Przegląd piśmiennictwa Journal Club

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2013 Volume 49 Number 3 263-274 Przegląd piśmiennictwa Journal Club Markery nowotworowe w praktyce klinicznej: przegląd informacji dotyczący nowotworów litych W pracy dokonano w oparciu o rekomendacje różnych grup ekspertów, przeglądu użyteczności w praktyce klinicznej najczęściej oznaczanych markerów nowotworowych. W opinii EGTM (European Group on Tumor Markers), ASCO (American Society of Clinical Oncology), NACB (American National Academy of Clinical Biochemistry) niezadowalająca czułość oraz stosunkowo niska swoistość diagnostyczna wyników oznaczeń markerów ograniczają w znacznej mierze możliwości wykorzystania wyników ich oznaczeń dla wykrywania stanów przedrakowych lub choroby nowotworowej we wczesnych stadiach. Wyniki badań samych markerów, zwłaszcza przy niskim częstości występowania choroby, cechują się niską dodatnią wartość predykcyjną. Podejmowane są jednak próby wykorzystania markerów w kompleksie z wynikami badań innymi technikami diagnostycznymi w odniesieniu do wyselekcjonowanych grup o zwiększonym ryzyku zagrożenia chorobami nowotworowymi o określnej lokalizacji. Wykorzystywanie markerów w diagnostyce nowotworów Ograniczona czułość i swoistość diagnostyczna oznaczeń markerów we wczesnych stadiach zaawansowania choroby wyklucza zasadniczo możliwości ich wykorzystania w diagnostyce nowotworów. Jednak podkreśla się przydatność badań markerów różnicowaniu zmian łagodnych i złośliwych u chorych objawowych. EGTM zaleca wykonywanie oznaczeń CA 125 w różnicowaniu zmian łagodnych od nowotworowych w zlokalizowanych w obrębie miednicy mniejszej u kobiet po menopauzie. W opinii ekspertów kobiety z podwyższonym poziomem CA 125 (powyżej 35 U/l) powinny być kierowane do ośrodków specjalizujących się w ginekologicznych operacjach onkologicznych, a nie do placówek ginekologiczno-położniczych. Kolejnym markerem pomocnym w diagnostyce różnicowej zmian łagodnych i złośliwych jest AFP. Sugeruje się celowość oznaczeń tego markera w wykrywaniu pierwotnego raka wątroby (HCC). Stosownie do zaleceń Amerykańskiego Towarzystwa do Badań Chorób Wątroby (American Associated for the Study of Liver Disease), możliwość rozwoju tego nowotworu u chorych z marskością wątroby i z guzami o średnicy większej od 2 cm jest bardzo wysoka. Jeżeli poziom AFP przekracza 200 ng/ml a ocena radiologiczna wskazuje na raka wątroby, nie zaleca sie wykonywania u tych chorych biopsji. Podobne stanowisko reprezentuje NACB. Wśród ekspertów panuje natomiast zgodność opinii, że oznaczenia AFP mają ograniczoną użyteczność w guzach mniejszych od 2 cm. Wykorzystywanie markerów w ocenie rokowania chorych Zgodnie z definicją markery prognostyczne dostarczają informacji o prawdopodobnym przeżyciu chorego po zdiagnozowaniu choroby. Umożliwiają one m.in. wyselekcjonowanie chorych z agresywną chorobą, którzy mogliby odnieść korzyści z dodatkowych terapii lub chorych którzy nie wymagają takiego rodzaju leczenia. Wśród markerów o potwierdzonym już znaczeniu rokowniczym rozważa się: CEA dla raka jelita grubego, CA 125 dla raka jajnika, AFP, HCG i LDH dla nowotworów jąder, czy PSA dla raka stercza. W raku piersi, zwłaszcza w grupie z niezajętymi węzłami chłonnymi, zalecane jest przez grupy ekspertów: ASCO, NACB i EGTM, wykonywanie testu Oncotype DX analizującego aktywność 21 genów, chociaż dopiero obecnie jest prowadzona jego walidacja w dużym prospektywnym randomizowanym badaniu klinicznym TAILORx. Według ASCO, w ocenie rokowania nowo zdiagnozowanych chorych z niezajętymi węzłami chłonnymi mogą być wykorzystywane również oznaczenia urokinazowego aktywatora plazminogenu (upa) i jego inhibitora (PAI-1) w cytozolu. U kobiet z obecnymi receptorami dla hormonów estrogenowych i progesteronowych, które będą otrzymywać uzupełniającą terapię endokrynną, niskie poziomy upa i PAI-1 są wiązane z obniżonym ryzykiem nawrotu choroby i te chore nie muszą być obciążone leczeniem chemicznym. Wysoki poziom tych wskaźników natomiast sygnalizuje wzmożone ryzyko nawrotu i uznawany jest za wskazanie do wdrożenia chemioterapii uzupełniającej wg schematu CMF. Predykcyjna wartość markerów nowotworowych. Zgodnie z definicją markery predykcyjne umożliwiają prospektywną ocenę prawdopodobieństwa odpowiedzi lub oporności na specyficzne leczenie. Mogą być również pomocne w określeniu optymalnej dawki leku jak i oceny przewidywania jego toksyczności, w tym względzie szczególnie dokładnie przebadano markery u chorych na raka piersi. Wskazuje się na obowiązkową ocenę stanu receptorów estrogenowych i progesteronowych, w celu wyselekcjonowania chorych kwalifikujących się do hormonoterapii (tamoksyfen czy inhibitory aromatazy), oraz receptora typu 2 dla naskórkowego czynnika wzrostu (HER-2) przy kwalifikacji chorych do leczenia transtuzumabem (herceptyna) lub lapatinibem. Ostatnio wśród nowych predykcyjnych markerów wymienia się mutacje KRAS dla określenia odpowiedzi na przeciwciała przeciwko naskórkowemu czynnikowi wzrostu (cetuksimab i panitumunab) w zaawansowanym raku jelita grubego i mutacje EGFR dla wyselekcjonowania chorych na zaawansowanego niedrobnokomórkowego raka płuca (NDRP) do leczenia inhibitorami receptorowych kinaz tyrozynowych (gefitinib i erlotinib). 263

Użyteczność markerów w kontroli chorych po leczeniu pierwotnym Dobrze jest udokumentowana użyteczność markerów w pooperacyjnej kontroli chorych na nowotwory o różnej lokalizacji narządowej i ocenie efektywności leczenia. Oznaczenia markerów mogą być przydatne w celu wczesnego stwierdzenia nawrotu lub przerzutów odległych, ponieważ wzrost stężenia markera może wystąpić wcześniej przed klinicznym lub radiologicznym potwierdzeniem wznowy. Sugerowano, że wczesne wykrycie wznowy i/lub przerzutów odległych po leczeniu pierwotnym zwiększa szansę wyleczenia lub poprawia przeżycie chorych, jednak obecnie dostępne dowody, nie potwierdzają tego przypuszczenia. CEA w raku jelita grubego Wiele badań wskazuje, że po radykalnej operacji raka jelita grubego, chorzy poddawani intensywnym badaniom kontrolnym wraz z pomiarem stężenia CEA cechują się istotnie lepszym przeżyciem niż ci będący w kontroli bez oznaczeń CEA. Zarówno w rekomendacjach ASCO jak i EGTM zalecany jest pomiar CEA po operacji chorych na raka jelita grubego. Według EGTM u chorych w II i III stadium zaawansowania, CEA powinno być oznaczane co 2-3 miesiące przez przynajmniej 3 lata gdy w przypadku wystąpienia przerzutu do wątroby będą oni kandydatami do operacji lub leczenia systemowego. Pomimo tak restrykcyjnych zaleceń różnych grup ekspertów, brak jest wytycznych określających zakres zmian w poziomie markera który byłby uznany za klinicznie istotny. EGTM proponuje co najmniej 30%-wy wzrost poziomu w stosunku do badania poprzedniego. Zalecane jest, aby przed rozpoczęciem terapii, jeszcze raz potwierdzić wzrost w kolejnej próbce pobranej w ciągu miesiąca i dopiero wtedy zastosować poszerzoną diagnostykę obrazową. AFP i HCG u chorych na nowotwory zarodkowe Wyróżnia się dwa główne typy histologiczne nowotworów zarodkowych: nasieniaki i nie nasieniaki. Idealnym rozwiązaniem wydaje się oznaczanie markerów AFP i HCG w monitorowaniu zwłaszcza leczenia chemicznego chorych z nienasieniakowatymi guzami zarodkowymi jąder. Te dwa markery są czułymi wskaźnikami statusu choroby germinalnej tj. stabilizacji, progresji lub remisji. Panuje zgodność opinii, że u chorych po orchidektomii nienasieniakowatych nowotworów jądra, rosnące poziomy AFP lub HCG, przy nieobecności radiologicznych lub klinicznych oznak reaktywizacji choroby wskazują na aktywną chorobę i mogą być podstawą do rozpoczęcia leczenia. Wg rekomendacji ASCO, AFP i HCG powinny być oznaczane podczas badań kontrolnych po zakończeniu określonej terapii nienasieniakowatych nowotworów zarodkowych, niezależnie od stadium zaawansowania. Pomiary powinny być wykonywane co 1-2 miesięcy przez pierwszy rok, co 2-4 miesięcy w drugim roku, co 3-6 miesięcy w 3 i 4 roku, co 6 miesięcy