PL B1. BIFODAN A/S, Hundested, DK , DK, PA , US, 60/366,847

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/DK03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO03/ (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 1/20 ( ) C12R 1/225 ( ) A61L 15/36 ( ) A61K 35/74 ( ) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Kompozycja farmaceutyczna, szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01 oraz szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01 w połączeniu ze szczepem Lactobacillus acidophilus Lba EB01, produkt chłonny zawierający tę kompozycję oraz produkt nabiałowy, produkt nutraceutyczny i czynnościowy produkt żywnościowy zawierające ten szczep albo te dwa szczepy, a także zastosowanie tego szczepu albo tych dwóch szczepów (30) Pierwszeństwo: , DK, PA , US, 60/366,847 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 15/05 (73) Uprawniony z patentu: BIFODAN A/S, Hundested, DK (72) Twórca(y) wynalazku: GUNNAR BRØNDSTAD, Snåsa, NO ERIK BRANDSBORG, Holbæk, DK (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 11/12 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Zofia Sulima

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są kompozycja farmaceutyczna, szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01 oraz szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01 w połączeniu ze szczepem Lactobacillus acidophilus Lba EB01. Przedmiotem wynalazku są ponadto produkt chłonny zawierający tę kompozycję oraz produkt nabiałowy, produkt nutraceutyczny i czynnościowy produkt żywnościowy zawierające ten szczep albo te dwa szczepy, a także zastosowanie tego szczepu albo tych dwóch szczepów. Nowe szczepy Lactobacillus mogą być stosowane same lub w połączeniu jako probiotyki albo wraz z prebiotykiem jako synbiotyk. Szczepy te mogą być stosowane w kompozycjach farmaceutycznych, produktach nabiałowych, czynnościowych produktach żywnościowych, nutraceutykach i produktach higieny osobistej, będąc użytecznymi w profilaktyce i leczeniu zakażeń pochwy, zakażeń układu moczowo-płciowego i chorób żołądkowo-jelitowych. Probiotyki są żywymi drobnoustrojami lub mieszaninami drobnoustrojów, podawanymi w celu poprawy równowagi drobnoustrojów u pacjenta, szczególnie w środowisku przewodu pokarmowego i pochwy. Szczepy Lactobacillus były wykorzystywane do leczenia zakażeń pochwy, zapobiegania biegunce oraz do leczenia zakażeń układu moczowo-płciowego (Am. J. Health Syst. Pharm. 2001, 58 (12): str ). Prawidłowa flora pochwy jest zdominowana przez gatunki Lactobacillus, które wytwarzają substancje pomagające kontrolować wzrost patogenów. Waginoza bakteryjna (BV) jest stanem klinicznym, dla którego charakterystyczne jest zmniejszenie zawartości gatunków Lactobacillus i zwiększony wzrost bakterii beztlenowych i mykoplazm. Waginozę bakteryjną wiązano z rozwojem zapalnej choroby miednicy i przedwczesnym porodem. Wyniki niektórych badań sugerowały, że pacjentki z waginozą bakteryjną mogą mieć wyższe ryzyko zachorowania na choroby przenoszone drogą płciową (STD), obejmujące zakażenie wirusem ludzkiego niedoboru odporności (HIV) (Curr Infeet Dis Rep 2001 kwiecień; 3(2) ; J Infeet Dis 2002 styczeń 1; 185(1):69-73). Podając probiotyk zawierający Lactobacilli można doprowadzić do regeneracji flory pochwy u kobiet z nawracającymi epizodami waginozy bakteryjnej. Waginoza bakteryjna jest jednym z najczęstszych kobiecych problemów ginekologicznych. Zakażenie pochwy spowodowane Candida albicans jest także częstym kobiecym problemem ginekologicznym. Obecność Lactobacilli jest ważna dla utrzymania jelitowego ekosystemu drobnoustrojów. Stwierdzono, ze Lactobacilli wykazują hamujący wpływ na wzrost patogennych bakterii, takich jak Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella spp i inne. To hamowanie może być wynikiem wytwarzania hamujących związków, takich jak kwasy organiczne, nadtlenek wodoru, bakteriocyny lub reuteryna albo konkurencyjnego przylegania do nabłonka (App. Environ. Microbiol, 1999, 65 (11) str ). Badano także Lactobacilli jako lek na zakażenia dróg moczowych (Am. J. Health Syst. Pharm. 