PL 214501 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 214501 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 391458 (51) Int.Cl. C12Q 1/68 (2006.01) C12N 15/29 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 10.06.2010 (54) Sposób wykrywania obecności genu karłowatości w materiale genetycznym pszenżyta oraz para starterów do wykrywania obecności genu karłowatości (43) Zgłoszenie ogłoszono: 19.12.2011 BUP 26/11 (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.08.2013 WUP 08/13 (72) Twórca(y) wynalazku: JUSTYNA LEŚNIOWSKA-NOWAK, Lublin, PL DANIELA GRUSZECKA, Lublin, PL KRZYSZTOF KOWALCZYK, Motycz, PL MICHAŁ NOWAK, Lublin, PL
2 PL 214 501 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest molekularny marker genetyczny pozwalający na identyfikację obecności genu karłowatości w genomie roślin pszenżyta oraz sposób jego detekcji w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Opracowanie specyficznych markerów, które pozwolą w szybki sposób przeprowadzić identyfikację pożądanych genotypów jest bardzo ważne z punktu widzenia hodowlanego. Dotychczas w hodowli pszenżyta, wykorzystywano geny karłowatości pochodzące od pszenicy (Rht-B1b, Rht-D1b, Rht-D1c oraz Rht-B1c) oraz od żyta (Dw1). Spośród w/w genów markery DNA w systemie analogicznym do zastosowanego w wynalazku znane są dla genów Rht-B1b i Rht-D1b (Ellis M.H., Spielmeyer W., Gale K.R., Rebetzke G.J., Richards R.A. 2002. Perfect markers for the Rht-B1b and Rht-D1b dwarfing genes in wheat. Heredity 35: 417-421). Poza znanymi i scharakteryzowanymi dotąd genami karłowatości pszenżyta w roślinach mogą pojawiać się także inne geny powodujące skrócenie źdźbła. Najczęściej są one wynikiem spontanicznych mutacji w genomie. Najnowszy gen tego rodzaju został zidentyfikowany w 2008 roku w Rosji. Powodował on redukcję wysokości roślin pszenżyta o około 15-25 cm (Kurkiev K.U. 2008. Inheritance of plant height in hexaploid triticales with R/D substitution. Russ. J. Genet. 44(9): 1080-1086). Obecność genu będącego wynikiem spontanicznej mutacji zidentyfikowali w badanym materiale również współtwórcy wynalazku. Największym problemem związanym z możliwością zastosowania tego rodzaju nowych źródeł karłowatości w praktycznej hodowli roślin jest brak szybkich i pewnych metod ich identyfikacji. Z tego względu opracowany został niniejszy wynalazek. Sposób wykrywania obecności nowego genu karłowatości w materiale genetycznym pszenżyta polega według wynalazku na tym, że polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary specyficznych starterów oligonukleotydowych, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji. Przedmiot wynalazku stanowi także para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach: Tdw3F1: 5 -CAAAGCTACCATGACGCAAA-3 Tdw3R1: 5 -CCAGCAGCTTGGGTATTAGC-3 W łańcuchowej reakcji polimerazy w określonych warunkach, według wynalazku zastosowane startery amplifikują fragment DNA o długości 1207 par zasad i sekwencji. Podstawową zaletą opracowanego systemu identyfikacji jest możliwość analizy roślin w bardzo wczesnym stadium rozwoju, a wynik uzyskiwany jest w krótkim czasie i jest niezależny od warunków środowiska wzrostu i rozwoju rośliny. W procesie identyfikacji materiał badań stanowi genomowy kwas deoksyrybonukleinowy (DNA), wyizolowany z roślin pszenżyta. Uzyskaną próbkę DNA wykorzystuje się w ilości 60 ng jako matrycę w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Poza matrycowym DNA, w skład mieszaniny reakcyjnej wchodzą następujące składniki w podanych stężeniach: bufor do PCR (1x), mieszanina deoksynukleozydotrifosforanów - dntp (0,1 mm), kofaktor polimerazy w postaci jonów Mg 2+ (1,5 mm), para podanych specyficznych starterów oligonukleotydowych (5 pmol każdy) oraz enzym - polimeraza Taq (1U). Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 20 μl. Przygotowane próbki umieszcza się w bloku termocyklera i przeprowadza PCR stosując podany profil termiczny: wstępna denaturacja w temperaturze 94 C przez 5 minut, a następnie 40 cykli: denaturacja w 94 C przez 30 sekund, przyłączanie starterów w 54 C przez 30 sekund, wydłużanie produktów w temperaturze 72 C przez 45 sekund, ostatni etap reakcji stanowi końcowa elongacja w 72 C przez 7 minut. Próbki bezpośrednio po łańcuchowej reakcji polimerazy kieruje się do detekcji obecności oczekiwanego produktu o długości 1207 par zasad za pomocą dowolnej metody rozdziału i identyfikacji fragmentów kwasów nukleinowych. Obecność produktu o długości 1207 par zasad, stanowiącego marker, w badanym materiale świadczy o występowaniu genu karłowatości. Sposób identyfikacji nowego genu karłowatości w genomie pszenżyta według wynalazku ilustruje przykład, przy czym na załączonym rysunku: fig. 1 przedstawia sekwencję markerowego, polimorficznego fragmentu DNA amplifikowanego w PCR z zastosowaniem pary starterów Tdw3F1 i Tdw3R1, zaś