w 5 roku, a następnie raz do roku. Kontrolę należy kontynuować przynajmniej przez 10 lat od zakończenia terapii. W przypadku czystych nasieniaków zalecane jest oznaczanie HCG i/lub LDH. CA 125 w raku jajnika Kliniczna wartość seryjnych oznaczeń CA 125 po leczeniu podstawowym chorych na raka jajnika jest niejasna. Ostatnio zakończone randomizowane badania nie potwierdziły korzyści w przeżyciu chorych z wdrożonym wcześniej, to znaczy po wzroście stężenia markera leczeniem, chociaż lead time CA 125 wynosi ok. 4-5 miesięcy. Wiele jest również wątpliwości odnośnie czasu leczenia chorych na raka jajnika z reaktywizacją procesu nowotworowego i użyteczności w tym względzie oznaczeń markera. O ile NACB zaleca wykonywanie seryjnych pomiarów CA 125 po operacji chorych i rozpoczęciu leczenia systemowego, to EGTM jest przeciwny takim praktykom. W wyniku tych sprzecznych rekomendacji, praktycznym rozwiązaniem wydaje się pozwolić chorym decydować. PSA w raku stercza U chorych ze zdiagnozowanym rakiem stercza, niezależnie czy otrzymują aktywne leczenie (radykalna prostatektomia, radioterapia, czy brachyterapia), czy tylko są pod aktywnym nadzorem, zaleca się regularne oznaczanie PSA. Po radykalnej prostatektomii poziom markera powinien obniżyć się do wartości niewykrywalnych, wzrost PSA powyżej 0,2 ng/ ml uważany jest za niepowodzenie biochemiczne po tym leczeniu radykalnym. Zmiany stężenia PSA po radykalnej radioterapii są znacznie wolniejsze, a wzrost o 2 ng/ml powyżej nadiru zaproponowano jako definicje niepowodzenia radioterapii. Wśród ekspertów brak jest jednomyślności czy wprowadzenie leczenia ratunkowego opartego o takie definicje nawrotu za pomocą oceny poziomu PSA poprawią przeżycie i jakość życia chorych. CA 15-3 w raku piersi Stosunkowo często oznaczenia CA 15-3 wykorzystywane są w kontroli chorych na raka piersi pomimo braku jednoznacznych dowodów, że ich seryjne oznaczenia wpływają na poprawę przeżycia chorych. Wytyczne odnośnie wykorzystywania oznaczeń CA 15-3 w monitorowaniu bezobjawowych chorych po zdiagnozowaniu raka piersi różnią się. O ile ASCO jest przeciwne rutynowemu wykorzystywaniu oznaczeń markera w tym zakresie, to EGTM dopuszcza możliwość ich wykonywania. W opinii NACB, we wczesnym wykrywaniu nawrotów/przerzutów, CA 15-3 nie powinno być rutynowo wykorzystywane u chorych ze zdiagnozowanym rakiem piersi, jednak ze względu na fakt, że dla niektórych chorych jak i lekarzy ważna wydaje się być znajomość poziomu markera, decyzję odnośnie wykonywania badania należy podejmować wspólnie. Użyteczność markerów w monitorowaniu leczenia systemowego Stosunkowo często wykorzystuje się oznaczenia markerów 264

nowotworowych podczas monitorowania leczenia systemowego u chorych w zaawansowanym stadium nowotworu. Najczęściej ocenia się te same markery co w badaniach kontrolnych. Spadek poziomu markerów podczas terapii koreluje z regresją guza a wzrost wskazuje na progresje choroby. Nie zaleca się jednak wykorzystywania tylko wyników markerów nowotworowych w ocenie odpowiedzi na leczenie chorych w zaawansowanych stadiach choroby. Powodem negatywnych opinii jest możliwość wystąpienia przejściowego wzrostu stężenia markera w ciągu kilku pierwszych tygodni podawania leków. Ten przejściowy wzrost może być wynikiem nekrozy komórek nowotworowych lub apoptozy w odpowiedzi na rozpoczęcie chemioterapii. Takiego przejściowego wzrostu nie obserwuje się w terapiach biologicznych (przeciwciałami) np. herceptyna, cetuksymabem lub panitumumabem. Podsumowując, tylko w niektórych sytuacjach markery mogą być użyteczne jako oddzielne kryterium dla podejmowania decyzji klinicznych. Dotyczy to zwłaszcza markerów mających znaczenie predykcyjne tj. receptorów estrogenowych i HER2 w raku piersi lub AFP i HCG w podejmowaniu decyzji u pacjentów ze zdiagnozowanymi nienasieniakowatymi nowotworami jąder. W innych sytuacjach klinicznych, przydatność markerów jest mniej klarowna np. rola PSA w skryningu raka stercza, CA 125 w nadzorze chorych po operacji i chemioterapii raka jajnika czy CA 15.3 w nadzorze chorych ze zdiagnozowanym rakiem piersi. Aby uzyskać odpowiedź na te pytania powinny być prowadzone dalsze badania. Według: Duffy MJ. Tumor markers in clinical practice: a review focusing on common solid cancers. Med Princ Pract 2013; 22: 4-11. Ewa Wójcik Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej Centrum Onkologii, Oddział w Krakowie Ekspresja receptorów hormonalnych a przeżycia w raku jajnika: badanie wieloośrodkowe Rak jajnika powoduje rocznie 140000 zgonów i jest najbardziej śmiercionośnym nowotworem ginekologicznym w krajach wysoko rozwiniętych. W inwazyjnym raku jajnika wyróżnia się 5 histologicznych podtypów: surowiczy rak niskozróżnicowany (HGSC), surowiczy rak wysokozróżnicowany (LGSC), rak śluzowy, rak endometrioidalny i rak jasnokomórkowy. Obecność biologicznych markerów różni się w poszczególnych podtypach i ich znaczenie rokownicze może nie być wystarczająco wyraźne w analizach łączących wszystkie typy raka jajnika. Co więcej, częstość występowania innych niż HGSC typów raka jajnika jest niewielka, co praktycznie uniemożliwia wykonanie analiz w zależności od typów raka i utrudnia znalezienie biologicznych markerów przeżycia w badanych podtypach. Nie jest jasne czy status hormonalny w raku jajnika może wpływać na rokowanie i leczenie. Dotychczasowe opracowania wykazują, że ekspresja receptorów hormonalnych: estrogenowego (ER) i progesteronowego (PR) w raku jajnika ma związek z lepszym rokowaniem, lecz badania te nie są powtarzalne. Autorzy Weiva Sieh i wsp. przebadali wycinki tkankowe pochodzące od 2933 chorych na inwazyjnego raka jajnika z 12 międzynarodowych ośrodków. Do badania włączono podtypy: HGSC, LGSC, rak śluzowy, endometrioidalny i jasnokomórkowy. W centralnym laboratorium oznaczono ekspresję receptorów hormonalnych (ER i PR) metodą immunohistochemiczną. Oceny dokonano w skali trójstopniowej: <1%, 1-<50% i 50% komórek z dodatnią reakcją na obecność receptorów. W każdym przypadku znane były dane kliniczne: długość przeżycia, wiek chorych, stopień histologicznego zróżnicowania guza i stan zaawansowania choroby. Przeprowadzono analizę przeżycia chorych w zależności od ekspresji receptorów hormonalnych w poszczególnych podtypach raka jajnika. Była ona różna w poszczególnych podtypach. Odsetek guzów z dodatnią reakcją na zawartość PR był najwyższy w raku endometrioidalnym i LGSC, średni w HGSC a najniższy w raku śluzowym i jasnokomórkowym. We wszystkich podtypach większość guzów wykazywała dodatnią reakcję na zawartość ER niż PR. Odsetek guzów z ekspresją receptorów hormonalnych (ER i/lub PR) był wyższy w LGSC (91%), HGSC (84%) i raku endometrioidalnym (82%) niż w raku śluzowym (23%) i jasnokomórkowym (21%). Silna ekspresja PR niezależnie wpływała na przeżycia chorych na HGSC (p=0,0080). W raku tym nie stwierdzono takiej zależności dla receptora estrogenowego (ER). Podobne wyniki uzyskano dla LGSC. Ekspresja PR a nie ER korelowała z lepszymi przeżyciami (p=0,019). W raku endometrioidalnym jajnika zarówno słaba jak i silna ekspresja ER i PR niezależnie od innych czynników kliniczno morfologicznych (umiejscowienie, wiek, zaawansowanie kliniczne i stopień histologicznego zróżnicowania) korelowała z lepszymi przeżyciami. Chore, których rak endometrioidalny wykazywał ekspresję PR miały mniejsze prawdopodobieństwo zgonu z powodu choroby niż chore, których guz nie wykazywał ekspresji tego receptora (p=0,0012). Podobnie chore z guzami endometrioidalnymi wykazującymi dodatnią reakcję na zawartość ER (p<0,0001). Ten najlepszy model prognostyczny dla raka endometrioidalnego pozwala włączyć chore z guzami wykazującymi dodatnią reakcję na zawartość receptorów hormonalnych (ER i/lub PR) do grupy niskiego ryzyka. Weiva Sieh i wsp. nie stwierdzili korelacji pomiędzy ekspresją receptorów hormonalnych a przeżyciem u chorych na raka śluzowego i jasnokomórkowego. W raku endometrioidalnym jajnika dodatnia reakcja na zawar- 265

