RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (2) OPIS PATENTOWY (9) PL () 206760 (2) Numer zgłoszenia: 36920 (22) Data zgłoszenia: 9.09.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 9.09.2002, PCT/SE02/00704 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 08.05.2003,WO03/038068 (3) B (5) Int.Cl. C2N /20 (2006.0) A6K 35/74 (2006.0) C2R /225 (2006.0) (54) Wyizolowany szczep bakteryjny, sposób izolowania szczepu bakteryjnego, kompozycja i artykuł sanitarny do profilaktyki i/lub leczenia infekcji przewodu moczowo-płciowego oraz zastosowanie takiego szczepu (30) Pierwszeństwo: 20.09.200, SE, 00327-7 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 8.04.2005 BUP 08/05 (73) Uprawniony z patentu: ELLEN AB, Danderyd, SE (72) Twórca(y) wynalazku: CAROLINA SAMUELSSON, Uppsala, SE ENDRE KVANTA, Angelholm, SE ANNA WEINER JIFFER, Laholm, SE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.09.200 WUP 09/0 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska PL 206760 B
2 PL 206 760 B Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany szczep bakteryjny z rodzaju Lactobacillus albo Pediococcus, sposób izolowania takiego szczepu bakteryjnego, kompozycja i artykuł sanitarny do profilaktyki i/lub leczenia infekcji przewodu moczowo-płciowego oraz zastosowanie takiego szczepu bakteryjnego. Dziedzina techniki Niniejszy wynalazek odnosi się do bakterii kwasu mlekowego i ich zastosowania. Tło techniczne Normalna flora drobnoustrojowa ludzkiej pochwy obejmuje bakterie wytwarzające kwas mlekowy, które tradycyjnie oznaczano jako laseczki Döderleina. Takie bakterie kwasu mlekowego odnoszą się do nieprzetrwalnikujących, Gram-dodatnich bakterii wytwarzających kwas mlekowy poprzez fermentowanie różnych cukrów, takich jak glikogen i/lub glukoza. Bakterie kwasu mlekowego obejmują bakterie np. z rodzaju Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus i Enterococcus. Bakterie kwasu mlekowego można podzielić na bakterie homofermentacyjne i heterofermentacyjne, w zależności od ich szlaku metabolicznego. Bakterie homofermentacyjne (np. Lactobacillus acidophilus) wytwarzają tylko kwas mlekowy, podczas gdy bakterie heterofermentacyjne wytwarzają także np. tlenek węgla, etanol lub kwas octowy. Rodzaj Lactobacillus jest fenotypowo heterogenną grupą względnych beztlenowców, ujemnych pod względem katalazy, bakterii pałeczkowatego kształtu, wytwarzających kwas mlekowy. Znanych jest ponad 50 różnych gatunków i gatunki te generalnie posiadają DNA o niskiej zawartości guaniny (G) i cytozyny (C), w przybliżeniu 33-53%. Zawartość GC jest stała w obrębie gatunku. Kilka gatunków Lactobacillus stwierdza się u ludzi, np. w jamie ustnej, przewodzie jelitowym i pochwie. Gatunki Lactobacillus, które występują w pochwie to np. Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus casei (podgatunek rhamnosus) oraz Lactobacillus jensenii. Rodzaj Pediococcus jest fenotypowo grupą Gram-dodatnich, ujemnych pod względem katalazy, względnie beztlenowych, tolerancyjnych w stosunku do tlenu, okrągłego kształtu (średnica około 0,6-,0 μm), niepatogennych bakterii, wytwarzających kwas mlekowy. Zdrowe, płodne kobiety (w wieku około 5-60 lat) wykazują ph pochwy wynoszące około 3,8-4,2 pomiędzy miesiączkami, przede wszystkim w wyniku wytwarzania wymienionego kwasu mlekowego. Środowisko kwasowe zapobiega osiedlaniu się w pochwie np. bakterii występujących w okrężnicy, takich jak Gardnerella vaginalis, Mobilunous, Bacteroides, Precotella i Escherichia coli. Skóra przewodu moczowo-płciowego i moczowo-płciowe błony śluzowe zdrowej kobiety są siedliskiem specyficznej flory korzystnych i/lub komensalnych drobnoustrojów, takich jak różne gatunki Lactobacillus. Jednakże przewód moczowo-płciowy może być także skolonizowany przez drobnoustroje chorobotwórcze. Kolonizacja niepożądanymi drobnoustrojami może być wynikiem przenoszenia drogą płciową, może nastąpić spontanicznie lub może być wynikiem zakłóceń normalnej flory drobnoustrojów. Wiadomo, że ten ostatni przypadek ma miejsce np. po niektórych terapiach antybiotykowych. Tak więc, mikroflora żeńskiego przewodu moczowo-płciowego, tak jak w pochwie, może ulec zakłóceniu i zmianie poprzez infekcję drobnoustrojami, takimi jak drożdże (Candida albicans), Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae i Chlamydia trachomatis, oraz poprzez zapalenie pochwy (cechujące się zwiększonym występowaniem Gardnerella vaginalis i Mobilunous), oraz przez leczenie antybiotykami, lub inne, często złożone przyczyny. Podczas menstruacji i stosunku płciowego, ph w pochwie zwiększa się dzięki obecności odpowiednio krwi i nasienia. Płyny te zawierają dużo białek, które mogą być trawione przez bakterie (np. Gardnerella vaginalis i Mobilunous), które, jak opisano wcześniej, mogą osiedlić się w pochwie w warunkach podwyższonego ph. Wytwarzane są wtedy produkty rozkładu, takie jak aminy (np. putrescyna i kadaceryna). Przy podwyższonym ph, aminy te stają się lotne i występuje rybi" odór. Poza tym, kobiety te często skarżą się na zwiększone upławy i podrażnienie pochwy. Stan ten jest zwany bakteryjnym zapaleniem pochwy (BV) i jest najczęstszym stanem związanym z podrażnieniem i zwiększoną ilością cuchnących upławów pochwowych (patrz Morris, M; Nicoll, A; Simms, I; Wilson, J; Catchpole, M, Bakte-
PL 206 760 B 3 rial vaginosis: A public health review, British Journal of Obstetrics and Gynaecology, 08 (5): 439-450, maj 200). Uważa się, że bakteryjne zapalenie pochwy jest wynikiem zaniku pochwowych bakterii kwasu mlekowego, które są zastępowane dużą ilością gatunków niepożądanych, takich jak Gardnerella vaginalis, Bacterioides, Mobiluncus, Prevotella bivia i Mycoplasma hominis. Metoda diagnozowania bakteryjnego zapalenia pochwy jest opisana przez Amsel Criteria. Po pierwsze, mierzy się ph upławów pochwowych. ph jest podwyższone powyżej 4,5 u około 90% kobiet z BV. Po drugie, jeśli do upławów doda się 0% KOH, rybi" odór uwolni się u około 70% kobiet z BV. Po trzecie, często na wilgotnym preparacie obserwuje się obecność łuskowatych komórek nabłonkowych pokrytych małymi ziarniako-laseczkami ( komórki jeżowe"). Innym godnym zaufania testem dla BV jest bezpośrednie barwienie Grama płynu pochwowego. Standaryzowaną metodę interpretacji zabarwień Grama dla BV przedstawił Nugent i inni (patrz przykład ). Wiadomo, że bakterie kwasu mlekowego mają zdolność hamowania wzrostu i/lub redukcji patogenności wielu patogenów związanych z infekcjami moczowo-płciowymi (patrz np. Redondo-Lopez, V; Cook, R.L; Sobel, J D, Emerging role of lactobacillus in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora, Reviews of infectious diseases, tom 2 nr 5, wrzesień-październik 990, i Boris, S; Barbes, C, Role played by lactobacillis in controlling the population of vaginal pathogens, Microbes and infection, tom 2, strony 543-546, 2000). Wiadomo także, że antagonistyczne właściwości bakterii kwasu mlekowego w stosunku do wymienionych patogenów, są co najmniej częściowo oznaczone ich zdolnością do wytwarzania różnych antagonistycznych substancji, takich jak kwas mlekowy, nadtlenek wodoru, bakteriocyny itd. Zdrowa pochwa jest zasiedlona szacunkowo przez około 0 8-0 9 cfu (=jednostek tworzenia kolonii) bakterii kwasu mlekowego. Skład tej flory wynika z