ZASTOSOWANIE MIKROSYSTEMÓW W MEDYCYNIE LABORATORIUM. Ćwiczenie nr 4 MIKROCYTOMETR DO BADANIA KOMÓREK BIOLOGICZNYCH

Transkrypt

1 ZASTOSOWANIE MIKROSYSTEMÓW W MEDYCYNIE LABORATORIUM Ćwiczenie nr 4 MIKROCYTOMETR DO BADANIA KOMÓREK BIOLOGICZNYCH Cel ćwiczenia: Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z budową i warunkami działania mikrocytometru typu T z detekcją fluorymetryczną. W ćwiczeniu badany będzie poziom sygnału fluorescencyjnego pochodzącego od mikrokulek fluorescencyjnych, które stanowią model dla oocytu/zarodka bydła lub trzody chlewnej. Opis stanowiska: 1. Krzemowo-szklany mikrocytometr typu T 2. Źródło światła: laser półprzewodnikowy o długości fali emisji 532 nm i mocy 5 mw 3. Kamera CCD z filtrem optycznym górnoprzepustowym FEL600 nm oraz kartą TV 4. Zasilacz do kamery (12 V) oraz lasera (5 V) 5. Komputer z oprogramowaniem Rys. 1. Schemat budowy mikrocytometru Rys. 2. Obszar detekcji fluorymetrycznej Rys. 3. Idea pracy mikrocytometru 1

2 Rys. 4. Schemat układu pomiarowego Stanowisko wyposażone jest w pompę perystaltyczną, która w sposób ciągły (ale pulsacyjny) podaje ciecz nośną z zawieszonymi w niej mikrokulkami oznaczonymi fluorescencyjnie. Kierunek przepływu mikrokulek jest dowolny. Przebieg ćwiczenia: 1. Zaznajomienie się z układem pomiarowym 2. Pomiary sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez oznakowane kulki polistyrenowe nr 1 i nr 2 1. Włączyć zasilacz. 2. Sprawdzić, czy laser oraz kamera CCD są podłączone do zasilacza (kamera: zasilacz MDM 12 V, laser: zasilacz MDM 5 V). 3. Włączyć komputer i zalogować się na konto Student (hasło: Student). 4. Włączyć program VirtualDub, wybrać opcję File Capture AVI, Video Preview. Sprawdzić czy obraz z kamery CCD, która znajduje się dokładnie nad chipem jest wyraźny. 5. W programie VirtualDub kreślić ścieżkę zapisu filmu (File Set Capture File). 6. Podłączyć zbiornik z kulkami nr1 (potem nr 2) do wlotu pompy perystaltycznej, włączyć pompę; początkowo zastosować duży przepływ (6), a kiedy front cieczy dojdzie do wlotu mikrokanału i sygnał fluorescencyjny od kulek będzie widoczny zmniejszyć przepływ (1). 7. Rozpocząć proces nagrywania filmu (Capture Start Capture). 8. W czasie nagrywania filmu co najmniej 10 kulek powinno przepłynąć przez skrzyżowanie T tak, aby dobrze widoczny był sygnał fluorescencji. 9. Wyłączyć nagrywanie filmu (Capture Stop Capture). 3. Analiza wyników pomiarów: Analizę wyników dokonuje się na podstawie obrazów graficznych zarejestrowanych kamerą cyfrową. 2

3 Zmiana rozmiaru filmu 1. Uruchomić program VirtualDub. 2. Wczytać plik z filmem (File Open video file). Pojawią się dwa okna z wczytanym filmem. 3. Następnie zmienić rozmiar analizowanego pliku (Video Filters Add ; pojawi się dodatkowe okienko, w którym wybieramy filtr resize i zadajemy szerokość 320 i wysokość 240 pikseli, po czym zatwierdzamy przyciskiem OK, dwukrotnie). 4. Kolejnym krokiem jest zapisanie filmu w formacie *.avi (File Save as AVI). 5. Czynność tą wykonujemy dla każdego z nagranych filmów. Analiza sygnału fluorescencji 1. Uruchomić program OPTOLABCARD software. 2. Wybrać ścieżkę zapisu wygenerowanego po analizie pliku *.xls oraz zdjęcia (Change dir). 3. Wczytać wybrany film do analizy (Select movie). 4. Po wczytaniu pliku w oknie po prawej stronie pojawi się obraz do analizy. Analizowany obraz 5. W celu dokładnego zaznaczenia analizowanych punktów należy powiększyć analizowany obszar przez naciśnięcie Enlarge area i zakreślenie tylko obszaru oświetlanego kanału. 6. Należy wybrać obszary, które będą poddane analizie. W tym celu należy zaznaczyć 2 pola do analizy (1 czerwone i 2 zielone). Jedno z nich powinno znajdować się w obszarze świecenia (sygnał fluorescencji kulki), a drugie poza nim (sygnał tła), ale w obszarze kanału. Pola do analizy nie powinny przekraczać wymiarów 2 2. W celu dokładnego narysowania pola do analizy można się posługiwać precyzyjnymi strzałkami. 3

4 Analizowane pola Rozmiar analizowanych pól Precyzyjne strzałki 7. W celu dokonania analizy zaznaczonych pól należy wcisnąć przycisk Measure. Spowoduje to pojawienie się krzywych pomiarowych w lewej części ekranu (Rys. 5) oraz automatycznie zostaną wygenerowane pliki *.xls oraz bmp do katalogu, który został wskazany na początku procedury. Krzywe pomiarowe 8. Powyższe czynności należy wykonać tak, aby uzyskać co najmniej 10 pików fluorescencyjnych (sygnały od 10 kulek). 4. Opracowanie wyników: 1. Wygenerowany w trakcie analizy plik *.xls zawiera trzy kolumny: 1 czas, 2 sygnał fluorescencji z pola czerwonego, 3 sygnał fluorescencji z pola zielonego. 2. Dla pojedynczej, wybranej kulki należy odjąć sygnał tła od sygnału fluorescencji w programie Excel lub Origin. 3. Czynności te należy powtórzyć dla każdej z 10 kulek. 4

5 4. Końcowym wynikiem analizy danych pomiarowych jest wykres (słupkowy) intensywności fluorescencji w zależności od numeru kulki. UWAGA!!! Po przeprowadzeniu serii pomiarów należy zawiesinę z kulkami przepompować z powrotem do zbiorniczka, a następnie kanał mikrocytometru przepłukać wodą dejonizowaną. W tym celu należy: a) zmienić kierunek pompowania i poczekać aż cała zawartość zmierzonej zawiesiny kulek nr 1 znajdzie się z powrotem w zbiorniczku nr 1, b) odłączyć rurkę wlotową pompy od naczynka z kulkami nr 1 i przepłukać mikrocytometr wodą dejonizowaną, c) powtórzyć pomiary dla kulek nr 2 i powtórzyć procedurę czyszczenia, jak dla kulek nr 1. Przykładowe pytania: Gdzie znajdują zastosowanie urządzenia typu Lab-on-a-Chip? Przedstawić schemat budowy mikrocytometru wraz z opisem funkcji poszczególnych elementów. Z jakich materiałów zbudowany jest mikrocytometr, opisz technologię. Jakie rodzaje detekcji oraz jakie detektory stosuje się w mikrocytometrach? Jakie metody są wykorzystywane do oceny jakości komórek rozrodczych? Przed wykonaniem ćwiczenia proszę zapoznać się z materiałami pomocniczymi przygotowanymi do ćwiczenia. 5