tość receptorów hormonalnych korelowała z wyższym stopniem histologicznego zróżnicowania nowotworu (p=0,0007) oraz brakiem makroskopowo stwierdzanej choroby resztkowej (p=0,041). W HGSC ekspresja PR korelowała z niskim stopniem zaawansowania choroby (p=0,0029). Autorzy opracowania wykazali, że chore na raka endometrioidalnego z hormonalnie dodatnim guzem miały mniejsze prawdopodobieństwo zgonu z powodu nowotworu niż chore z guzami z ujemną reakcją na obecność receptorów hormonalnych. Podobnie chore na HGSC z silną reakcją na zawartość receptora progesteronowego. W tym badaniu w raku endometrioidalnym wpływ ekspresji receptorów hormonalnych na przeżycia był silniejszy niż stopień histologicznego zróżnicowania czy rozległość choroby resztkowej. Duża skala tego badania pozwalająca na wykorzystanie wieloośrodkowych danych umożliwiła zidentyfikowanie klinicznie ważnych markerów prognostycznych dla raka jajnika. Dłuższe przeżycia chorych na raka endometrioidalnego i HGSC z ekspresją receptorów hormonalnych mogą wynikać z biologicznego charakteru guzów lub być wynikiem zwiększonej odpowiedzi na leczenie. Receptor dla estrogenu (ER-α) jest zasadniczym markerem odpowiedzi na leczenie tamoxifenem w raku piersi. Receptor dla progesteronu (PR) jest wskaźnikiem zwiększonej odpowiedzi na leczenie progestagenem w raku endometrialnym, raku o zbliżonym profilu genetycznym do raka endometrioidalnego i HGSC. Brak jest jednak danych z badań randomizowanych i nierandomizowanych oceniających efektywność leczenia tamoksifenem w raku jajnika po nawrocie choroby. Niektóre badania kliniczne dowodzą, że ekspresja ER może korelować ze zwiększoną odpowiedzią na letrozol w nawrotowym raku jajnika. Zasadniczo, lepsze przeżycia chorych z guzami hormonalnie dodatnimi można częściowo wyjaśnić zwiększoną liczbą chorych, które odpowiedziały na leczenie hormonalne, jakkolwiek odsetek tych, które odpowiedziały na leczenie u wszystkich chorych na raka jajnika jest niewielki. Znaczenie prognostyczne receptora dla progesteronu a nie dla estrogenu zostało potwierdzone w dotychczasowych badaniach, w których oceniano łącznie wszystkie typy raka jajnika, jednak HGSC był typem dominującym. Receptor dla progesteronu indukuje apoptozę w komórkach raka jajnika. Jego ekspresja może być dobrym markerem prognostycznym, ponieważ jest wskaźnikiem prawidłowej aktywacji receptora progesteronowego (PR) przez receptor estrogenowy (ER-α), a biologia takich guzów jest mniej agresywna. Brak ekspresji PR w guzach ER dodatnich jest wynikiem utraty funkcjonalności ER i ma związek z gorszymi prognozami. Tak więc silna ekspresja PR pozwala zidentyfikować odrębną grupę chorych które mogą odnieść korzyść z leczenia hormonalnego. Wyniki niniejszej pracy niosą potencjalnie ważne wnioski mogące mieć zastosowanie w praktyce klinicznej u chorych z rakiem jajnika. Immunohistochemiczna analiza ekspresji ER i PR w HGSC i raku endometrioidalnym mogą służyć lekarzom w praktyce klinicznej w podejmowaniu decyzji terapeutycznych, dzieląc chore na te, które wymagają agresywnej chemioterapii i te, które mogłyby odnieść korzyści z mniej toksycznego leczenia hormonalnego. Niektóre dane z programów klinicznych pokazują, że część pacjentów odpowiada na leczenie hormonalne. Potrzebne są jednak dodatkowe badania kliniczne na dużych grupach chorych, badających biomarkery w poszczególnych podtypach raka jajnika, by ustalić czy ER i PR są wskaźnikiem odpowiedzi na leczenie hormonalne i być narzędziem do personalizowanego leczenia. Według: Weiva S, Kobel M, Longacre TA, et al. Hormonereceptor expression and ovarian cancer survival: an Ovarian Tumor Tissue Analysis consortium study. The Lancet Oncology 2013; 14: 853-62. Anna Kruczak Zakład Patologii Nowotworów Centrum Onkologii, Oddział w Krakowie Wpływ wieku na przeżycia chorych na raka piersi z nadekspresją receptora HER2: wyniki badania klinicznego z użyciem Herceptyny w leczeniu adjuwantowym Rak piersi jest główną przyczyną zgonów z powodu nowotworów u chorych poniżej 40 roku życia w krajach wysokorozwiniętych, a średnie wskaźniki przeżycia są gorsze niż u chorych w starszym wieku. Biologiczne i kliniczne podstawy tych różnic nie zostały dotychczas wyjaśnione. Analizowanych jest wiele potencjalnych czynników. U osób młodych częściej diagnozuje się chorobę w bardziej zaawansowanych stadiach. W tej grupie rozwijają się też bardziej agresywne podtypy raka piersi. Ponadto w niektórych przypadkach raki u młodych kobiet są mniej wrażliwe na konwencjonalną chemioterapię. W szczególności guzy u kobiet w młodym wieku cechują się niższym stopniem histologicznego zróżnicowania, brakiem receptorów hormonalnych, wyższym indeksem proliferacyjnym oraz zajęciem naczyń limfatycznych i/lub żylnych (lymphovascular invasion). Sprzeczne są dowody na to czy nadekspresja HER2 związana jest z wiekiem. Wcześniejsze badania sugerowały że młody wiek jest niezależnym czynnikiem ryzyka dla nawrotów choroby i śmierci chorych na raka piersi. Jakkolwiek, brak jest jednak badań dotyczących prognostycznego znaczenia wieku w kontekście molekularnych podtypów raka, których wpływ na przeżycia chorych byłby potwierdzony. To czy wiek pozostaje niezależnym czynnikiem prognostycznym, przy równoczesnym uwzględnieniu znaczenia molekularnych podtypów czy innych czynników prognostycznych (zaawansowanie choroby i zróżnicowanie histologiczne 266

raka, itd.) pozostaje niejasne, w świetle faktu, że u młodych kobiet rozwijają się bardziej agresywne podtypy raka piersi. A.H.Partridge i wsp. podjęli próbę ocen, czy wiek jest niezależnym czynnikiem prognostycznym u chorych na raka piersi w badaniu HERA randomizowane badanie III fazy do którego włączano kobiety chore na raka piersi z nadekspresją receptora HER2, we wczesnym stadium zaawansowania choroby, po zabiegu operacyjnym z/lub radioterapią oraz minimum czterech cyklach neo-adjuwantowej chemioterapii. Chore były randomizowane albo do grup otrzymujących trastuzumab (przez 1 lub 2 lata), albo były poddane obserwacji po ukończeniu chemioterapii. Autorzy opracowania postawili hipotezę, że w przypadku HER2 dodatniego raka piersi chore w młodym wieku mają zwiększone ryzyko nawrotów choroby i gorsze wskaźniki przeżycia a leczenie trastuzumabem przynosiłoby różne korzyści w zależności od wieku. Badania wykonano w dwóch grupach chorych: 1703 kobiet leczonych przez 1 rok trastuzumabem i 1698 kobiet wyznaczonych do obserwacji (grupa kontrolna). Przeprowadzono analizę jednoparametrową wpływu wieku na długość przeżyć bezobjawowych (DFS) i całkowitych (OS), traktowanego jako zmienna ciągła i skokowa (z podziałem chorych na te w wieku 40 i mniej lat i w wieku powyżej 40 lat). Modele były budowane oddzielnie dla grupy leczonej trastuzumabem i osobno dla grupy kontrolnej. Prognostyczne znaczenie wieku było też oceniane w analizie wieloparametrowej obok stopnia zaawansowania klinicznego, stopnia histologicznego zróżnicowania guza, statusu receptorów hormonalnych i typu chemioterapii. Spośród 3401 kobiet włączonych do analizy, 722 (21%) było w wieku 40 lat, a 2679 (79%) w wieku powyżej 40 lat. U kobiet młodszych rzadziej stwierdzano chorobę w stadium N0 (28% vs 34%), chore te częściej miały guzy hormonalnie dodatnie, dla ER (51% vs 44%) a dla PR (41%vs 32%), częściej były leczone taksanami (32% vs 25%), antracyklinami (97% vs 93%) i częściej stosowano u nich terapię hormonalną (56% vs 49%). W analizie jednoparametrowej wiek nie okazał się być czynnikiem prognostycznym dla przeżyć bezobjawowych (DFS) jak i całkowitych (OS). W analizie wieloparametrowej wykazano, że w grupie otrzymującej trastuzumab wpływ na długość przeżyć bezobjawowych miały: obecność przerzutów do węzłów chłonnych (p<0,001), oraz stopień histologicznego zróżnicowania guza (p=0002). Natomiast średnica guza równa lub mniejsza niż 2 cm korelowała z dłuższymi okresami przeżyć bezobjawowych (p=0,04). Nie wykazano znaczenia znaczenia: wieku, statusu hormonalnego oraz terapii antracyklinami i taksanami. Wyniki były podobne w grupie kontrolnej, jakkolwiek