2001, 58 (12): str ). Przykładowo wykorzystywano podawanie Lactobacillus i pobudzenie miejscowych organizmów w celu zapobiegania nawrotowi zakażeń dróg moczowych (Microecol. Ther. :32-45). Badano także rolę Lactobacilli w zapobieganiu zakażeniom układu moczowo-płciowego i zakażeniom jelit (Intl. Dairy J : ). Znaczenie Lactobacilli jako probiotyków zostało opisane w literaturze. Jacobsen i in., Applied and Environmental Microbiology, (1999) 65, , ujawniają badanie przesiewowe aktywności probiotycznej 47 szczepów Lactobacillus przy użyciu technik in vitro oraz ocenę zdolności do kolonizacji w organizmie człowieka 5 wybranych szczepów. Szczepy badano pod kątem odporności na ph 2,5 i 0,3% żółć bydlęcą, przyleganie do komórek Caco-2 oraz aktywność przeciwdrobnoustrojową przeciw bakteriom enteropatogennym. Średnia liczba przylegających Lactobacilli w 20 polach widzenia pod mikroskopem wynosiła na przykład 630 ± 275 dla L. Rhamnosus LGG i 713 ± 188 dla L. Rhamnosus W US ujawniono terapeutycznie korzystne szczepy L. acidophilus, a zwłaszcza szczep, dla którego charakterystyczne jest to, że średnio co najmniej 50 bakterii przylega do jednej komórki błony śluzowej ludzkiego jelita cienkiego po pięciu minutach inkubacji bakterii z komórką. Szczep scharakteryzowano także pod kątem wytwarzania kwasu mlekowego i silnego wzrostu. W WO 99/45099 ujawniono nowy szczep L. plantarum LB 931. Szczep ten można stosować do leczenia lub zapobiegania zakażeniom układu moczowo-płciowego. Szczep ten wykazuje zdolność do

3 PL B1 3 dobrego przylegania do komórek nabłonka pochwy oraz do hamowania lub zapobiegania wzrostowi różnych szczepów bakteryjnych. US dotyczy Lactobacillus, mleka odtłuszczonego, czynnika wzrostu Lactobacillus (LGF) i kompozycji Lactobacillus oraz sposobów wykorzystania kompozycji do zapobiegania zakażeniom układu moczowo-płciowego. W szczególności opisany wynalazek dotyczy zdolności hydrofobowych lub hydrofilowych szczepów Lactobacillus do przylegania do biomateriałów i komórek jelita, pochwy i nabłonka układu moczowego w celu oparcia się działaniu niektórych środków przeciwdrobnoustrojowych i dominacji flory układu moczowo-płciowego. W przypadku L. casei var. rhamnosus GR-1 stwierdzono, że średnio co najmniej 64 bakterie mogą przylegać do jednej komórki nabłonka układu moczowego, podczas gdy w przypadku L. fermentum B-54 średnio co najmniej 39 bakterii mogło przylegać do jednej komórki nabłonka układu moczowego. W US (WO 98/46261) ujawniono nowe szczepy, np. L. crispatus CTV-05, izolowane z wymazów z pochwy. Dla tego szczepu charakterystyczna jest zwiększona zdolność przylegania do komórek nabłonka pochwy i wytwarzania nadtlenku wodoru. Stwierdzono, że L. crispatus CTV-05 mają procentową wartość kohezji wobec komórek nabłonka pochwy (VEC) wyższą od 50%. Procentowa wartość kohezji wobec VEC jest zdefiniowana jako procent VEC, do których przylega co najmniej jedna komórka Lactobacillus spośród wszystkich komórek VEC w określonej grupie. Zdolność tych szczepów do rekolonizacji jest przypisywana nowej macierzy konserwującej, ujawnionej w tym dokumencie. W EP ujawniono zastosowanie różnych szczepów Lactobacillus, oddzielnie albo w połączeniu. Szczepy wybrano w oparciu o ich zdolność do przylegania do komórek HeLa i do wytwarzania nadtlenku wodoru. W WO 97/29762 ujawniono kompozycje zawierające skuteczną ilość co najmniej jednego gatunku rośliny z rodziny Ericaceae lub wyciągu z tej rośliny i hodowlę co najmniej jednego gatunku mikrokapsułkowanych bakterii, wybranych z grupy obejmującej Lactobacillus, Bifidobacterium i ich mieszaniny. Kompozycja jest użyteczna do zapobiegania i/lub leczenia zaburzeń układu moczowo- -płciowego i jelitowych. W Ocaña i in., Biocell (2001) 25(3), , badano zdolność Lactobacilli do przylegania do komórek nabłonka pochwy (VEC). Z wymazów z ludzkiej pochwy wyizolowano Lactobacilli, L. crispatus CRL 1266, L. salivarius podgat. salivarius CRL 1328, L. acidophilus CRL 1259, L. acidophilus CRL W McLean, N.W. i in., J. Med. Microbiol., 2000, 49 (6) str , scharakteryzowano różne Lactobacilli w celu oceny ich potencjalnego zastosowania jako probiotyków, badając ich zdolność do przylegania do komórek nabłonka pochwy (VEC). Lactobacilli wyizolowano z wymazów z ludzkiej pochwy. Znane w farmacji kompozycje farmaceutyczne Lactobacilli nie są wystarczająco skuteczne w rekolonizacji w warunkach in vivo, tj. w ekosystemach drobnoustrojów u ssaka, i dlatego istnieje zapotrzebowanie na uzyskanie Lactobacilli wykazujących samoistną zdolność do rekolonizacji