tego, które specyficzne szczepy kobieta odziedziczyła po swojej matce i/lub które szczepy migrowały z jej przewodu pokarmowego do przewodu moczowo-płciowego. Poprzedni stan techniki opisuje preparaty, takie jak zawiesiny, czopki i kapsułki żelatynowe, zawierające żywe bakterie kwasu mlekowego. Takie preparaty są np. opisane w publikacjach US 5 466 463 i WO 9 309 793. Ponadto, wiadomo jak impregnować artykuły chłonne, takie jak tampony i podkładki sanitarne, bakteriami kwasu mlekowego w celu zabezpieczenia normalnej flory drobnoustrojów w przewodzie moczowo-płciowym kobiet, i przez to zapobiegania infekcjom moczowo-płciowym, albo przywrócenia normalnej flory drobnoustrojów w przewodzie moczowo-płciowym kobiet. Taki produkt jest opisany w EP 0 594 628 oraz szwedzkim zgłoszeniu patentowym 0003544-4. Jednakże, do uzyskania wyżej opisanego efektu kluczowym jest aby bakterie kwasu mlekowego hamujące patogeny dróg moczowo-płciowych naprawdę kolonizowały i zasiedlały vivo, i właściwie pozostawały, w pochwie przez ponad jeden cykl menstruacyjny, po podaniu dopochwowym. To czy szczepy bakteryjne skolonizują pochwę czy nie, zależy od właściwości adhezyjnych konkretnego szczepu bakterii, jak również hormonalnego, odżywczego i kwasowego stanu pochwy. Występująca infekcja narządów płciowych lub leczenie antybiotykami będzie także wpływać na zdolność wprowadzonego szczepu do kolonizowania pochwy. Cykl menstruacyjny ma także wpływ na przyleganie, a maksymalne przyleganie ma miejsce przed owulacją i przed menstruacją (US 6 80 00 i Chan i inni, Journal of Urology, marzec 984). Tak więc, najtrudniejszym czasem kolonizacji i zasiedlania pochwy dla podawanych bakterii kwasu mlekowego jest okres menstruacji. Ze względu na kolonizację i osiedlanie się bakterii kwasu mlekowego in vivo, może zaistnieć pewna niezgodność między wynikami klinicznymi a oczekiwanym zachowaniem bakterii wynikającym z interpretacji wyników analizy in vitro. Powszechne jest, że w pochwie występują interakcje między różnymi gatunkami bakterii i ten wzór interakcji jest trudny do odtworzenia w laboratorium. Tak więc, nawet jeśli gatunki bakterii wykazują obiecujące wyniki in vitro, mogą nie zasiedlać się in vivo i nie zapewniać żądanego efektu terapeutycznego, to znaczy zapobiegać, zmniejszać skutków i/lub leczyć infekcji drobnoustrojowej przewodu moczowo-płciowego. Ponadto, bardzo ważne jest aby bakterie wykazywały stabilność swego profilu genetycznego zarówno przy powtarzanej hodowli w produkcji na wielką skalę, jak i przez dłuższe okresy in vivo. Innym kryterium jakie musi być spełnione aby wytworzyć produkt użytkowy, który zapewnia żądany efekt terapeutyczny, jest zachowywanie żywotności bakterii w czasie liofilizacji bakterii i podczas przechowywania liofilizowanych bakterii (to znaczy okres przydatności).
4 PL 206 760 B Streszczenie wynalazku Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany szczep bakteryjny z rodzaju Lactobacillus albo Pediococcus, charakteryzujący się tym, że jest wybrany z grupy składającej się ze szczepu Lactobacillus gasseri, LN 40, zdeponowany pod numerem LMG P-20560, szczep Lactobacillus casei, podgatunek rhamnosus, LN 3, zdeponowany pod numerem LMG P-20562, szczep Lactobacillus fermentum, LN 99, zdeponowany pod numerem LMG P-2056, szczep Lactobacillus crispatus, LN 0, zdeponowany pod numerem LMG P-20558 i szczep Pediococcus acidilactici, LN 23, zdeponowany pod numerem LMG P-20559, oraz mającego zdolność do kolonizowania i zasiedlania ludzkiej pochwy po podaniu dopochwowym, nawet podczas menstruacji, przy czym ten szczep bakteryjny lub szczepy bakteryjne jest uważany/ są uważane za zasiedlony/zasiedlone jeżeli szczep bakteryjny lub szczepy bakteryjne jest/są obecny/obecne w pochwie po co najmniej dwóch cyklach menstruacyjnych od czasu podania, i przy czym wymienione szczepy zdeponowano w Belgijskich Skoordynowanych Zbiorach Drobnoustrojów 4 czerwca 200. Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób izolowania szczepu bakteryjnego z rodzaju Lactobacillus albo Pediococcus mającego zdolność kolonizacji i trwałego zasiedlania ludzkiej pochwy, nawet podczas menstruacji, polegający na tym, że obejmuje następujące etapy, w których: a) próbkę bakteryjną, taką jak płyn pochwowy, pobiera się z przewodu pochwowego kobiety z normalną, zdrową florą drobnoustrojową, b) bakterie kwasu mlekowego izoluje się z próbki pochwowej z etapu a), c) bakterie kwasu mlekowego z etapu b), hoduje się w czystości, in vitro, w odpowiedniej pożywce ze składnikami odżywczymi, dostarczając co najmniej jeden wyizolowany szczep bakteryjny, d) co najmniej jeden hodowany w czystości szczep bakteryjny z etapu c) i/lub kombinację co najmniej dwóch szczepów bakteryjnych z etapu c) ocenia się pod względem zdolności do kolonizowania i trwałego zasiedlania pochwy podczas po dopochwowym podaniu kobiecie szczepu bakteryjnego, podczas menstruacji, przy czym wymieniona kobieta wykazuje zaburzoną florę drobnoustrojową pochwy, gdzie wymieniony szczep lub szczepy bakteryjne są uważane za trwale osiedlone jeśli szczep lub szczepy bakteryjne są wciąż obecne w pochwie po co najmniej dwóch cyklach menstruacyjnych od czasu podania, oraz e) wybiera się co najmniej jeden szczep bakteryjny z etapu d), który wykazuje wymienioną zdolność do kolonizowania i trwałego zasiedlania pochwy. Korzystnie sposób ten obejmuje dodatkowo etap, w którym co najmniej jeden hodowany w czystości szczep bakteryjny z etapu c) i/lub kombinację co najmniej dwóch szczepów bakteryjnych z etapu c), liofilizuje się. Korzystniej sposób ten obejmuje dodatkowo etap, w którym co najmniej jeden liofilizowany, hodowany w czystości szczep bakteryjny z etapu c) i/lub kombinację co najmniej dwóch liofilizowanych szczepów bakteryjnych z etapu c) ocenia się ze względu na stabilność żywotności bakterii w czasie liofilizacji i żywotności liofilizowanych bakterii przez długi okres przechowywania, przy czym wymieniona żywotność bakterii jest uważana za stabilną jeśli co najmniej 40% bakterii ma zachowaną żywotność podczas liofilizacji i przechowywania liofilizowanych bakterii w temperaturze -8 C, przez co najmniej 2 miesięcy. Korzystniej sposób ten obejmuje dodatkowo etap, w którym co najmniej jeden liofilizowany, hodowany w czystości szczep bakteryjny z etapu c) i/lub kombinację co najmniej dwóch liofilizowanych szczepów bakteryjnych z etapu c) ocenia się i selekcjonuje ze względu na stabilność genetyczną w czasie powtarzanej hodowli. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja do profilaktyki i/lub leczenia infekcji przewodu moczowo-płciowego, charakteryzująca się tym, że zawiera co najmniej jeden ze szczepów bakteryjnych opisanych powyżej. Korzystnie kompozycja ta jest opracowana do podawania dopochwowego. Przedmiotem wynalazku jest również artykuł sanitarny do profilaktyki i/lub leczenia infekcji przewodu moczowo-płciowego, charakteryzujący się tym, że zawiera co najmniej jeden ze szczepów bakteryjnych opisanych powyżej. Korzystnie artykuł ten występuje w postaci tamponu. Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie co najmniej jednego ze szczepów bakteryjnych opisanych powyżej, do wytwarzania kompozycji albo artykułu sanitarnego do profilaktyki i/lub leczenia infekcji przewodu moczowo-płciowego.