w grupie tej znaczenie prognostyczne miała też ekspresja receptora estrogenowego (ER) (p=0,003), natomiast znaczenia prognostycznego dla DFS nie miał stopień histologicznego zróżnicowania guza. Wyniki analizy wieloparametrowej dla przeżyć całkowitych w obydwu badanych grupach dały podobne rezultaty. Jakkolwiek w grupie leczonej trastuzumabem leczenie taxanami miało związek z gorszymi przeżyciami (p<0,001), a leczenie antracyklinami z dłuższymi okresami przeżyć całkowitych (p=0,007). Wiek nie miał znaczenia prognostycznego w żadnej z przeprowadzonych analiz. Wyniki te wskazują że wiek nie jest czynnikiem predykcyjnym dla korzyści odnoszonych z leczenia trastuzumabem. Analiza ta prezentuje pierwsze badanie predykcyjnego znaczenia wieku kobiet z guzami z nadekspresją HER2 leczonych trastuzumabem.wiele wcześniejszych badań sugerujących, że wiek jest niezależnym czynnikiem prognostycznym nie brało pod uwagę statusu receptora HER2. Blows i wsp. analizując wpływ wieku na przeżycia chorych na raka piersi u 10159 chorych (dane z 12 badań) wykazali, że ryzyko śmierci jest większe u kobiet w wieku poniżej 40 roku życia. Arvold i wsp. w grupie 1434 chorych na raka piersi dowiódł, że wraz ze wzrostem wieku chorych niezależnie od innych czynników spada ryzyko lokalnych nawrotów choroby. Obydwa te badania były jednak przeprowadzone w grupach chorych na raka piersi leczonych przed erą rutynowego stosowania trastuzumabu w leczeniu HER2 dodatnich raków piersi we wczesnym stadium zaawansowania choroby. Należy jednak zwrócić uwagę, że niniejsze badanie ma swoje ograniczenia ze względu na krótki okres obserwacji. Dodatkowych badań wymagają nasze nieoczekiwane wyniki, że leczenie taksanami skraca, a leczenie antracyklinami wydłuża przeżycia chorych leczonych trastuzumabem. W tej retrospektywnej analizie HER2 dodatnich chorych na raka piersi we wczesnym stopniu zaawansowania klinicznego leczonych trastuzumabem wykazano, że wiek nie jest niezależnym czynnikiem prognostycznym, ani też predykcyjnym dla korzyści wynikających z leczenia trastuzumabem po adjuwantowej chemioterapii. Wyniki pracy sugerują, że obecnie, dzięki coraz lepszej molekularnej charakterystyce raków piersi a co za tym idzie stosowaniu terapii takich jak trastuzumab do określonych molekularnych podtypów raka piersi, znaczenie wieku ulegnie zminimalizowaniu jeśli nie całkowitej utracie. Pojawia się potrzeba lepszego zrozumienia faktu, że u młodych kobiet rozwijają się bardziej agresywne podtypy raka piersi a także skupienie wysiłków na zapobieganiu i leczeniu raka u młodych kobiet. Według: Partridge AH, Gelber S, Piccart-Gebhart et al. Effect of Age on Breast Cancer Outcomes in Women With Human Epidermal Growth Factor Receptor 2-Positive Breast Cancer: Results From a Herceptin Adjuvant Trial. JCO 2013; 31 (21): 2692-2698. Anna Kruczak Zakład Patologii Nowotworów Centrum Onkologii, Oddział w Krakowie 267

Rak piersi u kobiet przyjmujących digoksynę: charakterystyka guza i ryzyka nawrotu choroby Digoksyna jest to fito-estrogen często stosowany w leczeniu pacjentów z chorobami serca. Jej budowa umożliwia wiązanie się z receptorem estrogenowym (ER) i dlatego wydaje się, że może powodować ginekomastię. Kobiety, które przyjmują digoksynę mają od 30% do 50% zwiększone ryzyko rozwoju raka piersi i raka macicy, w porównaniu do osób nie przyjmujących tego leku. Wzrost ryzyka wystąpienia tych nowotworów złośliwych, można tłumaczyć aktywnością preparatu podobną do estrogenów. W przedstawionej pracy, autorzy oceniali wpływ przyjmowania digoksyny na parametry kliniczno-patologiczne i ryzyko nawrotu choroby. Autorzy przypuszczali, że ryzyko nawrotu choroby będzie większe u kobiet z dodatnimi receptorami estrogenowymi (ER-dodatnie) w porównaniu do chorych z ujemnymi receptorami (ER-ujemne), ponieważ digoksyna może wywierać swoje działanie poprzez receptory estrogenowe. Obecność tych receptorów umożliwia stosowanie leków antyestrogenowych. W praktyce klinicznej stosowane są leki antyestrogenowe o dwóch różnych mechanizmach działania. Tamoxifen, oraz inne leki należące do tej grupy blokują receptory estrogenowe, co może ograniczać niepożądane działanie digoksyny u kobiet z rakiem piersi. Natomiast, inhibitory aromatazy, to grupa leków, które redukują stężenie estrogenów, nie wpływają więc na mechanizm działania digoksyny. W związku z tym, autorzy przypuszczali, że ryzyko nawrotu choroby związane z przyjmowaniem digoksyny, może być większe u kobiet leczonych inhibitorami aromatazy, w porównaniu do grupy chorych otrzymujących tamoxifen. W pracy analizowano dane zgromadzone w duńskiej grupie Breast Cancer Cooperative, w której od 1978 roku, gromadzone są informacje dotyczące kobiet z rakiem piersi w Dani. Ponieważ nie zawsze można było precyzyjnie określić przyczynę zgonu, jako punkt odniesienia, autorzy przyjęli pierwszy nawrót choroby. Nawrót zdefiniowano jako pojawienia się nowego guza (lokalny/regionalny nawrót, rak drugiej piersi, lub przerzuty).uznane czynniki prognostyczne (histologia, wielkość guz i stan węzłów chłonnych) oceniano u chorych już przyjmujących digoksynę w trakcie diagnostyki raka piersi, natomiast współczynnik ryzyka (HR) nawrotu choroby, oceniano u chorych kontynuujących i rozpoczynających przyjmowanie digoksyny po zdiagnozowaniu raka piersi. Do obliczeń współczynnika ryzyka nawrotu choroby (Hazard ratio 95% CI) korzystano z modelu regresji Coxa. Zgodnie z kryteriami Protokółu Badań, wykluczone były kobiety z zaawansowaną chorobą nowotworową lub współistniejącymi chorobami, u których stosowano indywidualny, niestandardowy schemat leczenia. Zgodę na prowadzenie badań wyraziła duńska Rada ds. Przeglądu Etycznego i Duńska Agencja Ochrony Danych. Autorzy pracy donoszą, że u kobiet przyjmujących digoksynę, u których diagnozowano raka piersi, istotnie częściej obserwuje się obecność receptorów estrogenowych, niski stopień zaawansowania oraz wolne węzły chłonne w porwaniu do kobiet nie przyjmujących digoksyny. W analizie kompletnych danych 33,496 chorych, w której uwzględniono takie dane jak: wiek, czas od diagnozy choroby, stopień złośliwości histopatologicznej, stan węzłów chłonny, wielkość guza oraz stan receptorów estrogenowych, autorzy nie wykazali różnic istotnych statystycznie dla współczynnika ryzyka nawrotu choroby (HR) pomiędzy chorymi stosującymi aktualnie digoksynę, a chorymi nie przyjmującymi tego leku. Jakkolwiek, w pierwszym roku obserwacji wartość współczynnika HR była wyższa, w porównaniu do chorych nie przyjmujących tego leku. Natomiast po pierwszym roku, wartość HR u chorych leczonych digoksyną była istotnie niższa w porównaniu do wartości HR podczas pierwszego roku. Autorzy oceniali wpływ digoksyny na wartość HR w zależności od stanu receptorów estrogenowych. W grupie chorych z dodatnim receptorem estrogenowym, przyjmujących digoksynę, wznowa procesu nowotworowego wystąpiła u 13 chorych w pierwszym roku od zdiagnozowania raka piersi. Natomiast, u kobiet również leczonych digoksyną, ale z ujemnym receptorem estrogenowym, tylko u jednej chorej wystąpił nawrót choroby w ciągu pierwszego roku od jej rozpoznania. U chorych przyjmujących digoksynę, autorzy nie wykazali różnic istotnych statystycznie pomiędzy współczynnikami ryzyka nawrotu choroby, w odniesieniu do stanu receptorów estrogenowych. Po pierwszym roku, współczynniki ryzyka nawrotu choroby u kobiet przyjmujących digoksynę, bez względu na stan receptorów estrogenowych były podobne i wynosiły u chorych z ER-dodatnie HR 0,98 (95% CI 0,71-1,36) oraz ER-ujemny HR 0,97 (95% CI 0,45-2,09), (P = 0.98). Autorzy oceniali również wpływ leków antyestrogenowych o różnym mechanizmie działania na współczynnik ryzyka nawrotu choroby nowotworowej u chorych leczonych digoksyną. Warunkiem stosowania tego leczenia była obecność receptorów estrogenowych. Oceniając ryzyko nawrotu choroby u chorych przyjmujących digoksynę w zależności od rodzaju stosowanej terapii antyestrogenowej, autorzy obserwowali 26 wznów u chorych leczonych tamoxifenem i tylko 4 wznowy u chorych przyjmujących leki z grupy inhibitorów aromatazy. Obserwowane różnice pomiędzy współczynnikami ryzyka wystąpienia wznowy (tamoxifen HR 1.04 vs. inhibitor aromatazy HR 1.87), nie były jednak statystycznie istotne. Autorzy nie potwierdzili istotnych różnic pomiędzy czasem przyjmowania digoksyny a współczynnikiem ryzyka nawrotu choroby. W chorych leczonych digoksyną, w tkance nowotworowej częściej stwierdzano obecne receptory estrogenowe, niski stopień złośliwości a chore miały rzadziej zajęte węzły chłonne w porównaniu do chorych nie przyjmujących digoksyny. Autorzy sugerują, że istnieje pewne podobieństwo pomiędzy kobietami chorymi na raka piersi, które przyjmują digoksynę, a kobietami w okresie menopauzy stosującymi hormonoterapię zastępczą. W obu grupach chorych obserwujemy częściej guzy z obecnymi receptora- 268

