Techniki zakładania i prowadzenia hodowli Andrzej Wójcik awojcik@gmx.net
Zakładanie hodowli Hodowla narządu Hodowla wycinka tkanki Hodowla komórek dysocjowanych Hodowla narządopodobna Zachowanie struktury histologicznej Komórki wyrastają z pierwotnego eksplantatu tworząc rozrosty Komórki osiadają na powierzchni płytki tworząc kolonie Komórki hodowane na zrębie imitującym macierz zewnątrzkomórkową Według: R.I. Freshney, Culture of animal cells: a manual of basic techniques, 5th edition
Zakładanie hodowli i rozrost komórek (według Hayflick i Moorhead 1961)
Źródła: Zakładanie hodowli Komórki limfatyczne Krew obwodowa (limfocyty) Krew pępowinowa (komórki macierzyste) Szpik kostny Nowotwory układu limfatycznego Komórki rosnące jako monowarstwa (fibroblasty) Komórki rosnące w zawiesinie (HL-60) Wysięk u myszy
Zakładanie hodowli Narząd / wycinek tkanki Siekanie na drobne kawałki Pierwotny eksplantant Dysagregacja mechaniczna np. sitko, strzykawka ostre pipetowanie Zimna trypsyna (izolacja oszędzająca) Dysagregacja enzymatyczna Ciepła trypsyna (izolacja ostra) inaktywacja w surowicy Kolagenaza (izolacja oszczędzająca) Hodowla pierwotna Odzysk komórek przez wirowanie Hodowla wtórna Rozrost pasażowanie Wtórny eksplantant Linia komórkowa
Zakładanie hodowli Rozrost komórek z eksplantatu czerniaka ludzkiego 3 dni po eksplantacji 7 dni po eksplantacji Miejsce po eksplantacie Źródło: R.I. Freshney, Culture of animal cells: a manual of basic techniques, 5th edition
Zakładanie hodowli Dysagregacja enzymatyczna Kadheryny Integryny Zależne od obecności wapnia Dysagregacja przy pomocy EDTA (chelator metali, np. wapnia) Glikoproteiny błon komórkowych Fibronektyna, laminy Trypsyna Dyspaza Kolagenaza EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid = kwas wersenowy Inaktywowana przez surowicę płodową Trypsyna: proteaza ludzka wytwarzana przez trzustkę Dyspaza: niespecyficzna proteaza bakteryjna Kolagenaza: specyficzna proteaza bakteryjna rozkładająca kolagen
Hodowanie komórek pasażowanie Wylać pożwykę Dodać trypsynę rozpuszczoną w ciepłym PBS Potrząsać aż komórki się odkleją Dodać surowicę PBS: Phosphate buffered saline = buforowany fozjologiczny roztwór soli Przenieść do próbówki Wirować kilka razy, myjąc pożywką Policzyć w hemacytometrze Wysiać w odpowiedniej gęstości
pasażowanie Źródło: R.I. Freshney, Culture of animal cells: a manual of basic techniques, 5th edition
Pompa Elektrody Ω Pasażowanie Jak liczyć komórki? Pomiar oporności Otwór dyszy Podstawa szkła nakrywkowego Hemocytometr Szkło nakrywkowe Komora głębokość 0,1 mm Komórki martwe nie dają sygnału Błękit trypanu barwi komórki martwe! 1 mm Dysza Licznik Coultera Pojemnik z zawiesiną komórek C = N V C = gęstość N = liczba V = objętość 1 mm V = 0,1 mm 3
Pasażowanie Jak liczyć komórki? C1 = 125000 / ml h = 24 C1 = 125000 / ml T D = 13,65 h
Skład pożywki Sole nieorganiczne Węglowodany Aminokwasy Witaminy oraz lipidy Kwasytłuszczowe Peptydy i proteiny Surowica Hodowla komórek pożywka i stężenie ph Odpowiednie ciśnienie osmotyczne i ph Optymalne ph = 7,4 inkubator 5% CO 2 Bufor chemiczny: HEPES 2- - CO HCO 3 3 Czerwień fenolowa wskaźnik ph ph = 7,4 6,8 7,4 8,0 CO 2 ph
Hodowla komórek pożywki i buforowane roztwory solne Skład pożywki Sole nieorganiczne Węglowodany Aminokwasy Witaminy oraz lipidy Kwasytłuszczowe Peptydy i proteiny Surowica Skład soli buforowanej Sole nieorganiczne Glukoza (Surowica) Najczęściej używane pożywki: MEM Minimal Essential Medium DMEM Dulbecco s Minimal Essential Medium F12 RPMI 1640 McCoy s Fisher s Ham's F-10 Najczęściej używane roztwory sole BSS = balanced salt solution: Earl s BSS Dulbecco s BSS Różne wersje, np. dodatek L-glutaminy bufor HEPES Wybór na podstawie doświadczenia Dostępne jako: Roztwory gotowe Roztwory stężone Proszek Używane do mycia komórek lub eksperymentów nie wymagających hodowli. Trzymać w +4 0 C