PL 206 760 B 5 Korzystnie do profilaktyki i/lub leczenia bakteryjnego zapalenia pochwy albo jakiegokolwiek innego schorzenia bakteryjnego pochwy. Zgodnie z wynalazkiem opisano nowe, wyizolowane szczepy bakteryjne z rodzaju Lactobacillus i Pediococcus, które mają zdolność kolonizowania i trwałego zasiedlania ludzkiej pochwy po podaniu dopochwowym, nawet w czasie menstruacji, z co najmniej jednego ze szczepów bakteryjnych. Bakterie uważa się za trwale osiedlone jeśli bakterie są wciąż obecne w pochwie po co najmniej dwóch cyklach menstruacyjnych od czasu podania. Zalecane szczepy bakteryjne według wynalazku wykazują zdolność do trwałego zasiedlania w czasie menstruacji, ponieważ wtedy bakterie można łatwo podać przy użyciu np. tamponu impregnowanego wymienionymi bakteriami. Trwale osiedlone bakterie kwasu mlekowego wymienionych szczepów zapobiegają, łagodzą skutki i/lub leczą infekcję drobnoustrojową przewodu moczowo-płciowego, w szczególności bakteryjne zapalenie pochwy. Aby uzyskać ten efekt terapeutyczny, jest zasadnicze aby bakterie naprawdę trwale się osiedliły po podaniu, a więc, były ciągle obecne w pochwie nawet po kilku menstruacjach. Wymienione szczepy bakteryjne zdeponowano zgodnie z Traktatem Budapesztańskim w BC- CM/LMG (Belgijskie Skoordynowane Zbiory Drobnoustrojów, Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/Laboratorium voor Miorobiologie-Bacteriënberzammeling, Universiteit Gent) w Belgii, 4 czerwca 200 i obejmują szczep Lactobacillus gasseri, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 40, zdeponowany pod numerem LMG P-20560, szczep Lactobacillus casei, podgatunek rhamnosus, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 3, zdeponowany pod numerem LMG P-20562, szczep Lactobacillus fermentum, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 99, zdeponowany pod numerem LMG P-2056, szczep Lactobacillus crispatus, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 0, zdeponowany pod numerem LMG P-20558 oraz szczep Pediococcus acidilactici, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 23, zdeponowany pod numerem LMG P-20559 lub ich odmiany mające zasadniczo odpowiadające cechy fenotypowe. Ponadto, sposób izolowania szczepu bakteryjnego rodzaju Lactobacillus lub Pediococcus, mającego zdolność kolonizowania i trwałego zasiedlania ludzkiej pochwy, nawet podczas menstruacji, według wynalazku, obejmuje etapy, w których: a) próbkę bakteryjną, taką jak płyn pochwowy, pobiera się z przewodu pochwowego kobiety z normalną, zdrową florą drobnoustrojową, b) bakterie kwasu mlekowego izoluje się z próbki pochwowej z etapu a), c) bakterie kwasu mlekowego z etapu b), hoduje się w czystości, in vitro, w odpowiedniej pożywce ze składnikami odżywczymi, dostarczając co najmniej jeden wyizolowany szczep bakteryjny, d) co najmniej jeden hodowany w czystości szczep bakteryjny z etapu c) i/lub kombinację co najmniej dwóch szczepów bakteryjnych z etapu c) ocenia się pod względem zdolności do kolonizowania i trwałego zasiedlania pochwy po podaniu kobiecie dopochwowo szczepu bakteryjnego, podczas menstruacji, przy czym wymieniona kobieta wykazuje zaburzoną mikroflorę pochwy, gdzie wymieniony szczep lub szczepy bakteryjne są uważane za trwale osiedlone jeśli szczep lub szczepy bakteryjne są wciąż obecne w pochwie po co najmniej dwóch cyklach menstruacyjnych od czasu podania, oraz e) wybiera się co najmniej jeden szczep bakteryjny z etapu d), który wykazuje wymienioną zdolność do kolonizowania i trwałego zasiedlania pochwy. Korzystnie, co najmniej jeden, hodowany w czystości szczep bakteryjny z etapu c) i/lub kombinację co najmniej dwóch szczepów bakteryjnych z etapu c), liofilizuje się. Ponadto, ten/te szczep/szczepy korzystnie ocenia się i selekcjonuje pod względem stabilności żywotności bakterii w czasie liofilizacji oraz żywotności liofilizowanych bakterii przez długi okres przechowywania, przy czym wymieniona żywotność bakterii jest uważana za stabilną jeśli co najmniej 40% bakterii ma zachowaną żywotność podczas liofilizacji i przechowywania liofilizowanych bakterii w temperaturze około -8 C przez co najmniej 2 miesięcy. Poza tym, ten/te szczep/szczepy korzystnie ocenia się i selekcjonuje pod względem stabilności genetycznej w czasie powtarzanej hodowli oraz in vivo, po podaniu dopochwowym, przy czym wymienione bakterie uważa się za genetycznie stabilne jeśli ich profil genetyczny jest zabezpieczony in vivo przez co najmniej 2 miesięcy. Zgodnie z wynalazkiem opisano także szczep bakteryjny z rodzaju Lactobacillus lub Pediococcus, mający zdolność do kolonizowania i trwałego zasiedlania ludzkiej pochwy podczas menstruacji, który może być wyizolowany według wyżej opisanego sposobu. Takie szczepy bakteryjne stanowią szczep Lactobacillus gasseri, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 40, zdeponowany pod nume-
6 PL 206 760 B rem LMG P-20560, szczep Lactobacillus casei, podgatunek rhamnosus, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 3, zdeponowany pod numerem LMG P-20562, szczep Lactobacillus fermentum, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 99, zdeponowany pod numerem LMG P-2056, szczep Lactobacillus crispatus, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 0, zdeponowany pod numerem LMG P-20558 oraz szczep Pediococcus acidilactici, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 23, zdeponowany pod numerem LMG P-20559 lub ich odmiany mające zasadniczo odpowiadające cechy fenotypowe i/lub genotypowe. Poza tym, niniejszy wynalazek opisuje kompozycję do profilaktyki i/lub leczenia infekcji przewodu moczowo-płciowego, zawierającą co najmniej jeden z wymienionych szczepów bakteryjnych (LN 40, LN 3, LN 99, LN 0 i LN 23). Zalecana kompozycja zawiera wszystkie wymienione szczepy, to znaczy szczep LN 40, szczep LN 3, szczep LN 99, szczep LN 0 i szczep LN 23. Wiadomo w dziedzinie, że kombinacja różnych bakterii skraca czas generacji bakterii, czego efektem jest szybszy wzrost bakterii. Ponadto, ponieważ różne gatunki bakterii kwasu mlekowego mają różne wzory i cechy fermentacji, zalecane jest stosowanie kombinacji różnych gatunków bakterii. Kombinacja wszystkich wymienionych szczepów według wynalazku, to znaczy LN 40, LN 3, LN 99, LN 0 i LN 23, wykazuje jeszcze lepsze hamowanie patogenów układu moczowo-płciowego niż każdy z wymienionych szczepów pojedynczo. Kompozycję opracowuje się korzystnie do podawania dopochwowego, tak jak w postaci czopka, kapsułki, pigułki, tabletki, zawiesiny, sprayu, żelu, kremu, proszku lub każdej innej postaci wkładu dopochwowego. Poza tym, niniejszy wynalazek opisuje artykuł sanitarny, taki jak produkt chłonny dla kobiet (np. tampon, podkładka sanitarna, wkładka typu panty), podpaska i ochrona nietrzymania moczu, do profilaktyki i/lub leczenia infekcji przewodu moczowo-płciowego, zawierający co najmniej jeden z wymienionych