Rozpraszanie światła. Światło

Transkrypt

1 Rozpraszanie światła Światło fala elektromagnetyczna o długości z zakresu widzialnego ( nm) strumień fotonów E.Banachowicz 1

2 Natura falowa światła E z (t)=e o sin(2πυt-ky) H x (t)=h o sin(2πυt-ky) E o,h o - amplitudy υ - częstotliwość k=(2π/λ)=ω/c - wektor falowy w kierunku rozchodzenia się fali ω=2πυ=2πc/ λ - częstość kątowa Natura falowa światła w liczach: prędkośćświatła c=2, m/s długość fali λ=( )nm (nm = 10-9 m = 10Å) częstotliwośćυ= (7,7-3,8) Hz (fioletowe-czerwone) licza falowa (częstośćυ=1/λ) cm -1 rozmiar cząsteczek rozpraszających: Å (1-10 nm) E.Banachowicz 2

3 Natura korpuskularna światła promieniowanie EM jest strumieniem fotonów E=hν=hνc, energia fotonu o częstotliwości ν Hemogloina ma kolor czerwony! - silnie asoruje promieniowanie żółte, zielone i nieieskie a przepuszcza czerwone Zaasorowany foton odpowiadający światłu żółtemu (λ=550nm) to energia 3, J Rozpraszanie światła Prawo elektrodynamiki klasycznej: drgający ładunek jest źródłem promieniowania rozchodzącego się we wszystkich kierunkach w płaszczyźnie prostopadłej do oscylacji Cechy: częstość i intensywność E.Banachowicz 3

4 Cechy promieniowania rozproszonego Intensywność (natężenie), I I ~ E o 2 (kwadrat amplitudy pola elektrycznego) I ~λ -4 (fale krótsze rozpraszają się silniej niż dłuższe) I zależy od kąta rozpraszania θ Częstość: równa częstości promieniowania padającego = rozpraszanie Rayleigha (1871r.) = elastyczne różna od częstości promieniowania padającego = rozpraszanie Ramana (1928r.) = nieelastyczne Dlaczego nieo jest nieieskie? E.Banachowicz 4

5 Dlaczego nieo jest nieieskie! I ~ 1/λ 4 (700 nm / 400 nm) 4 = = 9.4 Światło czerwone rozprasza się nawet 9-krotnie słaiej niż fioletowe. Dlaczego nieo jest nieieskie! I ~ 1/λ 4 (700 nm / 400 nm) 4 = = 9.4 Światło czerwone rozprasza się nawet 9-krotnie słaiej niż fioletowe. E.Banachowicz 5

6 Rozpraszanie w roztworze V Eo, λo v r ks θ ki q v R ES P v-mikroskopijnie mały element ojętości zawierający molekuły rozpraszające światło, k i, k s wektory falowe światła padającego i rozproszonego. q- wektor rozpraszania, P- punkt oserwacji natężenia pola elektrycznego E s, odległy o R od środka układu rozpraszającego, W elastycznym rozpraszaniu światła, k i i k s są soie równe, q = k i - k s = 2πn/λsin(θ). Częstotliwośćświatła rozproszonego Częstotliwość: równa częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Rayleigha) = elastyczne oddziaływanie pola fali EM z dipolem elektrycznym cząsteczki różna od częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Ramana) = nieelastyczne oddziaływaniezmiana stanu energetycznego atomu lu cząsteczki!!ale zmiana częstotliwość może wyniknąć z ruch cząsteczek rozpraszających - efekt Doplera E.Banachowicz 6

7 Zmiana częstotliwości Widmo światła rozproszonego E.Banachowicz 7

8 Fluktuacje natężenia Wielkość mierzona - rodzaj eksperymentu Natężenie całkowite (rozpraszanie statyczne) SLS (Statyczne Rozpraszanie Światła) Widmo światła rozproszonego (Interferometria Fary- Perota) Fluktuacje natężenia światła rozproszonego DLS lu PCS (Dynamiczne Rozpraszanie Światła lu Spektroskopia Korelacji Fotonów) E.Banachowicz 8