Wyjaławianie pożywki przez filtrację (niezbędne po rozpuszczeniu sproszkowanej pożywki w wodzie) Sączki. średnica porów: 0,22 µm
Hodowla komórek - surowica Surowica bydlęca calf serum/ bovine serum - BS Surowica płodowa fetal bovine serum FBS Surowica końska Horse serum HoS Trzymać w -20 0 C jak najrzadziej rozmrażać Zawiera niezbędne do hodowli: Białka (albumina) Czynniki wzrostu (zwłaszcza FBS!) Hormony Inaktywacja Heat inactivation Polega na trzymaniu surowicy przez 30 min w temperaturze 56 0 C (łaźnia wodna) Cel: inaktywacja układu dopełniacza osłabienie virusów i mykoplasmy Bo zawsze się tak robiło
Hodowla komórek limfoidalnych hodowla w miękkiej agarozie Metoda używana do klonowani komórek limfoidalnych. Metoda alternatywna: hodowla w mikropłytkach wyciąganie klonów z pojedynczych komórek Kolonie komórek TK6 hodowanych w miękkiej agarozie
Hodowla komórek pożywki bez surowicy Wady związane z używaniem surowicy: Zmienność między płodami Stosunkowo krótki okres ważności: ~ roku Koszt Wady związane z używaniem pożywki bez surowicy: Nie działa tak dobrze jak pożywka z surowicą
Hodowla komórek transformacja i immortalizacja komórek Co to znaczy transformacja komórkowa? Komórki transformowane mogą posiadać wybrane lub wszystkie cechy: Cecha komórek macierzystych Immortalizacja (nieograniczona zdolność do podziałów komórkowych) Upośledzony rozrost: utrata zahamowania kontaktowego w hodowli lub tkance Złośliwość (malignancy): zdolność wytwarzania przerzutów Niestabilność genetyczna: Wzmożone występowanie aberracji chromosomowych co prowadzi do akumulacji mutacji i zmiany ploidalności (ilości DNA) Cecha komórek zarodka w fazie preimplantacyjnej
Hodowla komórek transformacja i immortalizacja komórek Indukcja transformacji przez traktowanie: Mutagenem Onkowirusem Uzyskanie komórek transformowanych jest długim procesem Komórka transformowana
Hodowla komórek transformacja i immortalizacja komórek Transformacja wywołana mutagenem MSJ Crane. Mutagenesis and cell transformation in culture Metods in Cell Science 29: 245-253, 1999 Zależność między przeżywalnością komórek a częstością mutacji po traktowaniu mutagenem Względna częstość mutacji po traktowaniu komórek różnymi mutagenami
Transformacja przez wirusy Wirusy używane do transformacji komórek (Wszystkie: wirusy dsdna - zawierające podwójnoniciowe DNA) SV40: Simian virus 40, gen LT Adenowirus gen E1a HPV: Human papilloma virus, wirus brodawczaka ludzkiego, geny E6 i E7 EBV: Epstein Barr virus, Wirus Epsteina-Barr cały wirus Geny odpowiedzialne za transformację prawdopodobnie znoszą blokadę cyklu komórkowego przez inhibicję genów: CIP-1 WAF-1 p21 Rb p53 p16 Wydajność transformacji wyższa od mutagenów
Mechanizm transformacji przez wirusy dsdna http://info.cancerresearchuk.org/cancerstats/causes/infectiousagents/virusesandcancer/
Hodowla komórek nowotworowych Zakładanie hodowli: podobnie jak hodowle komórek prawidłowych Problem 1: komórki nowotworowe często nie dzielą się w warunkach hodowli in vitro. Możliwe przyczyny: brak czynników stymulujących (czynniki wzrostu, zrąb ) Problem 2: Guz nowotwory jest zlepkiem komórek nowotworowych i prawidłowych komórek tkanki łącznej jak fibroblasty, komórek śródbłonkowych itp.
Hodowle 3D
Podłoże dla hodowli 3D Symulacja in vitro: ECM macierzy międzykomórkowej - główne składniki: kolagen (żelatyna) laminy Żel Filtr