Układy zdyspergowane Wykład 5
Treśd Układy zdyspergowane a światło
Rozpraszanie światła Znakomite narzędzie badania cząstek w roztworach (ale także w żelach i kryształach). W szczególności pozwala na pomiar wielkości i kształtu cząstek (cząsteczek w przypadku polimerów, w tym białek). Ograniczenie: tylko układy przejrzyste lub prawie przejrzyste dla światła. Zasadnicze zastosowania to pomiar: masy cząsteczkowej i wielkości cząsteczek polimerów w roztworach współczynnika dyfuzji cząsteczek polimerów lub innych cząstek i ich średnicy hydrodynamicznej ściśliwości osmotycznej roztworów K os = c π c szybkości dźwięku i współczynnika tłumienia w ciałach stałych (rozpraszanie Brillouin a), częstości własnych wibracji molekularnych (rozpraszanie Ramana).
Światło fala elektromagnetyczna o długości z zakresu widzialnego (400-700nm); strumieo fotonów. Zgodnie z mechaniką kwantową, moment pędu fotonu jest równy ħk, w którym ħ jest stałą Plancka podzieloną przez 2π, a k oznacza wektor falowy, określający kierunek rozchodzenia się światła; k = 2πn λ; n oznacza współczynnik załamania światła ośrodka, a λ jest długością fali.
Natura falowa światła E t = E 0 sin (2πνt ky) H t = H 0 sin (2πνt ky) E 0, H 0 - amplitudy ν - częstotliwośd k = 2π λ = ω/c - wektor falowy w kierunku rozchodzenia się fali ω = 2πυ = 2πc/λ - częstośd kątowa
Natura falowa światła w liczbach: prędkośd światła c = 2,9979 10 8 m/s długośd fali λ=(390-780)nm (nm = 10-9 m = 10Å) częstotliwośd ν = (7,7-3,8) 10 14 Hz (fioletowe-czerwone) liczba falowa (częstośd ν = 1/λ) 25 000-13 000 cm -1 rozmiar cząsteczek rozpraszających: 10-100Å (1-10 nm)
Rozpraszanie światła http://www.wyatt.com/theory/ Prawo elektrodynamiki klasycznej: drgający ładunek jest źródłem promieniowania rozchodzącego się we wszystkich kierunkach w płaszczyźnie prostopadłej do oscylacji Cechy: częstość i intensywność Jeżeli nie istnieją różnice gęstości optycznej, fale, tworzone w sąsiadujących punktach, wzajemnie się wygaszają.
Cechy promieniowania rozproszonego Intensywnośd (natężenie), I I~E 0 2 (kwadrat amplitudy pola elektrycznego) I~λ 4 (fale krótsze rozpraszają się silniej niż dłuższe: Rayleigh) I zależy od kąta rozpraszania θ Częstośd: równa częstości promieniowania padającego = rozpraszanie Rayleigha (1871r.) = elastyczne różna od częstości promieniowania padającego = rozpraszanie Ramana (1928r.) = nieelastyczne
Dlaczego niebo jest niebieskie?
Dlaczego niebo jest niebieskie! I ~ 1/ 4 (700 nm / 400 nm) 4 = 1.75 4 = 9.4 Światło czerwone rozprasza się nawet 9-krotnie słabiej niż fioletowe.
Dlaczego zachodzące słooce zabarwia niebo na czerwono? I ~ 1/ 4 (700 nm / 400 nm) 4 = 1.75 4 = 9.4 Światło czerwone rozprasza się nawet 9-krotnie słabiej niż fioletowe.
Dlaczego obłoki na niebie są białe? Dla obiektów o cząstkach znacznie większych od długości fali światła mamy do czynienia ze światłem odbitym: Tęcza: światło rozszczepione w kropelkach wody I ~ 0
Rozpraszanie w roztworze V E o, o v r k s k i q v R E S P v - mikroskopijnie mały element objętości zawierający molekuły rozpraszające światło, k i, k s wektory falowe światła padającego i rozproszonego. q wektor rozpraszania, P punkt obserwacji natężenia pola elektrycznego E s, odległy o R od środka układu rozpraszającego, W elastycznym rozpraszaniu światła, k i i k s są sobie równe, q = k i - k s = 2 n/ sin( ).