9 Układ pomiarowy próka θ I λ, I i laser I st - standard (enzen, toluen) detektor I o - rozpuszczalnik (uffor) I - roztwór (iałka, DNA, etc.) q = 2πn/λsin(θ) Układ pomiarowy E.Banachowicz 9

10 gdzie: Rozpraszanie promieniowania Natężenie promieniowania rozproszonego I(q): R R = Θ Θ = R st I I I st KMcP( q) S( q) o n n o st 2 2 4πno dn K = 4 N λ dc R Θ jest współczynnikiem Rayleigha q - wektor rozpraszania, K - stała zależna od przyrządu oraz kontrastu optycznego dn/dc, c - stężenie wagowe, M - masa cząsteczkowa (wagowo średnia), P(q) - czynnik kształtu (interferencja wewnątrzcząsteczkowa), S(q) - czynnik struktury (interferencja międzycząsteczkowa) A 2 E.Banachowicz 10

11 Rozpraszanie statyczne w roztworze Kc/R siła jonowa 1/M R = Θ KMcP( q) S( q) c Kc R Θ = B M 22 c P(q) 1 (interferencje wewnątrzcząsteczkowe) S(q) interferencje międzycząsteczkowe Indykatrysy rozpraszania światła I(θ) P(q) Dla cząsteczek małych w porównaniu z długością fali światła: d << λ Dla cząsteczek porównywalnych z długością fali światła: d λ E.Banachowicz 11

12 Rozpraszanie statyczne w roztworze I(θ) P(q) 1/I α tg α = 1/3 q 2 R g 2 q 2 P(q) interferencje wewnątrzcząsteczkowe ~ R g 1 Oliczone czynniki kształtu dla trzech rył o takiej samej ojętości P(q) kula kula wydrążona pałeczka Wymiary: R = 10 nm R = 17.7 nm, h = 1 nm L=333 nm, d = 20 nm 1E q / nm E.Banachowicz 12

13 Rozpraszanie dynamiczne światło rozproszone światło lasera widmo I ω I ω natężenie g(τ) t g(τ) t funkcja korelacji τ τ E.Banachowicz 13

14 Spektroskopia Korelacji Fotonów (Photon Correlation Spectroscopy - PCS) Zastosowanie do adań sumikrosopowych oiektów iologicznych. Co można zmierzyć: Współczynnik dyfuzji translacyjnej (D T ): makrocząsteczek iologicznych (iałka, kwasy nukleinowe), iologicznych układów supramolekularnych (organella komórkowe, pęcherzyki utworzone z łony lipidowej, asocjaty iałkowe, mniejsze komórki) G(t) = <I(0)I(t)> g (2) (t) = 1 + exp(-2 q 2 D T ). Informacje z pomiaru spektroskopii korelacji fotonów (PCS) Pomiar D T - informacje o rozmiarze i kształcie oiektu rozpraszającego kula elipsoida orotowa pałeczka model kulkowy D T = k B T/(6πηR H ) E.Banachowicz 14

15 Spektroskopia Korelacji Fotonów Z zależności D T od stężenia otrzymuje się informacje o sile i naturze oddziaływań między oiektami. D T odpychanie kompensacja przyciąganie c Kula -najprostszy model hydrodynamiczy D T = kt/(6πηr H ) Interpretacja np. np. współczynnika dyfuzji dyfuzji (+) (+) Rozmiar (?) (?) Kształt Kształt (?) (?) Upakowanie (?) (?) Hydratacja R H E.Banachowicz 15

