Fakultet: Cytometria zastosowanie w badaniach biologicznych Wprowadzenie do cytometrii przepływowej: metody znakowania komórek Nadzieja Drela Zakład Immunologii WB UW ndrela@biol.uw.edu.pl
Przygotowanie komórek do znakowania
1. Zawiesina komórek (bez fragmentów tkanek, błon komórkowych, zlepionych komórek). Komórki z hodowli nieadherentnych i krwi obwodowej stwarzają najmniej problemów 2. Komórki z hodowli adherentnych (trawienie enzymatyczne). Trawienie receptorów, zmniejszenie ich ekspresji, zmniejszenie dostępności do epitopów 3. Izolowanie komórek z narządów metodami mechanicznymi, enzymatycznymi lub obiema jednocześnie
1. Próbki kliniczne zwykle krew obwodowa, wymaga lizy erytrocytów (wodą, chlorkiem amonu, detergentem) 2. Antygeny powierzchniowe znakowane są na komórkach nieutrwalonych standardowe procedury 3. Znakowanie wewnątrzkomórkowe wymaga utrwalania i permeabilizacji komórek. Brak jest standardowej procedury: a/ utrwalanie 70% etanolem w 4 st. C; b/ utrwalanie absolutnym metanolem w -80 st.c; c/ 1% formaldehyd w 4 st.c, następnie metanol w -20 st.c; d/ 1% formaldehyd w obecności detergentu (saponina) w 0-4 st.c, następnie metanol w -20 st.c (lub bez tego etapu)
Zasady barwienia komórek Barwienie z użyciem przeciwciał sprzężonych z fluorochromami Barwienie z użyciem cząsteczek innych niż przeciwciała sprzężonych z fluorochromami Barwienie wolnymi barwnikami fluorescencyjnymi
Zastosowanie przeciwciał w cytometrii przepływowej
Schematyczna budowa przeciwciał
Odpowiedź pierwotna i wtórna
Zastosowanie przeciwciał wykorzystuje ich zdolność do wiązania antygenów: Podstawą jest reakcja Ag:Ab Antygeny występują w organizmach żywych powszechnie i służą do specyficznej identyfikacji komórek
Przeciwciała poliklonalne
Przeciwciała monoklonalne
Porównanie surowicy poliklonalnej i przeciwciał monoklonalnych Surowica poliklonalna Ag Ag Przeciwciała monoklonalne Ag Rysunek :Ewa Kozłowska
Porównanie surowicy poliklonalnej i przeciwciał monoklonalnych Przeciwciała poliklonalne są specyficzne dla wielu epitopów tego samego antygenu, zatem są heterogenne i utrudniają standaryzację znakowania i analizy Przeciwciała monoklonalne wiążą takie same epitopy, zatem można uzyskać powtarzalność znakowania
Określanie fenotypu komórek - immunofenotypowanie Identyfikacja komórek na podstawie znaczników/markerów powierzchniowych Do tego celu używamy Ab monoklonalnych przeciwko markerom różnicującym komórki analiza Znakowanie/inkubacja
Znakowanie bezpośrednie Znakowanie pośrednie http://flowbook.denovosoftware.com/flow_book/chapter_5%3a_immunofluorescence_and_colour_compensation
Który sygnał jest silniejszy?
Jak wybieramy przeciwciała http://flowbook.denovosoftware.com/flow_book/chapter_5%3a_immunofluorescence_and_colour_compensation
Która metoda jest lepsza?
Znakowanie markerów powierzchniowych CD8 CD4 CD8 CD4 CD4
Która metoda jest lepsza?
