Modyfikacja genu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PCR (wydłużania nakładających się odcinków)

Transkrypt

1 Instrukcja do ćwiczeń nr 1 i 2 Modyfikacja genu wołowej beta-laktoglobuliny przy użyciu metody Overlap Extension PR (wydłużania nakładających się odcinków) EL Wprowadzenie mutacji punktowych do genu blgb: zamiana kodonu dla 1 na la, zamiana kodonu dla Ile 2 na i zamiana kodonu dla Val 92 na Phe. Dodatkowo, wprowadzenie miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych NdeI oraz KpnI, odpowiednio, na początku i na końcu genu. ZDNIENI DO PRZYOTOWNI 1) Na czym polega metoda Overlap Extension PR? 2) zynniki wpływające na wydajność PR. MTERIŁY WEKTOR pmt/blgb wektor zawierający niezmodyfikowany gen blgb (matryca do reakcji PR) STRTERY blgb V92F FOR blgb V92F REV blgb NdeI S FOR blgb KpnI REV ODZYNNIKI termostabilna polimeraza DN Pfu (ThermoScientific, bufor Pfu + MgSO 4 (ThermoScientific) dntp (ThermoScientific), mieszanina deoksynukleotydów woda destylowana (Polfa) standard do elektroforezy enerulerlowrange DN Ladder, bp (ThermoScientific) bufor obciążający do próbek (ThermoScientific) bufor TE do elektroforezy DN agaroza Basica LE (na) do przygotowania żeli SPRZĘT LBORTORYJNY pipety automatyczne termocykler termoblok aparat do elektroforezy horyzontalnej z zasilaczem transiluminator mikrowirówka ZESTWY ene Elute el Extraction Kit (Sigma) zestaw do izolacji DN z żelu agarozowego 1

2 WYKONNIE ĆWIZENI I. W małych probówkach (poj. 0,2 ml) przygotować roztwory do dwóch reakcji PR. waga: Wszystkie odczynniki należy trzymać w temperaturze około 0! PR 1 woda destylowana 36,0 µl bufor Pfu + MgSO 4 (10 x stęż.) 5,0 µl DN matrycowy (pmt/blgb, 50 ng/µl) 1,0 µl blgb V92F FOR (50 µm ) 1,0 µl blgb KpnI REV (50 µm) 1,0 µl dntp (10 mm) 1,0 µl polimeraza Pfu (2,5 u/µl) 5,0 µl PR 2 woda destylowana 36,0 µl bufor Pfu + MgSO 4 (10 x stęż.) 5,0 µl DN matrycowy (pmt/blgb, 50 ng/µl) 1,0 µl blgb V92F REV (50 µm) 1,0 µl blgb NdeI S FOR (50 µm) 1,0 µl dntp (10 mm) 1,0 µl polimeraza Pfu (2,5 u/µl) 5,0 µl II. Zaprogramować termocykler według poniższego schematu: NR TEMPERTR ZS Liczba cykli min s s s III. IV. Przygotować 100 ml 2-procentowego roztworu agarozy w buforze TE. Złożyć pojemnik do wylania żelu. Rozpuścić agarozę w kuchence mikrofalowej, wylać żel do pojemnika (ok. 70 ml). Do lekko przestudzonego żelu dodać 5 ul roztworu barwnika Midori reen. Zamocować plastikowy grzebień. Pozostawić żel do zastygnięcia. Włączyć termoblok. stawić temperaturę grzania na 50. V. Po zakończeniu reakcji PR dodać do próbek 8 µl buforu obciążającego. mieścić żel w aparacie do elektroforezy. W razie konieczności uzupełnić ilość buforu TE do wskazanego poziomu. Przenieść próbki do studzienek w żelu. Do osobnej studzienki nanieść 5 µl standardu. Przeprowadzić elektroforezę. VI. VII. Przygotować 2 probówki o pojemności 1,5 ml, zważyć je i podpisać: PR1 oraz PR2. Po zakończeniu elektroforezy sfotografować żel. Zdjęcie zapisać w folderze ĆWIZENI IB1 2014_15. Następnie położyć żel na transiluminatorze i przy pomocy czystego skalpela wyciąć z żelu prążki zawierające produkty PR o odpowiedniej wielkości. Paski agarozy przenieść do zważonych probówek. 2