mi estrogenowymi, charakteryzującymi się lepszymi czynnikami prognostycznymi. Atutem omawianej pracy są wyniki uzyskane z badań dużej populacji chorych na raka piersi, z kompletnymi danymi istotnymi dla realizacji celu pracy. Reasumując: U kobiet z rakiem piersi, które przyjmują digoksynę, występują korzystniejsze czynniki rokownicze. Ryzyko nawrotu choroby w tej grupie nie jest istotnie wyższe, jakkolwiek, autorzy obserwowali częstsze nawroty choroby w pierwszym roku leczenia, u chorych z obecnym receptorem estrogenowym. Według: Biggar RJ, Andersen EW, Kroman N, et al. Breast cancer in women using digoxin: tumor characteristics and relapse risk. Breast Cancer Res. 2013; 15(1): R13. [Epub ahead of print] Maria Kowalska Zakład Markerów Nowotworowych Centrum Onkologii, Oddział w Warszawie Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest piątym co do częstości występowania nowotworem złośliwym na świecie. Najistotniejszym czynnikami ryzyka są wirusowe zapalenie i marskość wątroby. Wczesne rozpoznanie choroby jest kluczowe wyników dla skuteczności leczenia. Odnotowano, że leczenie uzupełniające raka wątrobowokomórkowego, takie jak interferon α, jest skuteczne tylko w pewnej podgrupie pacjentów. W przypadku interferonu α (IFNα) największą efektywność stwierdzono u pacjentów z HCC z niskim poziomem mir-26 (mały odcinek niekodującego RNA, którego nadekspresja powoduje negatywną regulację proliferacji komórek i cyklu komórkowego). Badanie, mające na celu ocenę multipleksowej ilościowej łańcuchowej reakcji polimerazy z odwrotną transkrypcją jako diagnostycznej metody oznaczania mir-26 (MIR-26 DX), przeprowadzono z wykorzystaniem wycinków guzów pochodzących od trzech kohort pacjentów z HCC (n = 248), których między 1993 a 2007 rokiem poddano radykalnej resekcji nowotworu. Część pacjentów uczestniczyła w prospektywnym badaniu z randomizacją, oceniającym adjuwantową terapię IFNα. Średnia wieku włączonych pacjentów z poszczególnych kohort mieściła się w przedziale 50-66 lat, mężczyźni stanowili 87,9% badanych. U chorych nie występowały odległe przerzuty i stwierdzono u nich utrzymaną rezerwę czynnościową wątroby. U 52% badanych zastosowano adjuwantową terapię IFNα. Stwierdzono, że przeprowadzony multipleksowy test był stabilny i powtarzalny, niezależnie od różnic w opracowaniu próbek oraz osób wykonujących. Stworzony w oparciu o kohortę treningową szablon macierzy i algorytm punktacji, został zastosowany w dwóch analizowanych grupach. Odsetek pacjentów z niskim poziomem mir-26 na podstawie opracowanego algorytmu wyniósł w grupie treningowej 68%, a w dwóch pozostałych 4% i 63%. Zgodnie z poprzednimi obserwacjami wykazano, że chorzy z HCC i niskim poziomem ekspresji mir-26 lepiej reagowali na leczenie IFNα, co widoczne było w zwiększeniu mediany przeżycia całkowitego ( 3 lata). Badanie wykazało, że MIR26-DX jest prostym i wiarygodnym testem diagnostycznym, który może służyć odpowiedniej doborowi pacjentów do wdrożenia leczenia uzupełniającego IFNα po chirurgicznym leczeniu radykalnym. Według: Ji J, Yu L, Yu Z, et al. Development of a mir-26 companion diagnostic test for adjuvant interferon-alpha therapy in hepatocellular carcinoma. Int J Biol Sci. 2013; 9(3): 303 312. Zastosowanie oznaczania mir-26 metodą RT-qPCR w kwalifikacji do adjuwantowego leczenia raka wątrobowokomórkowego interferonem α Łukasz Kaczyński Zakładu Diagnostyki Katedry Biochemii Klinicznej Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, Kraków Biomarkery w surowicy krwi chorych na raka brodawkowatego tarczycy W ostatnich latach obserwowany jest wzrost zachorowalności na raka brodawkowatego tarczycy. Podobny trend zachorowania na ten nowotwór złośliwy, występuje zarówno w Kanadzie, jak i w Europie, czy USA (6,8% rocznie u mężczyzn i 8,8% rocznie u kobiet). Do czynników mających wpływ na rozwój raka tarczycy zaliczamy: promieniowanie, czynniki genetyczne oraz przypadki wystąpienia tego raka w rodzinie. Guzki w tarczycy, często mają charakter łagodny. Stosowane obecnie metody diagnostyczne, nie zawsze pozwalają na określenie rodzaju obserwowanej zmiany. W takich przypadkach konieczne jest wykonanie zabiegu operacyjnego, w uzyskanym materiale z zabiegu chirurgicznego, aż u 75% chorych diagnozowane są zmiany o charakterze łagodnym. Prowadzone obecnie badania wskazują na wzmożoną ekspresję w guzie, genów kodujących między innymi takie białka jak: chitynazy 1-3 (CHI3L1) oznaczane również jako YLK-40, inhibitor metaloproteinazy-1 (TIMP-1), galektyna 3 (Gal-3), cytokeratyna 19 (CK19), czy angiopoetyna-1 (Ang-1). W przeciwieństwie do zaawansowanych badań w dziedzinie biologii molekularnej, w praktyce klinicznej nie ma uznanych markerów oznaczanych w surowicy krwi, których wyniki byłyby użyteczne w ocenie charakteru zmiany w tarczycy. Celem prezentowanej pracy, było zidentyfikowanie potencjalnych markerów w surowicy krwi chorych na raka brodawkowatego tarczycy. Autorzy postawili hipotezę, że efektem 269

wzmożonej ekspresji genów w guzie, mogą być podwyższone stężenia odpowiednich substancji w surowicy krwi. Badaniami objęto 99 chorych, powyżej 18 roku życia, poddanych operacji tarczycy, u których potwierdzono obecność raka brodawkowatego tarczycy lub zmianę o charakterze łagodnym. Utworzono dwie grupy: chorzy na raka tarczycy i chorzy ze zmianami łagodnym, którzy stanowili grupę kontrolną. Krew pobierano w dniu operacji, wirowano po utworzeniu skrzepu, przez 10 minut/3000 rpm. Jeżeli nie uzyskiwano całkowitego odseparowania surowicy od erytrocytów, powtarzano etap wirowania. Surowicę dzielono na 5 do 8 probówek, aby każda próbka była tylko raz rozmrażana. Surowica oraz pobrana tkanka w trakcie operacji były przechowywane w 80 C. Badane parametry w surowicy krwi oznaczono metodami ELI- SA, zgodnie z zaleceniami producenta [ Ang-1,TIMP-1, Gal- 3 zestawy firmy R&D, Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA. YKL-40 firmy Quidel Corp., San Diego, CA, USA. CK19 firmy CUSABIO]. Wszystkie próbki oznaczono podwójnie. W badanej grupie, u 42 chorych potwierdzono histopatologicznie raka brodawkowatego tarczycy a u 57 chorych zmianę łagodną. Stężenia oznaczonych markerów nowotworowych porównywano pomiędzy grupą chorych na raka i grupą kontrolną. W prezentowanej pracy, stężenia potencjalnych markerów nowotworowych nie różnicowały badanych grup chorych. Wiadomo, że złotym standardem w diagnostyce raka tarczycy są badania histopatologiczne materiału operacyjnego. Biopsja cienkoigłowa (FNA) w sposób istotny poprawiła diagnostykę przedoperacyjną guzków tarczycy. Jakkolwiek, FNA ma istotne ograniczenie w diagnostyce charakteru zmian występujących w tarczycy, czułość tej metody wynosi od 65 do 98%, a swoistość od 72 do100%. Autorzy pracy, do badań zakwalifikowali te substancje, których nadekspresja genów u chorych na raka brodawkowatego tarczycy została wykazana w licznych publikacjach. Reasumując: w pracy wykazano, że stężenia YKL-40, Gal- 3, CK19, TIMP-1 and Ang-1 nie różnicują chorych na raka brodawkowatego tarczycy od chorych ze zmianami łagodnymi tego gruczołu. Potwierdzono również, że często obserwuje się brak zależności