szczepów (LN 40, LN 3, LN 99, LN 0 i LN 23). Zalecany artykuł sanitarny zawiera wszystkie wymienione szczepy, to znaczy szczep LN 40, szczep LN 3, szczep LN 99, szczep LN 0 i szczep LN 23 z tych samych powodów jakie podano powyżej, w związku z kompozycją. Artykułem sanitarnym jest korzystnie tampon. Ponadto, niniejszy wynalazek opisuje zastosowanie co najmniej jednego z wymienionych szczepów bakteryjnych (LN 40, LN 3, LN 99, LN 0 i LN 23) do wytwarzania kompozycji albo artykułu sanitarnego do profilaktyki i/lub leczenia infekcji przewodu moczowo-płciowego, korzystnie bakteryjnego zapalenia pochwy lub jakiegokolwiek innego schorzenia bakteryjnego w pochwie. Inne cechy i korzyści niniejszego wynalazku staną się oczywiste z następującego, szczegółowego opisu wynalazku. Krótki opis figur Fig. a i b ukazują proces wzrostu szczepów odpowiednio LN 40, LN 99, LN 3, i LN 23. Fig. 2 ukazuje obraz żelu z produktami specyficznymi dla szczepu, wytworzony z wykorzystaniem RAPD i elektroforezy w żelu. Szczepy odpowiednio LN 40, LN 99, 3LN, LN 0 i LN 23, porównuje się z typowymi szczepami odpowiadających gatunków bakterii. Fig. 3 i 4 ukazują układ doświadczenia wykorzystanego w przykładzie 6. Szczegółowy opis wynalazku Stosowane tu określenie bakterie kwasu mlekowego" oznacza bakterie, które poprzez fermentację wytwarzają kwas mlekowy. Stosowane tu określenie terapeutycznie skuteczna ilość" oznacza ilość, która będzie prowadzić do żądanego efektu terapeutycznego. Żądany efekt terapeutyczny oznacza profilaktykę i/lub leczenie infekcji przewodu moczowo- -płciowego, takiej jak bakteryjne zapalenie pochwy lub jakiekolwiek inne schorzenie bakteryjne pochwy. Stosowane tu określenie wyizolowany szczep bakteryjny" oznacza, że szczep może być hodowany in vitro w hodowli obejmującej wymieniony szczep. Stosowane tu określenie próbka bakteryjna" oznacza próbkę zawierającą bakterie. Próbką może być np. płyn/upław pochwowy. Stosowane tu określenie normalna, zdrowa flora drobnoustrojów pochwowych" oznacza, że kobieta nie uskarża się na dolegliwości pochwowe oraz że barwienie Grama próbki pochwowej
PL 206 760 B 7 daje całkowity wynik wynoszący 0-3 według metody przedstawionej przez Nugenta i innych (patrz przykład ). Stosowane tu określenie zaburzona flora drobnoustrojów pochwowych" oznacza, że kobieta uskarża się na pewne dolegliwości pochwowe, takie jak zwiększone upławy i/lub rybi" odór z pochwy. Ponadto, barwienie Grama próbki pochwowej daje całkowity wynik wynoszący co najmniej 4, w szczególności 7 według metody przedstawionej przez Nugenta i innych (patrz przykład ). Stosowane tu określenie odpowiednia pożywka ze składnikami odżywczymi" oznacza pożywkę, taką jak bulion LAB lub bulion MRS, w której można hodować bakterie. Stosowane tu określenie artykuł sanitarny" oznacza tampony (zarówno tampony palcowe, jak i tampony z aplikatorem), podkładki sanitarne, wkładki typu panty, podpaski, ochronę nietrzymania moczu i inne. Niniejszy wynalazek opisuje nowe, wyizolowane szczepy bakterii kwasu mlekowego z rodzaju Lactobacillus i Pediococcus, które mają zdolność kolonizowania i trwałego zasiedlania ludzkiej pochwy po podaniu dopochwowym, nawet w czasie menstruacji, co najmniej jednego ze szczepów bakteryjnych. Bakterie uważa się za trwale osiedlone jeśli bakterie są wciąż obecne w pochwie po co najmniej dwóch cyklach menstruacyjnych od czasu podania. Wymienione szczepy bakteryjne zostały złożone zgodnie z Traktatem Budapesztańskim w BCCM (Belgijskich Skoordynowanych Zbiorach Drobnoustrojów) w Belgii, 4 czerwca 200 i obejmują szczep Lactobacillus gasseri, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 40, zdeponowany pod numerem LMG P-20560, szczep Lactobacillus casei, podgatunek rhamnosus, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 3, zdeponowany pod numerem LMG P-20562, szczep Lactobacillus fermentum, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 99, zdeponowany pod numerem LMG P-2056, szczep Lactobacillus crispatus, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 0, zdeponowany pod numerem LMG P-20558 oraz szczep Pediococcus acidilactici, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 23, zdeponowany pod numerem LMG P-20559 lub ich odmiany mające zasadniczo odpowiadające cechy fenotypowe i/lub genotypowe. Ponadto, niniejszy wynalazek opisuje sposób izolowania szczepu bakteryjnego z rodzaju Lactobacillus lub Pediococcus, mającego zdolność kolonizowania i trwałego zasiedlania ludzkiej pochwy, przy czym obejmuje on etapy, w których a) próbkę bakteryjną, taką jak płyn pochwowy, pobiera się z przewodu pochwowego kobiety z normalną, zdrową florą drobnoustrojową pochwy, b) bakterie kwasu mlekowego izoluje się z próbki pochwowej z etapu a), c) bakterie kwasu mlekowego z etapu b), hoduje się w czystości, in vitro, w odpowiedniej pożywce ze składnikami odżywczymi, dostarczając co najmniej jeden wyizolowany szczep bakteryjny, d) co najmniej jeden hodowany w czystości szczep bakteryjny z etapu c) i/lub kombinację co najmniej dwóch szczepów bakteryjnych z etapu c) ocenia się pod względem zdolności do kolonizowania i trwałego zasiedlania pochwy po podaniu kobiecie dopochwowo szczepu bakteryjnego, podczas menstruacji, przy czym wymieniona kobieta wykazuje zaburzoną mikroflorę pochwy, gdzie wymieniony szczep lub szczepy bakteryjne są uważane za trwale osiedlone jeśli szczep lub szczepy bakteryjne są wciąż obecne w pochwie po co najmniej dwóch cyklach menstruacyjnych od czasu podania, oraz e) wybiera się co najmniej jeden szczep bakteryjny z etapu d), który wykazuje wymienioną zdolność do kolonizowania i trwałego zasiedlania pochwy. Korzystnie, co najmniej jeden, hodowany w czystości szczep bakteryjny z etapu c) i/lub kombinację co najmniej dwóch szczepów bakteryjnych z etapu c), liofilizuje się. Zasadnicza ilość bakterii powinna być żywa po liofilizacji, a następnie zachowywać żywotność w czasie przechowywania. Ponadto, zasadnicza ilość liofilizowanych bakterii opracowanych np. w postać kompozycji i/lub artykułów sanitarnych do sprzedaży rynkowej, powinna zachowywać żywotność w czasie przechowywania w temperaturze pokojowej. Tak więc, wymieniony szczep/szczepy korzystnie ocenia się i selekcjonuje pod względem stabilności żywotności bakterii w czasie liofilizacji oraz żywotności liofilizowanych bakterii przez długi okres przechowywania, przy czym wymienioną żywotność bakterii uważa się za stabilną jeśli co najmniej 40% bakterii ma zachowaną żywotność podczas liofilizacji i przechowywania liofilizowanych bakterii w temperaturze około -8 C przez co najmniej 2 miesięcy. Ponadto, co najmniej % liofilizowanych bakterii preparowanych w pewnego rodzaju macierzy zabezpieczającej, takiej jak olej, i zawartych w kompozycji i/lub artykule sanitarnym, powinna zachowywać żywotność przez co najmniej 2 miesięcy w temperaturze pokojowej.