PL 214 501 B1 3 fig. 2 przedstawia obraz fragmentów DNA amplifikowanych po włączeniu do reakcji pary starterów Tdw3F1 i Tdw3R1, gdzie M - marker wielkości GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, 1-41 próby pochodzące z pojedynczych rośliny pszenżyta. P r z y k ł a d A. Izolacja DNA z roślin pszenżyta Nieporażone liście roślin pszenżyta zamrożono w ciekłym azocie i roztarto w moździerzu. Po homogenizacji zawartość moździerza przeniesiono do probówki Eppendorfa, zawierającej 700 μl wcześniej przygotowanego buforu ekstrakcyjnego (2% CTAB, 2% PVP, 1,4M NaCl 2 ), ogrzanego do temperatury 65 C. Zawartość probówek dokładnie zmieszano i inkubowano przez 2 godziny na termobloku w temperaturze 65 C. W kolejnym etapie przygotowano mieszaninę chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1). Do każdej probówki dodano po 700 μl tak przygotowanej mieszaniny i delikatnie mieszano 5 minut przez inwersję. Próbki wirowano następnie przez 10 minut przy 14 000 rpm. Po zwirowaniu górną frakcję przeniesiono do nowych probówek Eppendorfa i dodano do każdej z nich po 400 μl izopropanolu. Przygotowane w ten sposób próbki pozostawiono na 5 minut w temperaturze pokojowej w celu precypitacji DNA. Po tym czasie probówki wirowano przez 10 minut przy 14 000 rpm. Po wirowaniu supernatant usunięto, a osadzone na dnie probówki DNA przemyto dwukrotnie 500 μl buforu płuczącego (76% etanol, 10 mm octan amonu). Po zakończonym płukaniu osad osuszono, a następnie rozpuszczono w 300 μl buforu TE (10 mm Tris HCl ph 8,0; 1 mm EDTA ph 8,0). Do każdej próbki dodano po 3 μl rybonukleazy A (10 mg/ml) i inkubowano przez 30 minut na termobloku w temperaturze 37 C. Po zakończeniu inkubacji dodano po 200 μl 5M NaCl. W kolejnym etapie dokonano reprecypitacji DNA za pomocą 1 ml 100% etanolu. Próbki następnie inkubowano przez 20 minut w temperaturze -20 C, po czym wirowano przez 10 minut przy 14 000 rpm. Uzyskany pelet DNA przemyto 500 μl 70% etanolu, wysuszono i rozpuszczono w 50 μl buforu TE. Probówki przeniesiono następnie na 24 godziny do temperatury 4 C. Stężenie DNA oceniono za pomocą spektrofotometru SmartSpec (Bio-Rad). Następnie, stężenie wszystkich prób doprowadzono do 200 ng/μl. B. Przygotowanie próbek do PCR Wyizolowane DNA doprowadzono do roboczego stężenia 20 ng/μl i tak przygotowane stosowano jako matrycę w łańcuchowej reakcji polimerazy. Do każdej probówki o pojemności 0,2 ml nanoszono po 60 ng matrycy. Pozostałe składniki reakcji połączono na lodzie w mix zawierający: 1x bufor do PCR (10 mm Tris ph 8,8; 50 mm KCl; 0,08% Nonidet P40), mieszaninę deoksynukleozydotrifosforanów o stężeniu 0,1 mm, kofaktor polimerazy w postaci dwudodatnich jonów magnezu o stężeniu 1,5 mm, parę specyficznych starterów oligonukleotydowych w ilości 5 pmol każdy oraz enzym polimerazę w stężeniu 1 U. Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 20 μl. Reakcję przeprowadzono w termocyklerze stosując następujący profil termiczny: wstępna denaturacja w temperaturze 94 C przez 5 minut, a następnie 40 cykli: denaturacja: 94 C przez 30 sekund, przyłączanie starterów: 54 C przez 30 sekund, wydłużanie produktów w temperaturze 72 C przez 45 sekund, ostatni etap reakcji stanowi końcowa elongacja w 72 C przez 7 minut. C. Elektroforeza agarozowa przeprowadzona w celu wizualizacji wyników PCR Po reakcji mieszaninę reakcyjną naniesiono na 1,5% żel agarozowy, zawierający 0,01% bromku etydyny. Rozdział prowadzono w buforze 1x TBE przez 1,5 godziny przy napięciu 120 V. Wizualizacji wyników dokonano podświetlając żel światłem UV, a do ich archiwizacji zastosowano cyfrowy aparat fotograficzny. Uzyskany dla badanego materiału wynik identyfikacji z zastosowaniem markera i metody stanowiącej przedmiot wynalazku przedstawiono na Fig. 2, który to rysunek przedstawia obraz fragmentów DNA amplifikowanych po włączeniu do reakcji pary starterów Tdw3F1 i Tdw3R1, gdzie M - marker wielkości GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, 1-41 próby pochodzące z pojedynczych roślin pszenżyta. Zastrzeżenia patentowe 1. Para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach: 5 -CAAAGCTACCATG ACGCAAA-3 5 -CCAGCAGCTTGGGTATTAGC-3 2. Sposób wykrywania obecności genu karłowatości w materiale genetycznym pszenżyta, w którym to sposobie polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest
4 PL 214 501 B1 w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, znamienny tym, że parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach: 5 -CAAAGCTACCATGACGCAAA-3 5 -CCAGCAGCTTGGGTATTAGC-3 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w wyniku PCR amplifikowany jest fragment DNA o długości 1207 par zasad o sekwencji:
PL 214 501 B1 5 Rysunki
6 PL 214 501 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)