pomiędzy nadekspresją genów a stężeniami odpowiednich substancji w surowicy krwi. Wzrastająca zachorowalność na raka tarczycy wymaga poszukiwania użytecznych diagnostycznie testów, które w sposób znaczący pomogłyby w ograniczeniu zbędnych operacji u chorych z łagodnymi zmianami w tarczycy. Według: Makki FM, Taylor SM, Shahnavaz A, et al. Serum biomarkers of papillary thyroid cancer. J Otolaryngol Head Neck Surg. 2013;7;42(1): 16. doi: 10.1186/1916-0216-42-16. Maria Kowalska Zakład Markerów Nowotworowych Centrum Onkologii, Oddział w Warszawie Oznaczanie wolno krążącego DNA w osoczu u dzieci z białaczkami Wolno krążące DNA (cfdna) reprezentują zewnątrzkomórkową frakcję kwasów nukleinowych obecną we krwi obwodowej. Niewielkie ilości cfdna są wykrywalne u osób zdrowych, jednakże w chorobach nowotworowych ilość wolno krążącego DNA jest znacząco wyższa. Mechanizm uwalniania cfd- NA do krwi nie został dokładnie poznany. Najprawdopodobniej ich głównym źródłem są komórki ulegające apoptozie oraz spontaniczne, aktywne uwalnianie DNA przez szybko proliferujące komórki nowotworowe. Pomimo tego, że cfdna zostało odkryte ponad 60 lat temu, dopiero teraz dostępne są dokładne i powtarzalne metody umożliwiające ich detekcję, takie jak Real-time PCR. Dotychczas wykazano obecność zwiększonej ilości cfdna w osoczu lub surowicy pacjentów chorych na raka piersi, szyjki macicy, jelita grubego, wątroby, płuca, prostaty oraz tarczycy. W przypadku zaburzeń limfoproliferacyjnych dostępny jest wyłącznie pojedynczy raport na temat detekcji całkowitego cfdna oraz EBV DNA w osoczu u dzieci z rozpoznanym nieziarniczym chłoniakiem B-komórkowym. Badania przeprowadzone przez Machadeo i wsp. wykazały, że ilościowe oznaczanie EBV DNA w osoczu może stać się cennym sposobem wykrywania chłoniaków związanych z zakażeniem wirusem Epsteina-Barra oraz monitorowania odpowiedzi na zastosowane leczenie. Mussolini i wsp. wykorzystując technikę real-time PCR przeprowadzili badanie na obecność wolno krążącego DNA wśród 201 dzieci z białaczkami. W grupie badanej znajdowało się 45 pacjentów z anaplastycznym chłoniakiem wielkokomórkowym (ALCL), 43 z chłoniakiem nieziarnicznym (HL), 88 z chłoniakiem Burkitta (BL), 8 z rozlanym chłoniakiem z dużych limfocytów B (DLBCL), 17 z chłoniakiem limfoblastycznym (LBL). W celu określenia prawidłowego poziomu cfdna w osoczu przebadano 15 zdrowych osób w wieku 5-16 lat, które stanowiły grupę kontrolną. Od każdego badanego pobierano 5 ml krwi obwodowej, po dwukrotnym wirowaniu izolowano DNA z 500 µl osocza zestawem QIAamp DNA mini (Qiagen). W oznaczeniach ekspresji genu POLR2 zastosowano technikę RT-PCR stosując sondy typu TaqMan. Ponadto, w grupie pacjentów z anaplastycznym chłoniakiem wielkokomówkowym, przeprowadzono pomiar amplifikacji genu fuzyjnego NPM-ALK w celu oznaczenia w osoczu frakcji DNA pochodzenia nowotworowego. W badanej grupie chorych stężenie cfdna było istotnie wyższe w porównaniu do grupy kontrolnej (mediany odpowiednio: 40,0 ng/ml vs. 1,6 ng/ml, p<0,0001). W osoczu pacjentów z ALCL frakcja DNA pochodzenia nowotworowego wahała się w zakresie od 1% do 100%. Co ciekawe, próbki z wysokim odsetkiem nowotworowego DNA należały do grupy z niskim stężeniem cfdna, oraz na odwrót, próbki z niskim odsetkiem DNA pochodzenia nowotworowego charakteryzowały się wysokim stężeniem całkowitego cfdna. Nie stwierdzono statystycznie istotnej korelacji między typem histologicznym białaczki a wartością progową 270

cfdna, aczkolwiek w grupie z wyższym stężeniem byli pacjenci, u których rozpoznano chłoniaka Burkitta. U pacjentów z chłoniakiem nieziarnicznym obserwowano zależność poziomu cfdna od wieku, (wiek 10 - cfdna w zakresie 0-58 ng/ml, wiek >10 - cfdna w zakresie 10-1650 ng/ml; p=0,01). Tylko w zaawansowanym stopniu ALCL (III/IV) zaobserwowano podwyższony poziom cfdna. Nie wykazano zależności pomiędzy cfdna a innymi cechami klinicznymi, takimi jak poziom LDH czy masa guza. Rola cfdna jako czynnika prognostycznego była analizowana osobno dla 3 podtypów białaczek. Średni czas przeżycia dla 176 pacjentów po zakończonej chemioterapii wynosił 3 lata (0,13-9,6 lat). Przeprowadzone badania wykazały, że w osoczu krwi obwodowej dzieci z białaczkami poziom wolno krążącego DNA mieści się w szerokim zakresie stężeń, od ilości porównywalnych z grupą kontrolną (10-30 ng/ml) do poziomu przekraczającego 500 ng/ml. Najwyższe stężenia zaobserwowano w osoczu pacjentów z chłoniakiem Burkitta. W przypadku ALCL aż 79% całkowitego cfdna było pochodzenia nienowotworowego (26-1650 ng/ml). Część próbek pacjentów z ALCL zawierała DNA pochodzenia nowotworowego, jednakże w stosunkowo niewielkich ilościach (6-60 ng/ml). W I-II stopniu zaawansowania ALCL średnia ilość cfdna wynosiła 14 ng/ml, natomiast w III-IV stopniu aż 157 ng/ml (p=0.01). Wstępne wyniki badań są obiecujące, jednak w celu określenia możliwej wartości diagnostycznej i rokowniczej oznaczeń cfdna w osoczu dzieci z białaczkami wskazane jest przeprowadzenie badań na większej grupie chorych. Według: Mussolin L, Burnelli R, Carraro E, et al. Plasma cellfree DNA in paediatric lymphomas. Journal of Cancer 2013; 4(4): 323-329. Magdalena Pierzyna Laboratorium Centralne, SP Szpital Kliniczny nr.1 Śląski Uniwersytet Medyczny, Zabrze Diagnostyczna dokładność konwencjonalnego lub dostosowanego do wieku punktu odcięcia stężenia D-dimerów w podejrzeniu żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej: przegląd piśmiennictwa i meta-analiza D-dimery są fragmentami fibryny, które powstają podczas degradacji tego białka przez plazminę. Ich stężenie jest wysoce czułe dla procesu formowania się skrzepu stąd oznaczane są m.in. w diagnostyce żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej (ŻChZZ) i rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego. U pacjentów z niskim prawdopodobieństwem klinicznym żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej badanie stężenia D-dimerów często służy do jej wykluczenia. Natomiast u pacjentów z wysokim prawdopodobieństwem klinicznym ŻChZZ, badanie to nie jest wymagane, podstawą potwierdzenia bądź wykluczenia choroby są badania obrazowe, niezależnie od wyników stężenia D-dimerów. Na łamach BMJ opublikowano wyniki metaanalizy, w której oceniano czy dostosowanie wartości odcięcia stężenia D-dimerów do wieku pacjenta zwiększa dokładność tego pomiaru u osób powyżej 50 roku życia z podejrzeniem żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej. Do analizy włączono badania uzyskane z 13 ośrodków (n=12 497), w których porównywano konwencjonalny punkt odcięcia stężenia D-dimerów (500 µg/l) i punkt odcięcia dostosowany do wieku (wiek x 10 µg/l). Swoistość pomiaru stężenia D-dimerów w diagnostyce ŻChZZ przy standardowym punkcie odcięcia (500 µg/l) malała wraz z wiekiem pacjenta i wynosiła 57,6% (95% CI [51,4%-63,6%]) u pacjentów w wieku 51-60 lat, 39,4% (95 CI [33,5%-45,6%]) u pacjentów w wieku 61-70 lat, 24,5% (95% CI [20,0%-29,7%]) u pacjentów w wieku 71-80 lat i 14,7% (95% CI [11,3%-18,6%]) u osób powyżej 80 roku życia. Kiedy punkt odcięcia dostosowano do wieku swoistość testu wzrosła odpowiednio do 62,3%, 49,5%, 44,2% i 35,2%, natomiast czułość diagnostyczna nieznacznie spadła, ale i tak we wszystkich grupach wiekowych przekraczała 97%. Fizjologicznie, stężenie D-dimerów wzrasta z wiekiem co prowadzi do wysokiego odsetka starszych pacjentów ze stężeniem D-dimerów wyższym niż konwencjonalny punkt odcięcia (500 µg/l), a w konsekwencji do niskiej swoistości badania u pacjentów z podejrzeniem ŻChZZ ( 49%-67% dla pacjentów poniżej 50 roku życia i 0%-18% dla pacjentów powyżej 80 roku życia). Zgodnie z procedurą medyczną u wszystkich pacjentów z podejrzeniem ŻChZZ ze stężeniem D-dimerów powyżej wartości punktu odcięcia wykonywane są badania obrazowe. Metaanaliza wykazała, że u wysokiego odsetka starszych pacjentów (powyżej 50 roku życia) z niskim prawdopodobieństwem klinicznym ŻChZZ wykonuje się niepotrzebnie te badania, które są dla nich uciążliwe i stanowią relatywnie niską korzyść (tylko u < 20% tych pacjentów z klinicznym podejrzeniem ŻChZZ stwierdza się tą chorobę). Kontrowersję budzi jednak użyteczność badania D-dimerów (zarówno z konwencjonalnym punktem odcięcia jak i z podwyższoną jego wartością) do bezpiecznego wykluczenia ŻChZZ. Nadal prowadzone są badania nad oceną diagnostycznej wartości testu do wykluczenia podejrzenia ŻChZZ u starszych pacjentów, ze szczególnym zainteresowaniem przewagi testu skorygowanego wiekiem nad konwencjonalnym. Wyniki badania wskazują na ograniczoną użyteczność pomiaru stężenia D-dimerów przy zastosowaniu konwencjonalnego punktu odcięcia u starszych pacjentów. Dostosowanie punktu odcięcia stężenia D-dimerów w diagnostyce ŻChZZ u pacjentów powyżej 50 roku życia zwiększa swoistość tego testu przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej czułości. Wprowadzenie do rutynowych badań laboratoryjnych punktu odcięcia dostosowanego do wieku miałoby natychmiastowy wpływ na praktykę kliniczną i posłużyłoby pacjentom 271