po podaniu Lactobacilli w postaci kompozycji farmaceutycznej, nutraceutyku, produktu nabiałowego, czynnościowego produktu żywnościowego lub produktu chłonnego. Lactobacilli wyizolowane z ludzkich źródeł będą wykazywały najlepszą zdolność do rekolonizacji w warunkach in vivo po ich podaniu, ze względu na ich naturalną zdolność do przetrwania w ekosystemie drobnoustrojów u ludzi. Często identyfikacja szczepów Lactobacilli wykazujących zwiększone zdolności do rekolonizacji po ich podaniu jest trudnym procesem, a zatem ważne jest wybranie najlepszych układów badawczych dla przewidzenia ich zdolności do rekolonizacji w warunkach in vivo. Stwierdzono, że zdolność Lactobacilli do przylegania do komórek nabłonka pochwy (VEC), komórek Caco-2 w hodowli lub innych linii komórkowych jest ważnym czynnikiem i służy jako narzędzie do oceny zdolności probiotycznego szczepu do rekolonizacji i uczestniczenia w tworzeniu bariery chroniącej przed kolonizacją bakterii patogennych. Wydaje się, że w literaturze istnieje duża zmienność opisywanego przylegania probiotycznych szczepów w warunkach in vitro. Ta zmienność w rzeczywistości odzwierciedla różnice biologiczne między szczepami, ale z pewnością zależy także od warunków eksperymentalnych. Ponadto wydaje się, że istnieje zmienność pod względem sposobów pomiaru przylegania. W US przyleganie Lactobacilli jest określane przez obliczenie procentowej wartości kohezji wobec komórek nabłonka pochwy (VEC). Procentowa wartość kohezji wobec VEC jest zdefiniowana jako procent VEC, do których przylega co najmniej jedna komórka Lactobacillus spośród wszystkich komórek VEC w określonej grupie. Innym narzędziem do pomiaru przylegania w warunkach in vitro jest obliczenie średniej liczby przylegających komórek drobnoustrojów do wcześniej określonej liczby komórek nabłonka

4 4 PL B1 w barwionym preparacie. Według wynalazców pierwszy sposób jest lepszy niż drugi, gdyż bardziej dokładnie odzwierciedla przyleganie w warunkach in vivo. Można argumentować, że eksperyment w warunkach in vitro jedynie służy jako sposób na oszacowanie zdolności w warunkach in vivo do kolonizacji przez przyleganie do komórek nabłonka, na przykład pochwy. Dlatego sposób, w jaki obliczane jest przyleganie, niekoniecznie jest najważniejszym czynnikiem, ale raczej bardzo ważne jest porównanie potencjalnych szczepów probiotycznych z dobrze scharakteryzowanym probiotycznym szczepem bakteryjnym, o którym wiadomo, że przylega do błony śluzowej. W US ujawniono szczep Lactobacilli, dla którego charakterystyczne jest to, że średnio co najmniej 50 bakterii może przylegać do jednej komórki ludzkiej błony śluzowej jelita cienkiego, jednakże nie porównano szczepu Lactobacilli z dobrze scharakteryzowanymi bakteriami probiotycznymi. Lactobacillus casei GG jest przykładem dostępnego w sprzedaży, dobrze scharakteryzowanego szczepu probiotycznego, który może być stosowany do porównania przy poszukiwaniu skutecznych szczepów probiotycznych. Poza badaniem przylegania Lactobacilli do złuszczonych komórek nabłonka pochwy (VEC), komórek Caco-2 w hodowli lub innych rodzajów linii komórkowych, bardzo ważne jest scharakteryzowanie wykazywanego przez Lactobacilli działania hamującego w warunkach in vitro wobec gatunków bakterii, np. bakterii beztlenowych i mykoplazm, biorących udział w bakteryjnej waginozie, wytwarzania kwasu po wzroście Lactobacilli w płynnej hodowli i wytwarzania nadtlenku wodoru (H 2 O 2 ). Ważne jest zmierzenie wytwarzania nadtlenku wodoru, ponieważ w warunkach in vivo nadtlenek wodoru będzie wspomagał wyniszczanie bakterii i mykoplazm niewytwarzających nadtlenku wodoru. Zatem szczepy Lactobacilli o właściwościach probiotycznych powinny mieć zdolność przylegania do komórek nabłonka pochwy (VEC) i innych odpowiednich komórek, takich jak komórki linii komórkowej Caco-2. Ponadto jest także pożądane, aby szczepy Lactobacilli o właściwościach probiotycznych wykazywały w warunkach in vitro działanie hamujące wobec innych gatunków bakterii, wytwarzały kwas po wzroście w płynnej hodowli i/lub wytwarzały nadtlenek wodoru. Istniało zapotrzebowanie na preparaty farmaceutyczne lub produkty chłonne zawierające odpowiednie probiotyczne szczepy Lactobacilli, wykazujące pożądane właściwości omówione powyżej, w szczególności szczep Lactobacillus acidophilus Lba EB01 (EB01), szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01 (PB01), szczep Lactobacillus acidophilus Lba EB02 (EB02), szczep Lactobacillus plantarum Lbpl PB02 (PB02), szczep Lactobacillus Lbxx EB03 (EB03) i szczep Lactobacillus Lbxx PB03 (PB03) oraz szczepy o zasadniczo takich samych korzystnych właściwościach, np. wykazujących zdolność kolonizacji przez przyleganie do błon śluzowych, które są zatem odpowiednie do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu zakażeń pochwy, zakażeń dróg moczowych i chorób żołądkowo-jelitowych. Istniało również zapotrzebowanie na preparaty farmaceutyczne wykazujące polepszoną zdolność do kolonizacji błony śluzowej przez wykorzystanie substancji pomocniczych przylegających do błon śluzowych. W szczególności istniało zapotrzebowanie na preparaty dopochwowe wykazujące polepszoną zdolność hamowania wzrostu Candida albicans i Gram ujemnych bakterii patogennych. Ponadto istniało zapotrzebowanie na produkty nabiałowe, produkty nutraceutyczne i czynnościowe produkty żywnościowe zawierających jeden lub większą liczbę wyżej wymienionych szczepów. Wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, charakteryzującej się tym, że zawiera szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01 (DSM 14870) wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub rozcieńczalnikiem. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku ponadto zawiera dodatkowy szczep Lactobacillus. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna jako dodatkowy szczep zawiera szczep Lactobacillus acidophilus Lba EB01 (DSM 14869). Korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawiera cfu/g Lactobacillus. Korzystniej kompozycja farmaceutyczna zawiera cfu/g Lactobacillus. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawiera co najmniej 10 5 cfu/g któregokolwiek z tych szczepów Lactobacillus. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna jest w postaci zawiesiny, aerozolu, żelu, kremu, proszku, kapsułki, roztworu do płukania, owulek, wkładki dopochwowej, tabletek lub mikrokapsułkowanego produktu. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawiera do 10% zaróbki przylegającej do błony śluzowej. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna jako zaróbkę przylegającą do błony śluzowej zawiera hydrokoloid.

5 PL B1 5 Korzystnie kompozycja farmaceutyczna zawiera hydrokoloid wybrany z grupy obejmującej gumę ksantanową, mączkę chleba świętojańskiego i alginian. Szczególnie korzystnie kompozycja farmaceutyczna jako hydrokoloid zawiera gumę ksantanową. Wynalazek dotyczy również szczepu Lactobacilluss paracasei Lbp PB01 (DSM 14870). Wynalazek dotyczy także szczepu Lactobacillus paracasei Lbp PB01 (DSM 14870) w połączeniu ze szczepem Lactobacillus acidophilus Lba EB01 (DSM 14869). Korzystnie kompozycja farmaceutyczna jest w postaci kompozycji dopochwowej zawierającej ponadto substrat dla tych szczepów Lactobacillus. Korzystna jest kompozycja dopochwowa, charakteryzująca się tym, że substrat nie jest fermentowany przez Candida albicans ani przez gram ujemne bakterie patogenne. Korzystnie ta kompozycja jako substrat zawiera oligosacharyd. Korzystnie ta kompozycja jako substrat zawiera laktitol i/lub oligofruktoza i/lub laktulozę. Szczególnie korzystnie ta kompozycja jako substrat zawiera laktitol. Wynalazek dotyczy ponadto produktu chłonnego, takiego jak kobieca wkładka higieniczna, podpaska higieniczna, impregnowany tampon, osłona majtek lub osłona przed nietrzymaniem moczu, charakteryzującego się tym, że zawiera kompozycję zdefiniowaną powyżej. Wynalazek dotyczy również produktu nabiałowego, charakteryzującego się tym, że zawiera szczep zdefiniowany powyżej albo dwa szczepy zdefiniowane powyżej. Wynalazek dotyczy także produktu nutraceutycznego, charakteryzującego się tym, że zawiera szczep zdefiniowany powyżej albo dwa szczepy zdefiniowane powyżej. Wynalazek dotyczy ponadto czynnościowego produktu żywnościowego, charakteryzującego się tym, że zawiera szczep zdefiniowany powyżej albo dwa szczepy zdefiniowane powyżej. Wynalazek dotyczy również zastosowania szczepu zdefiniowanego powyżej albo dwóch szczepów zdefiniowanych powyżej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i/lub leczenia zakażeń pochwy, chorób żołądkowo-jelitowych lub zakażeń dróg moczowych. Wynalazek dotyczy także zastosowania szczepu zdefiniowanego powyżej albo dwóch szczepów zdefiniowanych powyżej do wytwarzania produktu chłonnego, takiego jak kobieca wkładka higieniczna, podpaska higieniczna, osłona majtek lub osłona przed nietrzymaniem moczu do zapobiegania i/lub leczenia zakażeń pochwy. Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania szczepu zdefiniowanego powyżej albo dwóch szczepów zdefiniowanych powyżej do wytwarzania produktu nabiałowego do zapobiegania i/lub leczenia chorób żołądkowo-jelitowych. Wynalazek dotyczy również zastosowania szczepu zdefiniowanego powyżej albo dwóch szczepów zdefiniowanych powyżej do wytwarzania czynnościowego produktu żywnościowego do zapobiegania lub leczenia chorób żołądkowo-jelitowych. Wynalazek dotyczy także zastosowania szczepu zdefiniowanego powyżej albo dwóch szczepów zdefiniowanych powyżej do wytwarzania produktu nutraceutycznego do zapobiegania lub leczenia chorób żołądkowo-jelitowych. Poniżej podano definicje określeń stosowanych w opisie. Określenie substancja pomocnicza oznacza każdy nieczynny składnik, który jest dodawany i tworzy część ostatecznego preparatu. Określenie probiotyk oznacza dodatek w postaci żywych drobnoustrojów, który ma korzystny wpływ na pacjenta poprzez działanie w przewodzie pokarmowym, drogach moczowych lub pochwie. Określenie prebiotyk w znaczeniu użytym w niniejszym opisie oznacza substrat, który wywiera korzystny wpływ na probiotyk, a wraz z tym na konkretnego pacjenta przyjmującego probiotyk. Określenie pacjent w znaczeniu użytym w niniejszym opisie oznacza osobnika chorującego na dowolny stan kliniczny związany z nierównowagą drobnoustrojów oraz osobę stosującą preparaty bakteryjne profilaktycznie. Określenie produkt synbiotyczny oznacza połączenie probiotyku i prebiotyku, które wykazują synergistyczny korzystny wpływ na pacjenta. Określenie silny wzrost oznacza, że bakterie cechuje doskonały wzrost. Określenie cfu oznacza jednostkę tworzącą kolonię. Wynalazek dotyczący probiotycznych szczepów Lactobacilli zdolnych do regeneracji flory w warunkach in vivo u człowieka, będzie bardziej zrozumiały na podstawie poniższego szczegółowego opisu. W jednej z postaci wynalazek dotyczy szczepu Lactobacillus paracasei Lbp PBQ1, samego albo w połączeniu ze szczepem Lactobacillus acidophilus Lba EB01.

6 6 PL B1 Konkretne przykłady szczepu Lactobacillus acidophilus Lba EB01 i szczepu Lactobacillus paracasei Lbp PB01 zostały zdeponowane w DSMZ - Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh, MascheroderWeg 1b, D Braunschweig, Niemcy, i mają następujące numery dostępu: Lactobacillus acidophilus Lba EB01; DSM i Lactobacillus paracasei Lbp PB01; DSM Data zdeponowania szczepu Lactobacillus acidophilus EB01 i szczepu Lactobacillus paracasei PB01 to 18 marca W kompozycjach według wynalazku można stosować także probiotyczne szczepy Lactobacillus o zasadniczo takich samych właściwościach. Konkretne przykłady szczepu Lactobacillus acidophilus Lba EB02, szczepu Lactobacillus plantarum Lbpl PB02, szczepu Lactobacillus Lbxx EB03 i szczepu Lactobacillus Lbxx PB03 zostały zdeponowane w DSMZ - Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh, MascheroderWeg 1b, D-38124, Niemcy. Data zdeponowania szczepu Lactobacillus acidophilus Lba EB02, szczepu Lactobacillus plantarum Lbpl PB02, szczepu Lactobacillus Lbxx EB03 i szczepu Lactobacillus Lbxx PB03 to 20 marca Szczepy otrzymały następujące numery dostępu: Szczep Lactobacillus acidophilus Lba EB02,... Szczep Lactobacillus plantarum Lbpl PB02,... Szczep Lactobacillus Lbxx EB03... Szczep Lactobacillus Lbxx PB03... Szczepy Lactobacillus mają następujące właściwości; Szczep Lactobacillus acidophilus Lba EB01 Co najmniej 20% dodanych bakterii przylega do hodowli komórek Caco-2 w czasie jednogodzinnego okresu inkubacji. Przyleganie do komórek nabłonka pochwy (VEC) wynosi co najmniej 15 bakterii na komórkę. Szczep wytwarza nadtlenek wodoru. Szczep wytwarza kwas mlekowy w warunkach in vitro i wykazuje silny wzrost w warunkach in vitro. Szczep wykazuje odporność na żółć. Szczep wykazuje odporność na kwasy. Szczep wytwarza naturalną substancję antybiotykową w postaci bakteriocyny. Szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01 Co najmniej 30% dodanych bakterii przylegało do hodowli komórek Caco-2 w czasie jednogodzinnego okresu