Częstotliwośd światła rozproszonego Częstotliwośd: równa częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Rayleigha) = elastyczne oddziaływanie pola fali EM z dipolem elektrycznym cząsteczki różna od częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Ramana) = nieelastyczne oddziaływanie światła z cząstkami zmiana stanu energetycznego atomu lub cząsteczki. Zmiana częstotliwości może wynikad z ruchu cząsteczek rozpraszających efekt Dopplera.
Zmiana częstotliwości
Widmo światła rozproszonego
Fluktuacje natężenia
Wielkośd mierzona - rodzaj eksperymentu Natężenie całkowite (rozpraszanie statyczne) SLS (Static Light Scattering Statyczne Rozpraszanie Światła) Widmo światła rozproszonego (Interferometria Fabry- Perota) Fluktuacje natężenia światła rozproszonego DLS lub PCS (Dynamic [Quasi-elastic] Light Scattering, Photon Correlation Spectroscopy Dynamiczne Rozpraszanie Światła lub Spektroskopia Korelacyjna Fotonów)
Układ pomiarowy θ próbka λ, I i laser I I st - standard (benzen, toluen) detektor I 0 - rozpuszczalnik (bufor) I - roztwór (białka, DNA, etc.) q = 2 n/ sin( )
Układ pomiarowy
Rozpraszanie promieniowania Natężenie promieniowania rozproszonego I(q): R KMcP( q) S( q) gdzie: R Θ R st I I I st 0 n n 0 st 2 2 4 no 4 N R Θ jest współczynnikiem Rayleigha q - wektor rozpraszania, K - stała zależna od przyrządu oraz kontrastu optycznego dn/dc, c - stężenie wagowe, M - masa cząsteczkowa (wagowo średnia), P(q) - czynnik kształtu (interferencja wewnątrzcząsteczkowa), S(q) - czynnik struktury (interferencja międzycząsteczkowa) K A d d n c 2
Rozpraszanie statyczne w roztworze Kc/R Θ siła jonowa 1/M R KMcP ( q) S( q) c Kc R 1 2 B M 22 c P(q) 1 (interferencje wewnątrzcząsteczkowe) S(q) interferencje międzycząsteczkowe
Indykatrysy rozpraszania światła I(θ) P(q) Dla cząsteczek małych w porównaniu z długością fali światła: d << Dla cząsteczek porównywalnych z długością fali światła: d
Rozpraszanie statyczne w roztworze I(Θ) P(q) 1/I a tg a = 1/3 q 2 R g 2 q 2 P(q) interferencje wewnątrzcząsteczkowe ~ R g
P(q) 1 Obliczone czynniki kształtu dla trzech brył o takiej samej objętości 0.1 kula kula wydrążona pałeczka 0.01 Wymiary: R = 10 nm R = 17,7 nm, h = 1 nm L=333 nm, d = 20 nm 1E-3 0.01 0.1 1 q / nm
Rozpraszanie dynamiczne światło rozproszone światło lasera widmo I w I w natężenie g(t) t g(t) t funkcja korelacji t t
Funkcja (auto)korelacji x t g 2 q, τ = < Δx iδx i+τ > < Δx 2 >
Spektroskopia Korelacji Fotonów (Photon Correlation Spectroscopy - PCS) Zastosowanie do badao submikrosopowych obiektów biologicznych Co można zmierzyd: Współczynnik dyfuzji translacyjnej (D T ): makrocząsteczek biologicznych (białka, kwasy nukleinowe), biologicznych układów supramolekularnych (organella komórkowe, pęcherzyki utworzone z błony lipidowej, asocjaty białkowe, mniejsze komórki) g 2 q, τ = 1 + exp ( 2q 2 D T )
Informacje z pomiaru spektroskopii korelacji fotonów (PCS) Pomiar D T - informacje o rozmiarze i kształcie obiektu rozpraszającego kula elipsoida obrotowa pałeczka model kulkowy D T = k B T/(6 R H )
Spektroskopia Korelacji Fotonów Z zależności D T od stężenia otrzymuje się informacje o sile i naturze oddziaływao między obiektami. D T odpychanie kompensacja przyciąganie c