z niskim prawdopodobieństwem klinicznym ŻChZZ uniknąć wykonywania badań obrazowych w znacznym odsetku (30-54%). Wyniki badania nie dotyczą pacjentów z wysokim prawdopodobieństwem klinicznym ŻChZZ, dla których badania obrazowe są obligatoryjne, niezależnie od poziomu stężenia D-dimerów. Według: Schouten HJ, Geersing GJ, Koek HL, et al. Diagnostic accuracy of conventional or age adjusted D-dimer cutoff values in older patients with suspected venous thromboembolism: systematic review and meta-analysis. BMJ 2013; 346: 12492. Monika Rychlik Ginekologiczne Koło Naukowe UJ Collegium Medicum, Kraków Nowe leki przeciwzakrzepowe i ich wpływ na laboratoryjne oznaczanie parametrów układu krzepnięcia W ostatnich latach wprowadzone zostały nowe doustne leki przeciwzakrzepowe (DOACs, ang. direct oral anticoagulants) jako alternatywa do powszechnie stosowanych antagonistów witaminy K, jak np. warfaryna, czy kofaktorów antytrombiny jak np. heparyna, heparyna drobnocząsteczkowa (LMWH). Nowo wprowadzone leki przeciwzakrzepowe obejmują bezpośrednie inhibitory trombiny (DTI, ang. direct thrombin inhibitors) oraz bezpośrednie inhibitory czynnika Xa (DFXaI, ang. direct factor Xa inhibitors). Okazuje się, że te nowe leki nie tylko znacząco zmieniają praktykę kliniczną, ale również mają duży wpływ na wyniki oznaczeń parametrów układu krzepnięcia oraz sposób ich interpretacji. Obecnie 3 leki z grupy DOACs (dabigatran, rivaroxaban oraz apixaban) są dopuszczone przez FDA do stosowania w prewencji udarów oraz zatorów systemowych. Ponadto rivaroxaban dopuszczony jest do terapii fibrynolitycznej m. in. zatorów płucnych oraz prewencji zakrzepicy żył głębokich. Obecnie trwają próby kliniczne kilku innych DOACs. Jako klasa leków, DOACs charakteryzują się: podobną lub zwiększoną wydajnością i bezpieczeństwem w porównaniu do warfaryny czy LMWH szybkością osiągania aktywności przeciwzakrzepowej (1 3h) i krótkim czasem półtrwania (9 17h). ograniczonymi interakcjami z innymi lekami i pożywieniem stałym dawkowaniem, dostosowanym do zmniejszonego wskaźnika klirensu kreatyniny brakiem konieczności rutynowego monitorowania stężenia leku we krwi brakiem antagonistów oraz antidotum W przypadku nowo wprowadzanych leków niekorzystnym jest brak rutynowych testów, które pozwoliłyby oznaczyć stężenie DOACs we krwi na żądanie, jednak pomimo tego zostały dopuszczone po próbach klinicznych, jako niewymagające takich oznaczeń, ze względu na bardziej przewidywalną kinetykę zmian w porównaniu do np. warfaryny. Istnieją jednak sytuacje, kiedy oznaczenie poziomu leku jest pomocne, jak np. ocena ryzyka wystąpienia krwawienia przed rozległymi lub wysoce inwazyjnymi operacjami (np. neurochirurgicznymi) lub wystąpienia krwawienia na skutek pogorszenia funkcji nerek, zajścia niepożądanych interakcji z innymi lekami, czy przedawkowania leku. Równie istotny jest fakt, że stosowanie DOACs uniemożliwia wiarygodną ocenę parametrów układu krzepnięcia (jak APTT, PT) pacjentów, brak jest również wyznaczonych terapeutycznych zakresów INR dla DOACs. Wpływ stosowania DOACs jest różny dla różnych typów tych leków. Wzrost stężenia DOACs powoduje wydłużenie APTT i PT, jednak proporcjonalność w dużym stopniu zależy od rodzaju (producenta) odczynników używanych do wyznaczenia tych parametrów. Odczynniki do oznaczeń APTT są bardziej wrażliwe na obecność dabigatranu niż odczynniki do oznaczeń PT, odwrotny efekt natomiast obserwowany jest dla rivaroxabanu. Zależność PT od dawki dabigatranu i rivaroxabanu jest liniowa, podczas gdy dla APTT jest to zależność krzywoliniowa. Wrażliwość samej tromboplastyny na DOACs jest różna dla różnych producentów i nie jest przewidywalna dla tromboplastyn pochodzących z tego samego źródła. Wyznaczanie terapeutycznego zakresu INR w oparciu o kalibrację ISI specyficzną dla danej tromboplastyny jest dobrym sposobem monitorowania poziomu warfaryny, jednak sposób ten nie sprawdza się w przypadku stosowania DFXaI. Odczynniki do oznaczania czasu trombinowego (TT) są bardzo wrażliwe na stężenie DOACs, zwłaszcza dabigatranu. W stężeniu dabigatranu można jednak zorientować się zakładając, że jest ono odpowiednie wtedy, gdy TT mieści się w przedziale referencyjnym. W analogiczny sposób, stwierdzenie prawidłowego PT pozwala założyć, że poziom rivaroxabanu jest terapeutycznie odpowiedni. Taka interpretacja oczywiście wymaga oceny przez eksperta i nie może być traktowana jako wysokiej jakości standard. Oznaczenia stężenia DOACs można wykonywać metodą bezpośrednią stosując wysokowydajną chromatografię cieczową (HPLC, ang. high-performance liquid chromatography) i spektrometrię masową co nie zawsze jest łatwe ze względu na brak dostępności do wymaganej aparatury. Istnieją również techniki pośredniego oznaczania DOACs: metodą chromogeniczną lub wykrzepiania, z użyciem standardów wykonanych z seryjnych rozcieńczeń leków, jednak ich stosowanie ma pewne ograniczenia. Wyniki oznaczeń parametrów układu krzepnięcia podczas stosowania DOACs mogą być zafałszowane, dlatego ich interpretacja wymaga dodatkowych środków ostrożności. Niektóre interferencje zależą od rodzaju podawanych leków DOACs, stosowanej metody oraz odczynników wykorzystywanych do oznaczeń parametrów układu krzepnięcia. Obserwowano np. wydłużenie PT lub APTT po podaniu DTI, 272

jak i DFXaI, które to wykazują działanie podobne do inhibitorów, a zmieszanie w równych proporcjach osocza badanego i kontrolnego nie skutkuje pełną korektą czasów krzepnięcia. Obydwa wymienione typy DOACs mogą wpłynąć na błędy w oznaczaniu poziomu i aktywności określonych czynników krzepnięcia, np. białka C, białka S (wyniki zaniżone), oraz antykoagulantu toczniowego (wyniki zawyżone lub fałszywie dodatnie). Ponadto, aktywność antytrombiny oznaczona metodą chromogeniczną może być fałszywie zawyżona wskutek obecności dabigatranu jeżeli substratem jest trombina, lub wskutek obecności rivaroxabanu, jeżeli substratem jest czynnik Xa. DOACs mają również wpływ na poziom fibrynogenu oznaczanego metodą wykrzepiania. Obecność dabigatranu powoduje zaniżenie poziomu fibrynogenu w niskich stężeniach trombiny, lecz nie ma wpływu przy wysokich stężeniach trombiny. Wysokie stężenia rivaroxabanu powodują również ok. 10% zaniżenie poziomu fibrynogenu oznaczanego innymi metodami. Reasumując, nowowprowadzone leki przeciwzakrzepowe mają przynajmniej taką samą skuteczność jak stosowane obecnie leki będące antagonistami witaminy K (warfaryna) lub heparyna. Ich stosowanie nie wymaga stałego monitorowania ich stężenia, wymaga jednak zmiany podejścia klinicznego i zmiany podejścia do otrzymywanych wyników oznaczania parametrów układu krzepnięcia. Stosowanie DOACs niewątpliwie wymaga ściślejszej współpracy klinicystów i diagnostów w interpretacji wyników. Według: Eby C. Novel anticoagulants and laboratory testing. International Journal of Laboratory Hematology 2013, 35: 262 268. Łukasz Sędek Lipemia: przyczyny, konsekwencje i rozwiązania Lipemia próbek jest wywołana hipertriglicerydemią