8 PL 206 760 B Ponadto, istotną cechą jest stabilność bakteryjnego profilu genetycznego w czasie powtarzanej hodowli w produkcji na wielką skalę oraz podczas procesów produkcyjnych np. kompozycji i artykułów sanitarnych, bakterie powinny dogodnie zachowywać swój profil genetyczny i czasie hodowli powtarzanej co najmniej 0 razy. Ponadto, bakterie powinny wykazywać stabilność genetyczną in vivo przez dłuższy okres po podaniu, taki jak co najmniej 2 miesięcy. Tak więc, wymieniony szczep/szczepy ocenia się korzystnie i selekcjonuje pod względem stabilności genetycznej in vivo po podaniu dopochwowym, jeśli ich profil genetyczny jest zachowany in vivo przez co najmniej 2 miesięcy. Ponadto, wzrost bakterii i czas generacji jest także zasadniczy. Podane dopochwowo liofilizowane bakterie powinny rozpocząć wzrost w ciągu co najmniej 4 godzin od czasu podania. Czas generacji powinien być krótszy niż 2 godziny. Zgodnie z wynalazkiem opisano także szczep bakteryjny z rodzaju Lactobacillus lub Pedicoccus, mający zdolność kolonizacji i trwałego zasiedlania ludzkiej pochwy w czasie menstruacji, który można wyizolować zgodnie z wyżej opisanym sposobem. Takie szczepy bakteryjne to szczep Lactobacillus gasseri, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 40, zdeponowany pod numerem LMG P-20560, szczep Lactobacillus casei, podgatunek rhamnosus, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 3, zdeponowany pod numerem LMG P-20562, szczep Lactobacillus fermentum, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 99, zdeponowany pod numerem LMG P-2056, szczep Lactobacillus crispatus, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 0, zdeponowany pod numerem LMG P-20558 oraz szczep Pediococcus acidilactici, oznaczony przez zgłaszającego jako LN 23, zdeponowany pod numerem LMG P-20559 lub ich odmiany mające zasadniczo odpowiadające cechy fenotypowe i/lub genotypowe. Izolowanie i ocena szczepów Lactobacillus i Pediococcus Szczepy bakteryjne z rodzaju Lactobacillus i Pediococcus mające zdolność do kolonizowania i trwałego zasiedlania ludzkiej pochwy, wyizolowano zgodnie z następującymi etapami: - płyn pochwowy pobrano z przewodu pochwowego kobiety o normalnej, zdrowej mikroflorze pochwy, - bakterie kwasu mlekowego (około 25 różnych szczepów) wyselekcjonowano z płynu pochwowego przez umieszczenie wymazu wymienionego płynu na agarze MRS selektywnym pod względem bakterii kwasu mlekowego (pojedyncze kolonie zebrano i umieszczono na świeżym agarze MRS dla kontroli czystości), - bakterie kwasu mlekowego hodowano następnie w czystości in vitro, w odpowiedniej pożywce ze składnikami odżywczymi i w odpowiednich warunkach (ph, temperatura itd.) dostarczając wyizolowane szczepy bakteryjne, oraz - szczepy bakteryjne hodowane w czystości oceniano potem pod względem ich zdolności do kolonizowania i trwałego zasiedlania pochwy po podaniu dopochwowym szczepów bakteryjnych kobiecie w czasie menstruacji, przy czym wymieniona kobieta miała zaburzoną florę drobnoustrojów pochwy. LN 40 hodowano w czystości w bulionie LAB (ph około 6,5) mikroaerofilnym, w temperaturze około 37 C. LN 3 hodowano w czystości w bulionie MRS (ph około 6,5) mikroaerofilnym, w temperaturze około 37 C. LN 99 hodowano w czystości w bulionie LAB (ph około 6,5) mikroaerofiinym, w temperaturze około 37 C. LN 0 hodowano w czystości w bulionie MRS (ph około 6,5) beztlenowym, w temperaturze około 37 C. LN 23 hodowano w czystości w bulionie MRS (ph około 6,5) mikroaerofiinym, w temperaturze około 37 C. Szczepy bakteryjne hodowane w czystości oceniano najpierw ze względu na czas generacji. Te szczepy bakteryjne (około 5 różnych szczepów), które wykazywały czas generacji < 30 minut, wyselekcjonowano. Te wyselekcjonowane szczepy przesiewano na podstawie zdolności do hamowania wzrostu pewnych drobnoustrojów in vitro (dane nie ukazane). Po pierwsze, oceniono zdolność do hamowania wzrostu Staphylococcus epidermidis (dwa różne szczepy), Enterococcus cloace, Echerichia coli, Serratia marcesus, Micrococcus lysodeicticus i Candida albicans. 8 różnych szczepów bakteryjnych (7 szczepów z rodzaju Lactobacillus i szczep z rodzaju Pediococcus) wykazały tę zdolność, a więc zostały wyselekcjonowane. Te 8 szczepów oceniono dodatkowo pod względem zdolności do hamowania wzrostu patogenu przewodu moczowo-płciowego, Gardernella vaginalis. Najlep-
PL 206 760 B 9 szymi szczepami (to znaczy mającymi największą siłę kolonizowania zaburzonej flory drobnoustrojów pochwy) były LN 40, LN 3, LN 99, LN 0 i LN 23. Szczepy te oceniono dodatkowo za pomocą badań klinicznych, w których bakterie uznano za trwale osiedlone w pochwie jeśli bakterie były wciąż obecne w pochwie po co najmniej dwóch cyklach menstruacyjnych od czasu podania (podawanie bakterii rozpoczęło się w czasie pierwszej menstruacji). Te szczepy bakteryjne (LN 40, LN 3, LN 99, LN 0 i LN 23), które wykazały wymienioną zdolność do kolonizacji i trwałego zasiedlania pochwy, wyselekcjonowano. Dodatkowo, oceniano stabilność żywotności bakteryjnej podczas liofilizacji i żywotność liofilizowanych bakterii przez długi okres przechowywania (okres przydatności), zachowywanie profilu genetycznego w czasie powtarzanej hodowli oraz in vivo, i proces wzrostu bakterii. P r z y k ł a d : Kolonizacja i trwałe zasiedlanie bakterii kwasu mlekowego po podaniu dopochwowym Badano 5 pacjentek z BV (kobiet, które zdiagnozowano jako mające bakteryjne zapalenie pochwy). Wszystkie 5 pacjentek leczono globulkami klindamycyny (Dalacin, 2% globulki, firmy Pharmacia) przez 3 dni. Potem