inkubacji. Przyleganie do komórek nabłonka pochwy (VEC) wynosi co najmniej 20 bakterii na komórkę. Szczep wytwarza kwas mlekowy w warunkach in vitro i wykazuje silny wzrost w warunkach in vitro. Szczep wykazuje odporność na żółć. Szczep wykazuje odporność na kwasy. Szczep wytwarza naturalną substancję antybiotykową w postaci bakteriocyn. Szczep wykazuje silne działanie hamujące wobec Gardnerella. Szczep Lactobacillus acidophilus Lba EB02 Bakterie przylegają do hodowli komórek Caco-2 w czasie jednogodzinnego okresu inkubacji. Bakterie przylegają do komórek nabłonka pochwy (VEC). Szczep wytwarza nadtlenek wodoru. Szczep wytwarza kwas mlekowy w warunkach in vitro i wykazuje silny wzrost w warunkach in vitro. Szczep wykazuje odporność na żółć. Szczep wykazuje odporność na kwasy. Szczep wytwarza naturalną substancję antybiotykową w postaci bakteriocyn. Szczep Lactobacillus plantarum Lbpl PB02 Bakterie przylegają do hodowli komórek Caco-2 w czasie jednogodzinnego okresu inkubacji. Bakterie przylegają do komórek nabłonka pochwy (VEC). Szczep wytwarza nadtlenek wodoru. Szczep wytwarza kwas mlekowy w warunkach in vitro i wykazuje silny wzrost w warunkach in vitro. Szczep wykazuje odporność na żółć. Szczep wykazuje odporność na kwasy. Szczep wytwarza naturalną substancję antybiotykową w postaci bakteriocyny. Szczep Lactobacillus Lbxx EB03 Co najmniej 12% dodanych bakterii przylega do hodowli komórek Caco-2 w czasie jednogodzinnego okresu inkubacji.

7 PL B1 7 Bakterie przylegają do komórek nabłonka pochwy (VEC). Szczep wytwarza kwas mlekowy w warunkach in vitro i wykazuje silny wzrost w warunkach in vitro. Szczep wykazuje odporność na żółć. Szczep wykazuje odporność na kwasy. Szczep wytwarza naturalną substancję antybiotykową w postaci bakteriocyn. Szczep Lactobacillus Lbxx PB03 Co najmniej 11% dodanych bakterii przylega do hodowli komórek Caco-2 w czasie jednogodzinnego okresu inkubacji. Bakterie przylegają do komórek nabłonka pochwy (VEC). Szczep wytwarza kwas mlekowy w warunkach in vitro i wykazuje silny wzrost w warunkach in vitro. Szczep wykazuje odporność na żółć. Szczep wykazuje odporność na kwasy. Szczep wytwarza naturalną substancję antybiotykową w postaci bakteriocyn. Określenie probiotyczny szczep Lactobacillus o zasadniczo takich samych właściwościach oznacza dowolny szczep, który wykazuje takie same właściwości przylegania jak wymienione wyżej dla szczepu Lactobacillus acidophilus Lba EB01, szczepu Lactobacillus paracasei Lbp PB01, szczepu Lactobacillus acidophilus Lba EB02, szczepu Lactobacillus plantarum Lbpl PB02, szczepu Lactobacillus Lbxx EB03 i szczepu Lactobacillus Lbxx PB03, korzystnie dla szczepu Lactobacillus acidophilus Lba EB01, szczepu Lactobacillus paracasei Lbp PB01, szczepu Lactobacillus Lbxx EB03 i szczepu Lactobacillus Lbxx PB03, korzystniej szczepu Lactobacillus acidophilus Lba EB01 i szczepu Lactobacillus paracasei Lbp PB01. Aby określić rodzaj i gatunek szczepów ujawnionych w opisie wykorzystano system charakteryzacji drobnoustrojów Riboprinter. Ilość i skład szczepów zidentyfikowano i określono przy użyciu chomatografii gazowej. Ponadto przeprowadzono także identyfikację API szczepów. Właściwości przylegania izolowanych szczepów porównano z dobrze scharakteryzowanym probiotycznym szczepem Lactobacillus casei GG. Niemalże 30% dodanych bakterii szczepu Lactobacillus paracasei PB01 przylegało do hodowli komórek Caco-2 w czasie 1-godzinnego okresu inkubacji, w porównaniu z około 20% bakterii szczepu Lactobacillus acidophilus EB01 i około 10% Lactobacillus GG. Szczep Lactobacillus paracasei PB01 przylega najsilniej do VEC: około 20 bakterii na komórkę po 1-godzinnym okresie inkubacji. Lactobacillus GG cechuje się najniższą liczbą przylegających bakterii, podczas gdy szczep EB01 wykazuje pośrednie wartości. Przyleganie tych trzech szczepów bakterii do hodowli komórek Caco-2 dobrze korelowało z ich przyleganiem do VEC. Stwierdzono, że szczep Lactobacillus acidophilus Lba EB02 i szczep Lactobacillus plantarum Lbpl PB02 przylega do hodowli komórek Caco-2 w czasie jednogodzinnego okresu inkubacji. Co najmniej 12% dodanych bakterii szczepu Lactobacillus Lbxx EB03 przylega do hodowli komórek Caco-2 w czasie jednogodzinnego okresu inkubacji, podczas gdy co najmniej 11% dodanych bakterii szczepu Lactobacillus Lbxx EB03 