spowodowaną obecnością chylomikronów lub wzrostem stężenia dużych cząsteczek VLDL. Lipaza lipoproteinowa (LPL) zaangażowana w szlak przemian egzogennych lipoprotein pomaga usunąć z krążenia chylomikrony poprzez ich przemianę do remnantów chylomikronów. Do prawidłowej aktywności enzymatycznej LPL wymaga obecności apolipoproteiny C 2, apolipoproteiny A5 oraz białka wiążącego glikozylofosfatydyloinozytol (GPIHBP1). Niedobór tych substancji może doprowadzić do ciężkich postaci hipertriglicerydemii. Często wtórną przyczyną lipemii jest otyłość, cukrzyca, nadmierne spożycie alkoholu, zespół metaboliczny, przewlekłe choroby nerek, zespół nerczycowy, hipotyreoza, hipopituitaryzm czy żywienie pozajelitowe. Ciężkie przypadki hipertriglicerydemii mogą manifestować się bólami brzucha, ostrym brzuchem lub ostrym zapaleniem trzustki. Użytecznym testem skriningowym wykrywającym obecność chylomikronów jest test zimnej flotacji polegający na pozostawieniu surowicy w temperaturze 4º C przez noc. Chylomikrony flotują na powierzchnię próbki tworząc mleczną warstwę. Alternatywną metodą jest ultrawirowanie wymagające jednak specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. Inną przyczyną hipertriglicerydemii może być zespół Zievego, który dodatkowo charakteryzuje się niedokrwistością hemolityczną, żółtaczką i bólami brzucha. Próbki krwi pochodzące od chorych z zespołem Zievego stanowią wyzwanie dla laboratorium ze względu na obecność nie tylko lipemii, ale również hemolizy. Ciężka hipertriglicerydemia występuje także w rodzinnych hiperlipidemiach związanych z upośledzoną funkcją apoe. Arbitralnie przyjmuje się, że o lipemicznych próbkach mówimy wtedy, gdy stężenie triglicerydów przekracza 10 mmol/l. Należy pamiętać, że lipemia może wpływać na decyzje kliniczne, dlatego tak istotna jest świadomość przyczyn jej występowania. W niektórych przypadkach ostrego zapalenia trzustki prawidłowa aktywność amylazy nie wyklucza tego rozpoznania. Hipertriglicerydemia w tym przypadku może być przyczyną uzyskania fałszywie niskich wyników aktywności amylazy. Obecność wysokiego poziomu lipidów zwiększa zmętnienie próbki wpływając na testy fotometryczne opierające się na transmisji światła. Niewyjaśniona hiponatremia wymaga dalszych badań w celu wyjaśnienia przyczyny. W takich przypadkach wskazany jest pomiar osmolalności w celu zróżnicowania hiponatremii z pseudohiponatremią. Pseudohiponatremia charakteryzuje się niskim poziomem sodu i prawidłową osmolalnością, a jej przyczyną może być hiperlipidemia bądź hiperproteinemia. Zjawisko to wynika z zastosowania pośrednich elektrod jonoselektywnych, które dokonują pomiaru stężenia sodu w objętości rozpuszczalnika. Jeżeli stężenie triglicerydów w surowicy jest podwyższone to dochodzi do zmniejszenia objętości rozpuszczalnika, a objętość roztworu pozostaje bez zmian. W związku z tym stężenie molowe sodu mierzone metodą pośrednią będzie obniżone a osmolalność pozostanie bez zmian. Dlatego zaleca się pomiar stężenia sodu w próbkach z rażąco wysokim poziomem lipidów przy użyciu bezpośrednich elektrod jonoselektywnych. Obecność chylomikronów i VLDL w badanej surowicy może znacząco wpływać na szereg metod analitycznych. Dlatego w wielu systemach pomiarowych wprowadzono tzw. indeks lipemiczny czyli wartość odcięcia, powyżej której obserwuje się wpływ związków lipidowych na poziom oznaczanej substancji. Ma to szczególne znaczenie w metodach nefelometrycznych, turbidymetrycznych i fotometrycznych, w których stosuje się pomiar światła rozproszonego bądź absorpcję przy długościach fal 70-1000 nm. Wpływ lipemii na pomiar substancji przy użyciu metod immunologicznych nie jest dokładnie opisany, ale wiąże się prawdopodobnie z rozpuszczalnością tych związków w środowisku lipidowym i zdolnością do wiązania przeciwciał. Jednym z głównych wyzwań 273

dla laboratoriów jest ocena podatności testów biochemicznych na związki lipidowe, które ze swej natury są wysoce heterogenne, co nastręcza dodatkową trudność. Jednym ze sposobów zapobiegania interferencji związków lipidowych jest ultrawirowanie przy obrotach 90000 rpm, co znacząco redukuje stężenie triglicerydów w badanej próbce. Innym sposobem jest użycie surfaktantów - niejonowych polimerów, które są zalecane przez niektórych wytwórców odczynników laboratoryjnych. Zaleca się również stosowanie enzymów mających na celu zmniejszenie skutków lipemii w oznaczanym materiale. Jeszcze innym rozwiązaniem jest wprowadzenie metod analitycznych przystosowanych do próbek hiperlipemicznych. Podsumowując, lekarze i pracownicy laboratoriów muszą być świadomi wpływu lipemii na pomiar szeregu oznaczanych substancji. Szczególne znaczenie ma to w przypadku określonych sytuacji klinicznych, takich jak ostre zapalenie trzustki czy pseudohiponatremia, które wymagają wdrożenia potencjalnie niebezpiecznego postępowania terapeutycznego. Według: Walker PL, Crook MA. Lipaemia: Causes, consequences and solutions. Clin Chim Acta 2013 Mar 15; 418: 30-2. Ewa Leporowska Pracownia Diagnostyki Laboratoryjnej Wielkopolskie Centrum Onkologii, Poznań Szybkie testy w diagnostyce ludzkiej leptospirozy Leptospiroza jest chorobą odzwierzęcą wywołaną przez krętki z rodzaju Leptospira. Zapadalność waha się od 1:5 mln mieszkańców w klimacie umiarkowanym do średnio 1:2000 mieszkańców w klimacie tropikalnym. Do najgroźniejszych powikłań tej choroby zalicza się uszkodzenie wątroby i nerek, rzadziej zapalenie mięśnia sercowego, zapalenie płuc i zespół ostrej niewydolności oddechowej. Leptospirozę najczęściej rozpoznaje się w oparciu o wykrycie przeciwciał przeciwko Leptospira przy użyciu mikroskopowego testu aglutynacji (MAT) lub innych metod immunochemicznych (ELISA, IFAT). MAT jest uważany za złoty standard w serodiagnostyce leptospirozy, jednak dostępność zarówno tego badania jak i innych testów immunochemicznych jest ograniczona. Stosuje się również posiewy krwi, cechują się one jednak niską czułością, a procedura jest długotrwała. Wykrycie zakażenia we wczesnej fazie jest też możliwe techniką PCR. Wprowadza się do użytku także szybkie testy diagnostyczne (RDTs) w kierunku leptospirozy, które łatwo można zastosować w standardowych punktach opieki medycznej, szczególnie w miejscach dużej częstości występowania tej choroby. W badaniu przeprowadzonym w latach 2001-2012, przed rutynową diagnostyką leptospirozy (MAT, ELISA, posiewy), w surowicy krwi pacjentów z podejrzeniem tej choroby wykonano testy serologiczne: LeptoTek Dri Dot (test aglutynacji lateksowej), LeptoTek Lateral Flow i Leptocheck-WB (testy immunochromatograficzne). Ostateczne rozpoznanie leptospirozy opierało się na wynikach MAT, ELISA i posiewów. Dokładność diagnostyczną badanych testów oceniano na podstawie pierwszej badanej próbki lub próbek sparowanych, a także w analizie ogólnej lub stratyfikowanej według dni od momentu wystąpienia choroby. Wykazano, że czułość diagnostyczna LeptoTek Dri Dot wyniosła 75%, a LeptoTek Lateral Flow i Leptocheck-WB 78%, przy swoistości odpowiednio 96%, 95% i 98%. Biorąc pod uwagę wyniki tylko w pierwszej próbce, czułość testów była mniejsza i wynosiła 51% dla LeptoTek Dri Dot, 69% dla LeptoTek Lateral Flow i 55% dla Leptocheck-WB. Sparowanie badanych próbek pozwoliło na zwiększenie czułości, odpowiednio do 82%, 86% i 80%, przy zmniejszeniu swoistości odpowiednio do 91%, 84% i 93%. W opisywanym prospektywnym badaniu stwierdzono, że wszystkie badane szybkie testy są pomocne w rozpoznawaniu leptospirozy wzmacniając podejrzenie kliniczne. Jednak z uwagi na ich czułość diagnostyczną poniżej 80%, nie należy opierać rozpoznania jedynie na ich wynikach i konieczne jest potwierdzenie przy użyciu testów uznawanych za referencyjne. Według: Goris MGA, Leeflang MMG, Loden M, et al. Prospective evaluation of three rapid diagnostic tests for diagnosis of human leptospirosis. PLoS Negl Trop Dis 2013; 7(7): e2290. Łukasz Kaczyński Zakładu Diagnostyki Katedry Biochemii Klinicznej Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum w Krakowie 274