Fałszywe pozytywne wyniki
Czy można stosować obie metody jednocześnie? 1. Inkubacja z nieznakowanym I rz. przeciwciałem. Płukanie 2. Inkubacja ze znakowanym II rz. Ab. Płukanie 3. Inkubacja z surowicą myszy (blokuje niewysycone miejsca II rz. przeciwciała) 4. Inkubacja ze znakowanym I rz. Ab. Płukanie 5. Analiza
Przeciwciało/biotyna/awidyna 1. Biotyna, wit. H, wit. B7 2. Awidyna, białko obecne w jajach, wykazuje powinowactwo do biotyny, 1 cz. awidyny wiąże 4 cz. biotyny 3. Streptoawidyna, białko bakteryjne (Streptomyces avidinii), wiąże niekowalencyjnie biotynę Reakcja biotyna-awidyna; biotyna-streptoawidyna specyficzna, nieodwracalna
1. Nieznakowane Ab I-rzędowe + Ab II-rzędowe sprzężone z fluorochromem 2. Ab I rz. + Ab II rz. Biotyna + streptawidyna/fluorochrom 3. Amplifikacja systemu 2
Wybór odpowiedniego stężenia przeciwciała http://flowbook.denovosoftware.com/flow_book/chapter_5%3a_immunofluorescence_and_colour_compensation
1. Zwykle rozcieńczamy Ab: szereg dwukrotnych rozcieńczeń np. 1:50, 1:100, 1:200 itd. 2. Inkubujemy komórki z takimi samymi rozcieńczeniami kontroli izotypowej 3. Chcemy oceniać ekspresję badanego markera używamy stężenie saturujące 4. Chcemy ocenić obecność pozytywnych i negatywnych komórek używamy mniejszego stężenia (przeważają względy finansowe)
Kontrola izotypowa Rodzaj kontroli negatywnej wykluczający niespecyficzne wiązanie przeciwcial wynikające głównie z wiązania z receptorami Fc. Przykład: mysie przeciwciała IgG2a silnie wiązane są przez leukocyty człowieka.
Znakowanie komórek z zastosowaniem cząsteczek innych niż Ab sprzężonych z fluorochromami
Aneksyna V Białko komórkowe o słabo poznanej funkcji. Wykazuje powinowactwo do fosfatydyloseryny. http://www.google.pl/imgres?imgurl=http://www.biomol.de/dateien/infos_nr647.gif&imgrefurl=http://www.biomol.
Oznaczanie komórek apoptotycznych
Znakowanie wolnymi barwnikami fluorescencyjnymi
Oznaczanie zawartości DNA DAPI, PI, 7-AAD bezpośrednio łączą się z DNA DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol) UV, przenika przez błony żywych i utrwalonych komórek, 358 nm/461 nm PI 535 nm/617 nm, nie przepuszczalny dla błon żywych komórek (w komórkach roślinnych znakuje ścianę komórkową) 7-AAD, (7-aminoactinomycin D), duże powinowactwo do regionów GC, nie przenika przez błony żywych komórek, 546 nm/647 nm Hoechst bis-benzimidazole, przenika przez nienaruszone błony komórek, UV, 345 nm/ 485 nm
Analiza cyklu komórkowego
Analiza potencjału błonowego JC-1 (5,5,6,6 -tetrachloro-1,1,3,3 tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide)
A -Hc Ctrl R2 R3 R4 ASM R2 R3 R4 Analiza potencjału błonowego R2-88.30% R3-7.51% R4-0.06% R2-77.65% * R3-17.60% * R4-0.07% B +Hc R2 R3 R4 R2 R3 R4 R2-76.16% # R3-13.81% # R4-6.21% # R2-60.27% * # ^ R3-29.18% * # ^ R4-7.19% # ^
Zastosowanie CFDA-SE do znakowania komórek
Analiza proliferacji
Analiza proliferacji G3 G3 G3 G3 G3 G2 G2 G1 G1 G2 G3 G3 G2 G1 G2 G3 G3 G2 G3 G3 G3 Ewa Kozłowska
Jeszcze raz zastosowanie przeciwciał..ale na nośniku
Oznaczanie stężenia cytokin
Wybór fluorochromów 1. Typ i liczba laserów i detektorów 2. Zestaw filtrów optycznych (filtry pasmowe zwiększają czułość detekcji fluorochromu, ale zwiększają ryzyko spillover ) Wirtualne testowanie: Bdbiosciences.com.spectra
Źródła światła i fluorochromy (Aria) Laser Wavelength Min. Power Commonly Used Fluorochromes (nm) (mw) Coherent 488 nm (blue) 13 FITC, PE, PE-TxRed, PE-Cy7, Sapphire PerCP, PerCPCy5.5, PI Solid State JDS Uniphase 633 nm (red) 11 APC, APC-Cy7 HeNe Air Cooled Point Source 407 nm (violet) 10 Alexa Fluor, Cascade blue, Violet Solid State Pacific blue, DAPI, Hoeschst, (optional) AmCyan http://www.bdbiosciences.com
Układ optyczny: laser niebieski http://www.bdbiosciences.com
Układ optyczny: czerwony i fioletowy http://www.bdbiosciences.com
Wybór fluorochromu Bright = zapewniają dobrą czułość http://www.bdbiosciences.com
http://www.bdbiosciences.com BD Biosciences Application Note
Bright ale minimalizacja spillover (spectral overlap, nakładanie spektrum emisji) Te dwie zasady często się wykluczają BD Biosciences Application Note http://www.bdbiosciences.com
BD Biosciences Application Note http://www.bdbiosciences.com
Przykład: CD8 bright/cd62l dim CD62L PE/CD8 FITC FITC-PE PE-FITC
Jeszcze jedna zasada doboru fluorochromów: Stosuj bright fluorochrom dla dim Ab Stosuj dim fluorochrom dla bright Ab ale. Unikaj spillover silnie świecącej populacji do detektora wykrywającego słabo świecącą populację, czyli do detektora wykrywającego z dużą czułością.