leczenie kontynuowano z częścią kontrolowaną przez podwójnie ślepe placebo, gdzie 6 pacjentek stosowało tampony zawierające około 0 3 cfu liofilizowanych bakterii ze szczepów LN 0, LN 23, LN 99, LN 3 i LN 40 w czasie pierwszej menstruacji po leczeniu antybiotykiem. Inne 9 pacjentek stosowało konwencjonalne tampony bez bakterii kwasu mlekowego. Podczas drugiego cyklu menstruacyjnego, wszystkie 5 pacjentek stosowało konwencjonalne tampony bez bakterii kwasu mlekowego i po kilku dniach po tej miesiączce pobrano od nich próbki pochwowe. Próbki pochwowe barwiono metodą Grama. W standaryzowanej metodzie Grama przedstawionej przez Nugent i innych, analizuje się obecność lub nieobecność pewnych morfotypów bakteryjnych. Morfotypami są wielkie, Gram-dodatnie laseczki o morfotypie Lactobacillus; mniejsze, różne pod względem barwienia Grama laseczki zwane morfotypem Gardnerella; oraz zakrzywione pałeczki (ang. curved rods). Organizmy występujące w płynie pochwowym ocenia się ilościowo i przenosi na zapis wyników (patrz tablica ). Kod T a b e l a Morfotyp Lactobacillus Morfotypy Gardnerella i Bacteroides Zakrzywione pałeczki Gram-zmienne Wynik 4 + 0 0 0 + + lub 2+ 3 + 2 + 3+ lub 4+ 2 2 + 3 + 3 + 4 + 4 0 Kody 0 do 4+ opierają się na średniej liczbie organizmów o tym morfotypie na polu immersji olejowej; +, < obecny; 2+, -4 obecnych; 3+, 5-30 obecnych; 4+, 30 obecnych. Całkowity wynik otrzymuje się poprzez zsumowanie wyników dla wszystkich trzech morfotypów. Całkowity wynik interpretuje się następująco: 0-3 normalny; 4-6 średni; i 7 BV. T a b e l a 2 Pacjentka nr Barwienie Grama przed początkiem badania Tampony (L = bakterie kwasu mlekowego) Barwienie Grama po drugiej menstruacji 2 3 4 7 L 0 2 8 L 0 3 9 7
0 PL 206 760 B cd. tabeli 2 2 3 4 4 5 4 5 0 0 6 8 4 7 8 L 0 8 9 4 9 4 L 0 0 8 4 8 4 2 8 0 3 8 L 4 0 5 5 9 L 0 Bakteryjne zapalenie pochwy nie zostało wykryte u 6 pacjentek, które stosowały tampon z bakteriami kwasu mlekowego. Ponadto, wyniki pokazują, że bakterie kwasu mlekowego były wciąż obecne w pochwie po drugim cyklu menstruacyjnym. Ponadto, wyniki te pokazują, że stosunkowo mała liczba podanych bakterii (około 0 3 cfu) była wystarczająca dla pełnej kolonizacji pochwy i trwałego zasiedlenia podczas menstruacji szczepów bakteryjnych według niniejszego wynalazku. Poza tym, szczepy bakteryjne według niniejszego wynalazku mają doskonałe właściwości przylegania do błon śluzowych pochwy. P r z y k ł a d 2: Kolonizacja i trwałe zasiedlanie bakterii kwasu mlekowego po podaniu dopochwowym Cztery zdrowe kobiety nie uskarżające się na dolegliwości pochwowe, stosowały tampony zawierające około 0 3 cfu liofilizowanych bakterii ze szczepów LN 0, LN 23, LN 99, LN 3 i LN 40 w czasie comiesięcznego krwawienia, w okresie 2-8 miesięcy. Próbki pochwowe od każdej kobiety oceniano po wymienionym okresie testowym. Szczepy Lactobacillus i Pediococcus znalezione w próbkach identyfikowano przy użyciu RAPD (losowo amplifikowany polimorficzny DNA) zgodnie z opisem w przykładzie 0. LN 0 i LN 3 zidentyfikowano w dwóch próbkach pochwowych od wymienionych kobiet. LN 40 zidentyfikowano w jednej próbce pochwowej od wymienionych kobiet. LN 23 i LN 99 nie zidentyfikowano w żadnej próbce pochwowej od wymienionych kobiet. Wytłumaczeniem tych wyników może być to, że gdy wymienione bakterie podaje się kobiecie wykazującej zdrową florę pochwy, z normalnym ph pochwy, LN 23 nie będą rosnąć w sposób zasadniczy. Jednak gdy wymienione bakterie podaje się kobiecie wykazującej zaburzoną florę bakteryjną pochwy, LN 23 będzie początkowo zasiedlać i zapewniać dogodne środowisko dla wzrostu innych szczepów bakteryjnych (LN 0, LN 3, LN 40 i LN 99). Należy także zauważyć, że istnieją indywidualne różnice pod względem dopasowania konkretnego szczepu i/lub specyficznej kombinacji szczepów, zasiedlających i rosnących w kobiecej pochwie. W każdej próbce pochwowej zidentyfikowano co najmniej jeden ze szczepów bakteryjnych według wynalazku. P r z y k ł a d 3: Stabilność żywotności w czasie liofilizacji i przez długi okres przechowywania (okres przydatności) dla szczepów bakteryjnych LN 40, LN 3, LN 99 i LN 23 Liofilizowane szczepy bakteryjne LN 40, LN 3, LN 99 i LN 23 oceniano ze względu na stabilność żywotności przez dłuższy okres przechowywania (to znaczy okres przydatności) w temperaturze -8 C.
PL 206 760 B T a b e l a 3 Czas po liofilizacji [miesiące] Żywotne bakterie [cfu/g] LN 40 LN 3 LN 99 LN 23 LN 0 0 83x0 9 224x0 0 33x0 9 290x0 9 20x0 9 2 47x0 9 (~57%) 92x0 0 (~86%) 4x0 9 (~42%) 272x0 9 (~94%) 9x0 9 (~95%) 78 22x0 9 (~27%) 46x0 9 (~2%) 6 x 0 9 (~8%) 55x0 9 (~53%) 2 x 0 9 (~0%) Wyniki przedstawione w tabeli 3 pokazują, że co najmniej 40% bakterii jest wciąż żywych po 2 miesiącach w temperaturze -8 C. Ponadto, co najmniej około 0-20% bakterii jest wciąż żywych po 78 miesiącach w temperaturze -8%. Poza tym, bakterie te analizowano także według API 50CH i wyniki otrzymane z tej analizy wskazywały, że szczepy LN 40, LN 3, LN 99, LN 23 i LN 0 zachowują swój profil genetyczny przez co najmniej 78 miesięcy podczas przechowywania w postaci liofilizowanej w temperaturze - 8 C. Liofilizowane bakterie (LN 40, LN 3, LN 99 i LN 23) rozproszono w Akosoft 36 (firmy Karlshamns AB) i oceniano pod względem stabilności żywotności przez dłuższy okres przechowywania (to znaczy okres przydatności) w temperaturze około 8 C i 22 C, odpowiednio. Czas po sporządzeniu [tygodnie/miesiące] T a b e l a 4 Żywe bakterie [cfu/g] + 8 C + 22 C 0 3,5 x 0 0 3,5 x 0 0 tydzień 2,7 x 0 0 (~75%),9 x 0 0 (~53%) 2,5 x 0 0 (~7%),3 x 0 0 (~37%) 3,5 2,0 x 0 0 (~55%) 6 x 0 9 (~7%) 6 2,4 x 0 0 (~68%) 3,9 x 0 9 (~%) 9 2,8 x 0 0 (~50%),7 x 0 0 (~49%),0 x 0 9 (~2,8%),3 x 0 9 (~3,7%) Wyniki przedstawione w tablicy 4 pokazują, że około 45-50% bakterii było wciąż żywych po 2 miesiącach w temperaturze 8 C. Ponadto, około 4% bakterii było wciąż żywych po 2 miesiącach w temperaturze pokojowej, to znaczy 22 C. Podobne wyniki otrzymano dla zbioru bakterii liofilizowanych obejmującego wszystkie szczepy bakteryjne według wynalazku, łącznie z LN 0. P r z y k ł a d 4: Zachowywanie profilu genetycznego w czasie powtarzanej hodowli, dla szczepów bakteryjnych LN 40, LN 3, LN 99, LN 0 i LN 23 Szczepy bakteryjne (LN 40, LN 3, LN 99, LN 0 i LN 23) hodowano w sposób powtarzany 0 razy i następnie oceniano za pomocą API 50CH. Wzór fermentacji każdego szczepu bakteryjnego (patrz przykład 9) był zachowywany po powtarzanej hodowli. Tak więc, wyniki wskazują, że wymienione szczepy bakteryjne zachowują swój profil genetyczny przy powtarzanej hodowli. P r z y k ł a d 5: Proces wzrostu bakterii dla szczepów bakteryjnych LN 40, LN 99, LN 3, LN 23 i LN 0 Aby zapewnić wymieniony żądany efekt terapeutyczny, podawane dopochwowo liofilizowane bakterie powinny rozpocząć wzrost w pochwie w ciągu co najmniej 4 godzin od czasu podania. Absorbancję (gęstość optyczna, OD) mierzono przy 620 nm dla bakterii liofilizowanych (LN 40, LN 99, LN 3, LN 23 i LN 0) dodanych do wyjałowionego bulionu MRS. Przeprowadzono dwa rodzaje doświadczeń (patrz fig. a i b):
2 PL 206 760 B a) 0,0 g liofilizowanych bakterii dodano do 3 ml bulionu MRS, i 00 μl tej dyspersji rozcieńczano 3 ml dodatkowego buliony MRS, i b) liofilizowane bakterie dodano do bulionu MRS w ilości, która dała w efekcie absorbancję wynoszącą około 0,00. Kuwetki zawierające powyższe dyspersje bakteryjne umieszczono w temperaturze 37 C i mierzono absorbancję co 5 minut przez 0,5 godziny. Jak widać w fig. a i b wzrost bakterii dla każdego szczepu bakteryjnego (LN 40, LN 99, LN 3, LN 23 i LN 0, odpowiednio) jest szybki i wszystkie szczepy bakteryjne rozpoczynają wzrost w ciągu co najmniej 2 godzin. Ponadto, czas generacji każdego szczepu bakteryjnego wynosi około 20-25 minut. Tak więc, bakterie rosną szybciej niż patogeny przewodu moczowo-płciowego, co jest bardzo pożądane z punktu widzenia niniejszym opisanego zastosowania bakterii. Poza tym, wiadomo w dziedzinie, że kombinacja różnych bakterii może skrócić czas generacji bakterii, czego efektem jest jeszcze szybszy wzrost bakterii. Ponadto, ponieważ różne gatunki bakterii kwasu mlekowego mają różne wzory i cechy fermentacji, zalecane jest stosowanie kombinacji różnych gatunków bakterii. Należy zauważyć, że kombinacja liofilizowanych LN 40, LN 99, LN 3, LN 23 i LN 0 zaczyna rosnąć w ciągu,5 godziny, a więc co najmniej 25% szybciej niż czas konieczny dla każdego szczepu bakterii. P r z y k ł a d 6: Zdolność do hamowania wzrostu patogenów przewodu moczowo-płciowego Celem tego przykładu jest wykazanie, że zbiór bakterii LN 40, LN 99, LN 3, LN 23 i LN 0 jest jeszcze skuteczniejszy pod względem hamowania wzrostu patogenów przewodu moczowo-płciowego, niż każdy szczep bakterii z osobna. Testowane bakterie kwasu mlekowego dodano jednorodnie do stopionej, jałowej, buforowanej pożywki agarowej, takiej jak agar MRS. Otrzymaną mieszaninę wylano na płytkę Petriego (Ø 90 mm) i płytkę przechylano w taki sposób, że mieszanina agaru 2 osiągnęła jedynie około mm od spodu płytki z jednej strony i około mm z przeciwnej strony płytki, jak ukazano w fig. 3. Patogen układu moczowo-płciowego dodano jednorodnie do stopionej, jałowej, buforowanej pożywki agarowej, takiej jak agar VRB (Violet Red Bile). Mieszaninę tę wylano na wierzch powyżej opisanego zestalonego agaru, zawierającego bakterie kwasu mlekowego, jak ukazano w fig. 3 i tę mieszaninę agarową 3 także pozostawiono do zestalenia. Bakterie kwasu mlekowego i patogeny układu moczowo-płciowego inkubowano potem w temperaturze 37 C przez około 24 godziny. Widoczne były potem dwie odmienne strefy, 4 i 5, w płytce powyżej, jak ukazano w fig. 4. W pierwszej strefie 4, patogen układu moczowo-płciowego był zdolny do wzrostu. W drugiej strefie 5, bakterie kwasu mlekowego zahamowały wzrost patogenu układu moczowo-płciowego. Zdolność bakterii kwasu mlekowego do hamowania patogenu układu moczowo-płciowego można ocenić ilościowo poprzez pomiar długości L drugiej strefy 5, to znaczy strefy zahamowanego wzrostu 5. W tym doświadczeniu wykorzystano patogenny szczep jelitowy E. coli (EPEC). Długość L strefy zahamowania wzrostu była w zakresie wynoszącym od 8 do 22 mm dla każdego szczepu bakterii LN 40, LN 3, LN 99, LN 0 i LN 23. Jednakże zbiór bakterii obejmujących LN 40, LN 3, LN 99, LN 0 i LN 23 miał długość L strefy zahamowanego wzrostu wynoszącą 32-34 mm. Tak więc, zbiór bakterii obejmujący wszystkie szczepy bakterii LN 40, LN 3, LN 99, LN 0 i LN 23 jest skuteczniejszy, niż każdy szczep bakteryjny z osobna pod względem hamowania wzrostu patogenów układu moczowo-płciowego, takich jak E. coli. Skutkiem tego, zalecane jest stosowanie kombinacji wymienionych szczepów bakterii według wynalazku. Charakteryzacja szczepów bakteryjnych LN 40, LN 3, LN 99, LN 0 i LN 23. Bakterie charakteryzowano metodami zarówno fenotypowymi jak i genotypowymi. P r z y k ł a d 7: Charakteryzacja mikrobiologiczna szczepów bakteryjnych LN 40, LN 3, LN 99, LN 0 i LN 23 Szczepy (LN 40, LN 3, LN 99, LN 23 i LN 0) charakteryzowano ze względu na morfologię komórkową, barwienie Grama, reakcję oksydazy i katalazy.