3 VIII. IX. Wyizolować DN z agarozy stosując zestaw el-out. cedurę oczyszczania DN przeprowadzić zgodnie z instrukcją podaną przez producenta zestawu. Do wymywania DN z kolumny użyć wody destylowanej. bówki z oczyszczonym DN dokładnie podpisać z boku na matowym polu wg zamieszczonego wzoru: PR1 lub PR2, nr grupy. Zmierzyć stężenie wyizolowanego DN przy pomocy przystawki NanoQuant do czytnika płytek TEN Infinite 200 (w przypadku niewystarczającej ilości ta czynność może zostać wykonana przez prowadzącego ćwiczenia). Stężenie DN zapisać na probówce z próbką. X. Przygotować roztwór dla trzeciej reakcji PR. PR 3 woda destylowana x µl produkt PR1 (V92F KpnI) (100 ng) x µl produkt PR2 (NdeI V92F) (100 ng) x µl blgb NdeI S FOR (50 µm) 1,0 µl blgb KpnI REV (50 µm) 1,0 µl bufor Pfu + MgSO 4 (10 x stęż.) 5,0 µl dntp (10 mm) 1,0 µl polimeraza Pfu (2,5 u/µl) 5,0 µl XI. XII. XIII. Ponownie uruchomić termocykler, przeprowadzić PR korzystając z uprzednio wprowadzonego programu: Po zakończeniu reakcji PR dodać do probówki 8 µl buforu obciążającego. Przeprowadzić elektroforezę produktów PR 3 wykorzystując do tego żel przygotowany przez prowadzącego ćwiczenia. Wyizolować zmodyfikowany gen blgb z agarozy stosując zestaw ene Elute el Extraction. bówki z oczyszczonym DN dokładnie podpisać z boku na matowym polu wg zamieszczonego wzoru: PR3 1S2 V92F, nr grupy. 3

4 MTERIŁY POMONIZE MP WEKTOR EKSPRESYJNEO petduet-1 4

5 SEKWENJ NKLEOTYDOW EN blgb TTTT TT TT TTTT TT T TTT T TTT TT T T TTTTT TTT T TTT TTT T TTT T TTT TT TTTT TT TT TT TTTT TT T TTTTT TT TTT TTT TTT TTT T TTT T TT TTTTT TTTT T TTTT SEKWENJE ROZPOZNWNE PRZEZ ENZYMY RESTRYKYJNE NdeI KpnI 5'- ^ T T -3' 5'- T ^ -3' TBEL Z KODEM ENETYZNYM Pierwszy Phe Phe Drugi Ile Ile Ile Met/Start Val Val Val Val** la la la la Tyr Tyr Stop Stop His His ln ln sn sn Lys Lys sp sp lu lu ys ys Stop Trp rg rg rg rg rg rg ly ly ly ly Trzeci WYTYZNE DO SPRWOZDNI NR 1 Sprawozdanie (pisane w grupach dwuosobowych) powinno zawierać: a) krótki wstęp teoretyczny (maksimum pół strony) dotyczący białka BL-B i metody OE PR oraz cel przeprowadzonych doświadczeń, b) skrótowy opis doświadczeń przeprowadzonych na ćwiczeniach nr 1 i 2, c) wyniki poszczególnych doświadczeń oraz komentarz do wyników (rezultat PR zdjęcia żeli, ilość DN uzyskanego po oczyszczaniu), d) sekwencje i charakterystykę samodzielnie zaprojektowanych starterów wprowadzających 3 mutacje do genu blgb oraz umożliwiających wklonowanie zmodyfikowanych genów do wektora pet DET-1/dsb, e) odpowiedzi na pytania zamieszczone poniżej, 5

6 f) bibliografię (oraz nazwy programów do projektowania starterów, jeśli takie były wykorzystywane). PYTNI DO SPRWOZDNI NR 1 Dwa bufory najczęściej wykorzystywane w elektroforezie DN to TE oraz TBE: a) proszę wymienić ich skład, b) określić rolę poszczególnych związków wchodzących w skład buforów, c) wymienić zalety i wady obu buforów, d) podać informację, na jakiej wysokości należy się spodziewać prążków pochodzących od barwników wykorzystywanych w buforach obciążających t.j. błękitu bromofenolowego i cyjanolu ksylanowego w 2-procentowym żelu agarozowym, odpowiednio w buforach TBE i TE. 6