przylega do hodowli komórek Caco-2 w czasie jednogodzinnego okresu inkubacji. Dlatego wszystkie szczepy miały zdolność przylegania do komórek Caco-2. Szczepy EB03 i PB03 wykazywały lepsze właściwości przylegania niż Lactobacillus casei GG. Stwierdzono, że szczepy wytwarzają kwas mlekowy w warunkach in vitro i wykazują silny wzrost w warunkach in vitro oraz wykazują odporność na kwasy i żółć; ponadto oba szczepy były zdolne do wytwarzania naturalnej substancji antybiotykowej, bakteriocyny. Szczepy EB02 i PB02 wykazywały bardzo silną zdolność do wytwarzania H 2 O 2 i kwasu mlekowego. Szczep Lactobacillus paracasei PB01 wykazywał silne działanie hamujące wobec gatunków bakterii Gardnerella vaginalis związanych z BV. Szczep EB01 wytwarza H 2 O 2. Połączenie tych dwóch szczepów jest bardzo odpowiednie jako dopochwowy produkt probiotyczny dzięki ich wzajemnie uzupełniającym się działaniom. Dodatkowo potwierdza to obserwacja, że oba izolaty wytwarzają wysoce kwaśne środowisko po hodowli w płynnej pożywce i oba silnie przylegają do VEC i hodowli komórek Caco-2. Wynik ten także wskazuje, że sam szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01 lub sam szczep EB01, w połączeniu lub razem ze szczepem Lactobacillus acidophilus szczep Lba EB02, szczepem Lactobacillus plantarum Lbpl PB02, szczepem Lactobacillus Lbxx EB03 i szczepem Lactobacillus Lbxx PB03 są odpowiednie dla innych dróg podawania. Szczepy Lactobacillus według wynalazku są odpowiednie do stosowania leczniczego w zapobieganiu lub leczeniu zakażeń pochwy, zakażeń układu moczowo-płciowego lub zakażeń żołądkowo- -jelitowych.

8 8 PL B1 Lecznicze działanie probiotycznych szczepów Lactobacillus w leczeniu zakażeń pochwy ocenia się określając florę pochwy przy użyciu systemu charakteryzacji drobnoustrojów Riboprinter. System charakteryzacji drobnoustrojów Riboprinter używa się do określenia rodzaju i gatunku drobnoustroju. Pacjenta uważa się za wyleczonego, jeżeli flora pochwy jest określona jako prawidłowa przy użyciu systemu charakteryzacji drobnoustrojów Riboprinter. Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01, i ewentualnie dodatkowy szczep Lactobacillus, korzystnie Lactobacillus acidophiius Lba EB01, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i/lub rozcieńczalnik. Szczepy bakterii są formułowane w preparaty farmaceutyczne w celu umożliwienia łatwego podawania szczepów probiotycznych i dowolnymi sposobami znanymi fachowcowi w tej dziedzinie. Korzystnie probiotyczne bakterie wykorzystywane w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku są stosowane przy stężeniu bakterii wynoszącym 10 5 do cfu Lactobacillus na gram, korzystniej 10 6 do cfu Lactobacillus na gram, przy czym skrót cfu oznacza jednostkę tworzącą kolonię. Może być to jeden ze szczepów lub ich połączenie. Korzystnie bakterie probiotyczne wykorzystywane zgodnie z wynalazkiem są stosowane bezpośrednio lub korzystniej w postaci liofilizowanej. Do zastosowania praktycznego kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są wytwarzane w postaci zawiesiny, aerozolu, żelu, kremu, proszku, kapsułki, roztworu do płukania, owulek, wkładek dopochwowych, tabletek lub mikrokapsułkowanego produktu, zawierających zaróbki i formułowanych technikami znanymi fachowcom w tej dziedzinie. W celu zwiększenia zdolności preparatu farmaceutycznego do przylegania do błony śluzowej, mogą być dodawane zarobki przylegające do błony śluzowej, tak że stanowią maksymalnie około 10% preparatu farmaceutycznego. Korzystną zaróbką przylegającą do błony śluzowej jest hydrokoloid, korzystniej hydrokoloid jest wybrany z grupy obejmującej gumę ksantanową, mączkę chleba świętojańskiego, alginian a najkorzystniej hydrokoloidem jest guma ksantanowa. Candida albicans nie są zdolne do przeprowadzania fermentacji laktitolu; podobnie może być z E. coli lub innymi bakteriami gram ujemnymi. Dlatego substrat prebiotyczny, który nie jest fermentowany przez Candida albicans ani przez patogenne bakterie, stosuje się w preparatach dopochwowych zawierających probiotyczne szczepy Lactobacilli, stosowane według wynalazku w celu zahamowania wzrostu Candida albicans. Prebiotycznym substratem jest korzystnie oligosacharyd, korzystniej substratem jest laktitol, oligofruktoza lub laktuloza, najkorzystniej substratem jest laktitol. Produkt chłonny