PL 206 760 B 3 Szczep LN 40 obejmował Gram-dodatnie, ujemne pod względem katalazy, ujemne pod względem oksydazy, nieprzetrwalnikujące bakterie o kształcie pałeczki (około 0,9 μm x 3-0 μm), które występowały jako pojedyncze komórki lub parami. Szczep LN 99 obejmował Gram-dodatnie, ujemne pod względem katalazy, ujemne pod względem oksydazy, nieprzetrwalnikujące bakterie o kształcie pałeczki (około 0,9 μm x,5-2,0 μm), które występowały jako pojedyncze komórki. Szczep LN 3 obejmował Gram-dodatnie, ujemne pod względem katalazy, ujemne pod względem oksydazy, nieprzetrwalnikujące bakterie o kształcie pałeczki (około 0,9 μm x 2 μm), które występowały jako pojedyncze komórki lub parami. Szczep LN 0 obejmował Gram-dodatnie, ujemne pod względem katalazy, ujemne pod względem oksydazy, nieprzetrwalnikujące bakterie o kształcie prostej lub lekko zakrzywionej pałeczki (około 0,8-,6 μm x 2,3- μm), które występowały jako pojedyncze komórki lub w łańcuchach. Szczep LN 23 obejmował Gram-dodatnie, ujemne pod względem katalazy, ujemne pod względem oksydazy, nieprzetrwalnikujące bakterie o kształcie okrągłym (Ø około μm), które występowały jako pojedyncze komórki lub parami. P r z y k ł a d 8: Analiza SDS-PAGE i ugrupowań szczepów bakterii LN 40, LN 3, LN 99, LN 0 i LN 23 Hodowle hodowano na agarze MRS (Oxoid CM36) przez 24 godziny w temperaturze 37 C w warunkach beztlenowych. Przygotowanie ekstraktów komórkowych oraz elektroforezę białka w żelu (SDS-PAGE) przeprowadzono w BCCM /LMG w zgodzie z protokołem ustalonym przez Grupę Badawczą Laboratorium Mikrobiologicznego, Uniwesytet Ghent (Pot, B, Vandamme, P, Kersters, K, analysis of electrophoretic whole-organism protein fingerprints, Chemical Methods in Prokaryotic Systematic, M, Goodfellow i A G 0'Donell (wydawcy), J Wiley & Sons, Chichester (994)). Znormalizowane i przekształcone w cyfrowe wzory białkowe analizowano numerycznie i pogrupowano w odniesieniu do profili referencyjnych w bazie danych BCCM (grudzień 999) dla LN 40, LN 3, LN 99 i LN 23. LN 0 analizowano i grupowano w odniesieniu do profili referencyjnych w bazie danych CCUG (styczeń 200). Szczep LN 40 jak się okazało, należy do gatunku Lactobacillus johnsonii lub Lactobacillus gasseri. Szczep LN 99 jak się okazało, należy do gatunku Lactobacillus fermentum. Szczep LN 3 jak się okazało, należy do gatunku Lactobacillus casei, podgatunku rhamnosus. Szczep LN 23 jak się okazało, należy do gatunku Pediococcus acidilactici. Szczep LN 0 jak się okazało, należy do gatunku Lactobacillus crispatus. P r z y k ł a d 9: Charakteryzacja szczepów bakteryjnych LN 40, LN 3, LN 99, LN 23 i LN 0 przy użyciu API 50CH oraz rapid ID32 strep Zdolność szczepów (LN 40, LN 3, LN 99, LN 23 i LN 0) do fermentowania różnych węglowodanów jest ukazana w tabeli 5. Testy przeprowadzono za pomocą API 50CH i testu rapid ID32 strep, w temperaturze 37 C, zgodnie z instrukcjami producenta. Dla tych wyników, które różnią się między API 50CH i rapid ID32 strep, wyniki API 50CH uważa się za pewniejsze. Bazy danych CCUG przeszukiwano pod względem otrzymanych wzorów fermentacji. Najwyższy wynik bazy danych uzyskany dla każdego szczepu potwierdził wyniki z wyżej opisanej analizy (analizy SDS-PAGE/ugrupowania) pod względem poszczególnych gatunków bakterii, do jakich wymienione szczepy należą. Ponadto, reakcja z ramnozą potwierdziła, że szczep LN 3 należy do gatunku Lactobacillus casei, podgatunek rhamnosus. Jednakże, porównania między odpowiednio LN 40, LN 99, LN 3, LN 23 i LN 0 oraz typowymi szczepami z każdego z gatunków bakterii (CCUG 345 T, CCUG 3038 T, CCUG 2452 T, CCUG 32235 T i CCUG 447 T, odpowiednio) wykazały istotne różnice dla wszystkich szczepów (LN 40, LN 99, LN 3, LN 23 i LN 0) ze względu na wzory fermentacji. W tabeli 5, oznacza, że nie wystąpiła reakcja, 2 oznacza wystąpienie nieznacznej reakcji, 3 oznacza wystąpienie reakcji, 4 oznacza wystąpienie silnej reakcji i 5 oznacza wystąpienie bardzo silnej reakcji.
4 PL 206 760 B T a b e l a 5 API 50CH LN 40 LN 99 LN 3 LN 23 LN 0 2 3 4 5 6 Kontrola Glicerol Erytritol D-arabinoza L-arabinoza 5 Ryboza 5 5 5 D-ksyloza 5 5 L-ksyloza Adonitol β-metylo-d-ksylozyd Galaktoza 4 5 5 5 3 Glukoza 5 5 5 5 5 Fruktoza 5 4 5 5 5 Mannoza 4 3 5 5 4 Sorboza 5 Ramnoza 3 Dulcytol Inozytol 3 Mannitol 5 Sorbitol 5 α-metylo-d-mannozyd α-metylolo-d-glukozyd 5 N-acetyloglukozamina 5 4 4 3 Amigdalina 3 4 2 3 Arbutyna 4 4 3 Eskulina 5 5 5 3 Salicyna 2 4 4 3 Cellobioza 5 5 5 3 Maltoza 5 4 3 5 Laktoza 3 4 5 3
PL 206 760 B 5 cd. tabeli 5 2 3 4 5 6 Melibioza 5 4 Sacharoza 5 4 3 5 Trehaloza 4 5 3 Inulina Melezytoza 5 D-rafinoza 5 4 3 Skrobia 4 Glikogen! 4 Ksylitol β-genetiobioza 4 3 3 2 D-turanoza 5 3 D-liksoza 3 D-tagaroza 2 5 4 D-fukoza L-fukoza D-arabitol L-arabitol Glukonian 3 2 2-ketoglukonian 5-ketoglukonian API rapid ld32s Dihydrolaza argininowa 5 5 β-glukozydaza 5 5 3 β-galaktozydaza () 5 5 β-glukuronidaza α-galaktozydaza 5 3 Fosfataza alkaliczna 2 Ryboza 5 5 Mannitol 5 Sorbitol
6 PL 206 760 B cd. tabeli 5 2 3 4 5 6 Laktoza 5 Trehaloza 5 5 3 Raflnoza 5 2 Acetoina 5 5 5 5 Arylamidaza alanina fenyloalanina-prolina 5 4 3 5 β-galaktozydaza (2) 5 5 5 Piroglutaminian 4 5 5 N-acetylo-β-glukozamina Glicylotnptofan 2 Hipuran Glikogen Pululan 5 4 Maltoza Melibioza Melezytoza 2 5 5 2 5 Sacharoza L-arabinoza D-arabitol 5 5 5 Metylo-β-Dglukopiranozyd Tagatoza β-mannozydaza 2 3 3 Cyklodekstryna Ureaza Hemoliza 3 3 3 3 P r z y k ł a d 0: Charakteryzacja szczepów bakteryjnych LN 40, LN 3, LN 99, LN 23 i LN 0 przy użyciu Random Amplified Polymorfic DNA. Ponadto, szczepy bakteryjne analizowano za pomocą RAPD (losowo amplifikowanego polimorficznego DNA, ang. Random Amplified Polymorfic DNA). Technika ta jest opisana np. przez Willians, J G, i innych. Nucl Acids Res, 8: 653 (990) i była wcześniej stosowana nie tylko do wykrywania odmienności szczepów, lecz także do mapowania genowego, analiz populacji, epidemiologii i do analizy związków taksonomicznych i filogenetycznych (Welsh, J i inni, PCR 2: A Practical Approach, McPherson, M J Hames, B D i Taylor, G R, wydawcy, rozdział, IRL Press (995). Odtwarzalne układy produktów specyficznych dla szczepu wytworzono przy użyciu krótkiego startera oligonukleotydowego (5'ACGCGCAAC 3') w warunkach niskiej surowości PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy, ang. Polimerase Chain Reaction). Powstałe układy analizowano potem za pomocą elektroforezy w żelu i porównywano z typowymi szczepami każdego gatunku bakterii, który poddano takiemu samemu traktowaniu. Wyniki tej analizy są omówione w fig. 2. Tor oznacza L fermentum, ATCC 493 T, tor 2 oznacza LN 99, tor 3 oznacza L crispatus, CCUG 447 T, tor 4 oznacza LN 0, tor 5 oznacza marker masy cząsteczkowej 00 pz. tor 6 oznacza LN 23, tor 7 oznacza LN 40, tor 8 oznacza L gasseri, ATCC 9992 T,