokwasów. N- koniec peptydu zawiera sekwencję sygnałową o długości 76 aminokwasów, typową dla białek jądrowych transportowanych do chloroplastów, co wykazała analiza przeprowadzona programem ChloroP. Dojrzały peptyd składa się więc prawdopodobnie z 89 aminokwasów. Badając hydrofobowość aminokwasów wyodrębniono, podobnie jak u innych białek OHP, pojedynczą helisę transbłonową MSH zlokalizowaną na C- końcu (aminokwasy od 123 do 146) (rys. 2). Białka OHP2 A. thaliana i P. nil

IDENTYFIKACJA cdna I CHARAKTERYSTYKA GENU... 525 charakteryzują się bardzo wysoką homologią szczególnie w rejonie C-końcowym. Podobieństwo aminokwasowe pomiędzy domenami MSH obu roślin wynosi 100% (rys. 2), co przypuszczalnie moŝe mieć związek z pełnioną funkcją i/lub bliskim pokrewieństwem ewolucyjnym. Zachowanie konserwowanych rejonów białka, odpowiedzialnych między innymi za wiązanie barwników, potwierdza wzrost homologii obu białek z 73% do 89%, po wykluczeniu sekwencji sygnałowych do chloroplastu (rys. 2). Przeprowadzona analiza sekwencji genu PnOHP2 pozwala przypuszczać, Ŝe koduje on konserwowane ewolucyjnie pomiędzy P. nil i A. thaliana białko OHP2. Odpowiednikiem eukariotycznych białek OHP są prokariotyczne HLIP, po raz pierwszy zidentyfikowane u Synechococcus sp. (szczep PCC7942) jako białka kodowane przez geny, których ekspresja jest wzbudzana przez silne światło [DOLGANOV i in. 1995]. Wysokie podobieństwo pomiędzy sekwencją aminokwasową PnOHP2 a HLIP występuje w obrębie sekwencji tworzącej MSH. Analogiczne, wysokie podobieństwo MSH PnOHP2 stwierdzono do pierwszej i trzeciej domeny MSH eukariotycznych białek PsbS, zbudowanych z czterech α-helikalnych domen. Funkcja białek PsbS jest determinowana przez ich zdolność do wiązania ksantofili [ASPINALL- O DEA i in. 2002]. Szczególne znaczenie w ochronie aparatu fotosyntetycznego przed nadmiarem energii ma zeaksantyna, tworząca się na silnym świetle z wiolaksantyny w wyniku reakcji cyklu ksantofilowego [DEMMING-ADAMS, ADAMS 1996]. Protonacja dwóch glutamin PsbS skierowanych do wnętrza tylakoidu, prowadzi do konformacyjnych zmian w PS II i do wygaszania wzbudzonych cząstek chlorofilu przez przeniesienie energii wzbudzenia na cząsteczki ksantofili związane z białkami PsbS, ograniczając w ten sposób ilość powstających reaktywnych form tlenu [LI i in. 2000, 2004]. Pomiar energii wzbudzenia dla zeaksantyny i wiolaksantyny wskazuje na to, Ŝe te dwie molekuły są zdolne do przejmowania energii z singletowych form chlorofilu [FRANK i in. 2000]. Zachowanie rejonów homologicznych pomiędzy białkami PsbS i PnOHP2 moŝe mieć bezpośredni związek ze zdolnością do wiązania zeaksantyny, lecz natura wiązania barwników przez te białka moŝe być jednak zupełnie odmienna od interakcji, jakie zachodzą pomiędzy innymi białkami LHC a barwnikami. PsbS są aktywne w połączeniu z PS II, a białka OHP2 mogą stanowić podstawowy mechanizm ochronny dla PS I, na co wskazuje lokalizacja OHP2 A. thaliana [ANDERSSON i in. 2003]. Nie jest wykluczone, Ŝe do osiągnięcia właściwej aktywności, monomery białka OHP2 ulegają oligomeryzacji, tworząc struktury przestrzenie podobne do tych, jakie posiadają białka PsbS. Uzyskana sekwencja PnOHP2 posłuŝy w przyszłości do określenia czy gen ten jest regulowany zegarem okołodobowym i jaki rodzaj światła wpływa na akumulację jego transkryptów. Literatura ANDERSSON U., HEDDAD M., ADAMSKA I. 2003. Light stress-induced one-helix protein of the chlorophyll a/b binding family associated with photosystem I. Plant Physiol. 132: 811-820. ASPINALL-O'DEA M., WENTWORTH M., PASCAL A., ROBERT B., RUBAN A., HORTON P. 2002. In vitro reconstitution of the activated zeaxanthin state associated with energy dissipation in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 16331-16335. CHOMCZYŃSKI P., SACCHI N. 1987. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156-159. DĄBROWSKA G., KIDOŃ M., GOC A., TRETYN A. 2002. Regulowana światłem i specyficzna