16 Kominacja R H z v 2 iδ 1 v 1 V h = V o = V H2O (ojętość hydratowanego iałka) V o = (M w /N A )v 2 (ojętość suchego iałka) V H2O = δ 1 (M w /N A )v 1 (ojętość dołączonej wody) V h = h (M (M w /N w /N A )(v A )(v δ 1 v 1 1 ) 1 ) R h = h [(3/4π)V h ]1/3 h ] = [(3/4π)(M w /N /N A )(v )(v 2 +δ 2 1 v 1 1 )] 1 )] 1/3 1/3 vv 2-2 -ojętość ojętośćwłaściwa właściwacząsteczki, cząsteczki, dla dla iałek iałek (cm (cm 3 /g), 3 /g), średnio średnio (cm (cm 3 /g) 3 /g)[na [na podstawie podstawie sekwencji] sekwencji] δ 1-1 -hydratacja, dla dla iałek iałek (g (g H 2 O/g 2 O/g iałka), iałka), średnio średnio 0.35(g 0.35(g H 2 O/g 2 O/g iałka) iałka) [na [na podstawie podstawie sekwencji] sekwencji] vv 1 1 ojętość ojętośćwłaściwa właściwawody wody związanej związanej z z makrocząsteczką, makrocząsteczką, vv 1 = (cm (cm 3 /g) 3 /g) R H = R hh F a a Lizozym - model elipsoidy η N A g/cm s 6.02E+23 1/mol k B 1.38E-16 g cm2/s2k M w MU v v δ1 0.2 a a D T 1.14E-06 cm2/s R H 1.846E-07 cm R h 1.739E-07 cm R o 1.605E-07 cm f 3.549E-8 kt/d f h 3.344E-8 6πηR o f/f h max δ g/g F przy δ el.wydł. el.spłaszcz. a(wydl.) (wydl.) a(spl.) (spl) /a /a 30.0E-8 cm 13.3E-8 cm 09.9E-8 cm 23.0E-8 cm E.Banachowicz 16

17 a a d L Może się zdarzyć, że różne cząsteczki (modele) ędą miały taki sam współczynnik dyfuzji. Trudniej (niemożliwe) jest znaleźć dwie różne cząsteczki z dwoma takimi samymi parametrami hydrodynamicznymi (np. współczynnikiem dyfuzji translacyjnej i rotacyjnej) Kominacje różnych parametrów parametry hydrodynamiczne D T - współczynnik dyfuzji S - współczynnik sedymentacji τ - czas relaksacji rotacyjnej [η] - graniczna licza lepkościowa informacje M w (masa), R H, R g (rozmiar), υ 1, ρ (ojętość właściwa, hydratacja) a/ (kształt) giętkość stopień asocjacji E.Banachowicz 17

18 Kominacja parametrów D T i D R (lu τ ) S i D T D T i [η] D T i R g p=/a lu p=l/d + informacje o ojętości właściwej i hydratacji Proste modele hydrodynamiczne elipsoida orotowa wydłużona (p=a/) elipsoida orotowa spłaszczona (p=a/) BPTI pałeczka (cylinder) (p=l/d) aktyna 20mer DNA E.Banachowicz 18

19 Modele kulkowe Wymagają informacji o udowie (np. z NMR lu krystalografii) (F = -fv) i F i = ξ u v ), i = 1, 2,..., N i ( i i v i D T = kt Ξ -1 Programy oliczające parametry hydrodynamiczne na podstawie modelu kolkowego: HYDRO: HYDROPRO: HI4 (R. Pastor - u autora) Różne typy modeli kulkowych a) c) ) a) model kula-atom domeny katalitycznej CBD, ) model kulkaaminokwas inhiitora trypsyny, BPTI, c) model dużych podjednostek dla immunoglouliny IgG3. E.Banachowicz 19

20 Model powłokowy Kulka na atom pierwotny model lizozymu, model wypełniony (filling model) powłokowy model lizozymu (pusty w środku, shell model) Kulka na aminokwas 4.5 Å 4.5 Å 2.6 Å 2.6 Å E.Banachowicz 20

21 Kulka na nukleotyd Jedna kulka na nukleotyd Dwie kulki na nukleotyd Podsumowanie Informacje najczęściej wykorzystywane w adaniach iologicznych: Współczynnik dyfuzji translacyjnej (D T ), Promień hydrodynamiczny (R h ), Licza składników w roztworze, Masa cząsteczkowa (dla każdego składnika osono) w połączeniu z rozpraszaniem statycznym, Procentowy udział poszczególnych składników (w połączeniu z rozpraszaniem statycznym), Zjawiska asocjacji i agregacji, Kinetyka agregacji, Oddziaływania w roztworze, Ładunek efektywny cząsteczek, Mody drgań wewnętrznych dla dużych oiektów (np. długie fragmenty DNA), Kształt dużych oiektów (czynnik kształtu pomiary kątowe). E.Banachowicz 21

22 Koniec Zadania E.Banachowicz 22