Fluorochromy tandemowe: APC-Cy7 PE-Cy7 Degradują pod wpływem światła, utrwalania (formaldehydem) i ogrzewania. Wówczas emitują fluorescencję w zakresie barwnika głównego (APC, PE), co skutkuje fałszywym wynikiem pozytywnym. Zatem: stosuj stabilne pochodne, używaj zalecanych buforów do utrwalania, przechowuj próby w ciemności i odpowiedniej temperaturze, zwykle 4 st. C.
Zasady doboru fluorochromów do analizy wielokolorowej: 1. Wybieraj najsilniej świecące fluorochromy 2. Minimalizuj spillover 3. Stosuj silne fluorochromy do słabych przeciwciał i odwrotnie: słabe fluorochromy do silnych przeciwciał 4. Unikaj spillover silnie świecącej populacji do detektorów wykrywających słabo świecące populacje 5. Stosuj procedury zapobiegające degradacji fluorochromów tandemowych
Spektra emisji fluorochromów: spillover http://www.bdbiosciences.com
Spillover
Najczęściej używane zestawy barwników BD Biosciences Application Note http://www.bdbiosciences.com
Kompensacja A. Zła kompensacja B. Prawidłowa kompensacja C. Niedokompensowane D. Przekompensowane http://flowbook.denovosoftware.com/flow_book/chapter_5%3a_immunofluorescence_and_colour_compensation
Kompensacja kiedy jest nieprawidłowa? A. Zła kompensacja spektra emisji fluorochromów na siebie zachodzą B. Prawidłowa kompensacja C. Niedokompensowane za mało sygnału FITC odjęto z kanału PE D. Przekompensowane za dużo sygnału FITC odjęto z kanału PE
Spillover http://flowbook.denovosoftware.com/flow_book/chapter_5%3a_immunofluorescence_and_colour_compensation
Kompensacja w praktyce
Przykłady prawidłowej kompensacji Correct Compensation Under Compensation Over Compensation http://www.bdbiosciences.com
Jakich markerów używamy do kompensacji? Small errors in compensation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C). Use bright markers to setup proper compensation. http://www.bdbiosciences.com
Barwniki tandemowe CD8 PE-Cy7 CD3 PE-Cy5 Time Sample Left in Light 0 hours PE (FL2) 2 hours 22.5 hours http://www.bdbiosciences.com
Kompensacja konjugatów tandemowych jest charakterystyczna dla serii http://www.bdbiosciences.com
Obraz zależny od kompensacji i rodzaju skali A. Zła kompensacja spektra emisji fluorochromów na siebie zachodzą B. Prawidłowa kompensacja off-line C. Prawidłowa kompensacja jak B, ale inna skala osi D. Prawidłowa kompensacja na skali bieksponencjalnej http://flowbook.denovosoftware.com/flow_book/chapter_5%3a_immunofluorescence_and_colour_compensation
Kompensacja przy użyciu kulek kalibracyjnych http://www.bdbiosciences.com
http://www.bdbiosciences.com/research/m ulticolor/spectrum_viewer/index.jsp
Dziękuję za uwagę