526 K. Stawski, G. Dąbrowska, A. Goc tkankowo ekspresja homologa genu OHP u Pharbitis nil. Mat. konf. nauk XXXVIII Zjazd Polskiego Towarzystwa Biochemicznego, 18-22 IX 2002 Wrocław: 87. DEMMIG-ADAMS B., ADAMS W.W. 1996. The role of xanthophylls cycle carotenoids in the protection of photosynthesis. Trends Plant Sci. 1: 21-26. DOLGANOV N.A.M., BHAYA D., GROSSMAN A.R. 1995. Cyanobacterial protein with similarity to the chlorophyll a/b binding proteins of higher plants: Evolution and regulation. Plant Biol. 92: 636-640. FRANK H.A., BAUTISTA J.A., JOSUE J.S., YOUNG A.J. 2000. Mechanism of non-photochemical quenching in green plants: energies of the lowest excited singlet states of violaxanthin and zeaxanthin. Biochemistry 39: 2831-2837. JANSSON S., ANDERSSON J., KIM S.J., JACKOWSKI G. 2000. An Arabidopsis thaliana protein homologous to cyanobacterial high-light-inducible proteins. Plant Mol. Biol. 42: 345-351. LI X-P., BJÖRKMAN O., SHIH C., GROSSMAN A.R., ROSENQUIST M., JANSSON S., NIYOGI K. 2000. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature 403: 391-395. LI X-P., GILMORE A.M., CAFFARRI S., BASSI R., GOLAN T., KRAMER D., NIYOGI K.K. 2004. Regulation of Photosynthetic Light Harvesting involves intrathylakoid lumen ph sensing by the PsbS protein. J. Biol. Chem. 279: 22866-22874. MONTANÉ M-H., KLOPPSTECH K. 2000. The family of light-harvesting-related proteins (LHCs, ELIPs, HLIPs): was the harvesting of light their primary function? Gene 258: 1-8. NIYOGI K.K. 1999. Photoprotection revisited: Genetic and molecular approaches. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: 333-359. Stosowane skróty: EST sekwencyjne znaczniki ekspresji; Expressed Sequence Tags IBB PAN Instytut Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk; Institute of Biochemistry and Biophysics Polish Academy of Sciences MMLV odwrotna transkryptaza kodowana przez wirusa leukemii Moloneya; reverse transcriptase encoded by Moloney Murine Leukemia Virus MSH transbłonowa α-helisa; Membrane-Spanning Helix Słowa kluczowe: stres świetlny, OHP (ang. One-Helix Proteins), Pharbitis nil CHOIS, analiza sekwencji Streszczenie Rodzina białek OHP (ang. One Helix Protein) roślin wyŝszych, jest jądrowo kodowaną grupą białek indukowanych stresem świetlnym, gromadzonych w błonach tylakoidów, spokrewnionych z rodziną białek wiąŝących chlorofil LHC (ang. Light- Harvesting Complex). Przepisuje się im funkcje ochronną przed fotozniszczeniem. W celu lepszego poznania ewolucji i funkcji białek OHP wyizolowaliśmy cdna genu OHP2 P. nil. Wykazuje ono wysoką homologię do genu OHP2 A. thaliana. PnOHP2 jest przypuszczalnie syntezowany jako peptyd długości 165 aminokwasów, którego N- końcowa część zawiera peptyd sygnałowy typowy dla białek transportowanych do

IDENTYFIKACJA cdna I CHARAKTERYSTYKA GENU... 527 chloroplastu (długości ok. 76 aminokwasów). C-końcowa część białka PnOHP2 posiada transmembranową domenę α-helikalną. Na podstawie sekwencji aminokwasowej genu PnOHP2 rozwaŝamy funkcje tego białka w chloroplaście badanej rośliny. cdna IDENTIFICATION AND CHARACTERISTICS OF THE OHP2 (One Helix Protein 2) GENE OF Pharbitis nil CHOIS Karol Stawski, GraŜyna Dąbrowska, Anna Goc Department of Genetics, Nicolaus Copernicus University, Toruń Key words: light stress, OHP (One-Helix Proteins), Pharbitis nil, sequence analysis Summary The family of one helix protein (OHP) in higher plants is nuclear-encoded, light stress induced, located in thylakoid membranes and related to light-harvesting chlorophyll a/b-binding (LHC) proteins. A photoprotective function was proposed for OHPs. To learn more about the evolution and possible function of chloroplastic Ohp, we isolated cdna encoding OHP2 P. nil. This cdna encodes protein very closely related to OHP2 from A.thaliana. PnOHP2 is probably synthesized as a 165-amino acid precursor protein, containing an amino terminal transit peptide (approximately 76 amino acid long). C terminus of this protein contains a single transmembrane α-helix. Based on amino-acid sequence of PnOHP2 we discuss a possible role of that protein in chloroplast. Mgr Karol Stawski Zakład Genetyki Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej Uniwersytet Mikołaja Kopernika ul. Gagarina 9 87-100 TORUŃ e-mail: stawski@biol.uni.torun.pl

Rys. 2. Porównanie sekwencji aminokwasowej OHP2 P. nil z sekwencją aminokwasową OHP2 A. thaliana wykonane w programie CLUSTAL W. Sekwencje sygnałową białek zaznaczono przez podkreślenie, a konserwowaną domenę MSH wyróŝniono kursywą. Gwiazdki oznaczają identyczne aminokwasy w obu porównywanych sekwencjach Fig. 2. The comparison of amino acid sequence of OHP2 P. nil with amnio acid sequence of the A.thaliana protein Ohp2 performed by the program CLUSTAL W. The putative transit peptide is underlined, and conserved MSH is shown in italics. The stars indicated the same amino acid in both sequences