Kombinacja R H z v 2 i δ 1 v 1 V h = V 0 + V H2 O (objętość hydratowanego białka) V 0 = (M w /N A )v 2 (objętość suchego białka) V H2 O = δ 1 (M w /N A )v 1 (objętość dołączonej wody) R h = [(3/4π)V h ] 1/3 = *(3/4π)(M w /N A )(v 2 + δ 1 v 1 )] 1/3 V h = (M w /N A )(v 2 + δ 1 v 1 ) v 2 - objętośd właściwa cząsteczki, dla białek 0.69-0.75 (cm 3 /g), średnio 0.73 (cm 3 /g) [na podstawie sekwencji] δ 1 - hydratacja, dla białek 0.2-0.6 (g H 2 O/g białka), średnio 0.35(g H 2 O/g białka) [na podstawie sekwencji] v 1 objętośd właściwa wody związanej z makrocząsteczką, v 1 = 0.9058(cm 3 /g) R H = R h F b a b b a b
Lizozym - model elipsoidy N A 0.0102 g/cm s 6.02E+23 1/mol k B M w v 2 0.73 1.38E-16 g cm2/s2k 14300.00 MU b a b b a b v 1 0.99009901 1 0.2 D T 1.14E-06 cm2/s R H R h R o f f h 1.846E-07 cm 1.739E-07 cm 1.605E-07 cm 3.549E-8 kt/d 3.344E-8 6 R o f/f h 1.0612 1 max 0.1439 g/g F przy 1 1.06123 el.wydł. el.spłaszcz. a(wydl.) b(wydl.) a(spl.) b(spl) 0.442 b/a 2.312 b/a 30.0E-8 cm 13.3E-8 cm 09.9E-8 cm 23.0E-8 cm
a a b b b b d Może się zdarzyć, że różne cząsteczki (modele) będą miały taki sam współczynnik dyfuzji. Trudniejsze (niemożliwe) jest znalezienie dwóch różnych cząsteczek z dwoma takimi samymi parametrami hydrodynamicznymi (np. współczynnikiem dyfuzji translacyjnej i rotacyjnej) L
Kombinacje różnych parametrów parametry hydrodynamiczne D T - współczynnik dyfuzji S - współczynnik sedymentacji τ - czas relaksacji rotacyjnej [η] - graniczna liczba lepkościowa informacje M w (masa), R H, R g (rozmiar), v 1, ρ (objętośd właściwa, hydratacja) a/b (kształt) giętkośd stopieo asocjacji
Kombinacja parametrów D T i D R (lub τ ) S i D T D T i [η] D T i R g p = b/a lub p = L/d + informacje o objętości właściwej i hydratacji
Proste modele hydrodynamiczne elipsoida obrotowa wydłużona (p=a/b) elipsoida obrotowa spłaszczona (p=a/b) BPTI pałeczka (cylinder) (p=l/d) aktyna 20mer DNA
Modele kulkowe Wymagają informacji o budowie (np. z NMR lub krystalografii) (F = -fv) i F i i( ui vi ), i = 1, 2,..., N v i D T = kt -1 Programy obliczające parametry hydrodynamiczne na podstawie modelu kulkowego: HYDRO: http://leonardo.fcu.um.es/macromol/programs/hydro/hydro.htm HYDROPRO: http://leonardo.fcu.um.es/macromol/programs/hydropro/hydropro.htm
Różne typy modeli kulkowych a) c) b) a) model kula-atom domeny katalitycznej CBD, b) model kulkaaminokwas inhibitora trypsyny, BPTI, c) model dużych podjednostek dla immunoglobuliny IgG3.
Model powłokowy Kulka na atom pierwotny model lizozymu, model wypełniony (filling model) powłokowy model lizozymu (pusty w środku, shell model)
Kulka na aminokwas 4.5 Å 4.5 Å 2.6 Å 2.6 Å
Kulka na nukleotyd Jedna kulka na nukleotyd Dwie kulki na nukleotyd
Podsumowanie Informacje najczęściej wykorzystywane w badaniach biologicznych: Współczynnik dyfuzji translacyjnej (D T ), Promieo hydrodynamiczny (R h ), Liczba składników w roztworze, Masa cząsteczkowa (dla każdego składnika osobno) w połączeniu z rozpraszaniem statycznym, Procentowy udział poszczególnych składników (w połączeniu z rozpraszaniem statycznym), Zjawiska asocjacji i agregacji, Kinetyka agregacji, Oddziaływania w roztworze, Ładunek efektywny cząsteczek, Mody drgao wewnętrznych dla dużych obiektów (np. długie fragmenty DNA), Kształt dużych obiektów (czynnik kształtu pomiary kątowe).