według wynalazku zawiera opisane szczepy probiotycznych Lactobacilli czyli kompozycję według wynalazku. Szczepy bakteryjne zawarte są w produktach chłonnych dla umożliwienia dogodnego podawania szczepów probiotycznych w czasie stosowania produktu chłonnego. Do praktycznego stosowania produkt chłonny według wynalazku stanowi kobieca wkładka higieniczna, podpaska higieniczna, impregnowany tampon, osłona majtek i osłona przed nietrzymaniem moczu, zawierające opisane szczepy Lactobacillus czyli kompozycję według wynalazku. Korzystnie probiotyczne bakterie wykorzystywane w produkcie chłonnym są stosowane przy stężeniach bakterii wynoszących 10 5 do cfu Lactobacillus, korzystniej 10 6 do cfu Lactobacillus. Produkty nabiałowe według wynalazku zawierają szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01, sam albo w połączeniu z Lactobacillus acidophilus Lba EB01; szczepy bakteryjne są umieszczone w produktach nabiałowych, które umożliwiają podawanie doustne szczepów probiotycznych w leczeniu lub zapobieganiu chorobom żołądkowo-jelitowym. Przykładami produktu nabiałowego jest łagodny jogurt, który jest szczególnie odpowiedni, wraz z nowymi probiotycznymi szczepami (sfermentowanym mlekiem), zsiadłym mlekiem i pełnym mlekiem. Produkty nutraceutyczne według wynalazku zawierają szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01, sam albo w połączeniu z Lactobacillus acidophiius Lba EB01; szczepy bakteryjne są umieszczone w produktach nutraceutycznych, które umożliwiają podawanie doustne szczepów probiotycznych w leczeniu lub zapobieganiu chorobom żołądkowo-jelitowym. Przykładami produktów nutraceutycznych są produkty stosowane do wzbogacenia diety, wywierające korzystny wpływ na zdrowie. Czynnościowe produkty żywnościowe według wynalazku zawierają szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01, sam albo w połączeniu z Lactobacillus acidophilus Lba EB01; szczepy bakteryjne są umieszczone w czynnościowych produktach żywnościowych, które umożliwiają podawanie doustne szczepów probiotycznych w leczeniu lub zapobieganiu chorobom żołądkowo-jelitowym. Przykładami czynnościowych produktów żywnościowych są produkty liofilizowane i produkty mikrokapsułkowane w celu ich łatwego rozprowadzenia na produktach żywnościowych.

9 PL B1 9 Zgodnie z wynalazkiem szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01, sam albo w połączeniu z Lactobacillus acidophiius Lba EB01, jest stosowany do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do zapobiegania i/lub leczenia zakażeń pochwy, chorób żołądkowo-jelitowych lub zakażeń dróg moczowych. Szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01, sam albo w połączeniu z Lactobacillus acidophiius Lba EB01, jest stosowany również do wytwarzania produktu chłonnego, takiego jak kobieca wkładka higieniczna, podpaska higieniczna, osłona majtek lub osłona przed nietrzymaniem moczu do zapobiegania i/lub leczenia zakażeń pochwy. Szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01, sam albo w połączeniu z Lactobacillus acidophiius Lba EB 01, jest stosowany także do wytwarzania produktów nabiałowych do zapobiegania i/lub leczenia chorób żołądkowo-jelitowych. Szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01, sam lub w połączeniu z Lactobacillus acidophiius Lba EB01, jest stosowany ponadto do wytwarzania czynnościowych produktów żywnościowych do zapobiegania i/lub leczenia chorób żołądkowo-jelitowych. Szczep Lactobacillus paracasei Lbp PB01, sam albo w połączeniu z Lactobacillus acidophiius Lba EB01, jest stosowany do wytwarzania nutraceutyków do zapobiegania chorobom żołądkowo- -jelitowym. Schemat stosowania tych różnych produktów w leczeniu będzie zależał od konkretnego produktu i pacjenta, co jest znane fachowcom w tej dziedzinie. Przykładem schematu leczenia dla kapsułek dopochwowych jest jedna kapsułka dopochwowa dwa razy na dobę przez siedem dni. W celu zapewnienia bakteriom optymalnych warunków początkowego wzrostu i w ten sposób umożliwienia bakteriom rekolonizacji przez przyleganie w warunkach in vivo, ważne jest umieszczenie w preparacie substratu, tj. swoistej odżywczej pożywki wzrostowej dla bakterii. Substrat będzie pełnił rolę czynnościowego prebiotyku, który wraz z probiotykiem wywiera synergistycznie korzystny wpływ na pacjenta, tj. prebiotyk i probiotyk wywierają symbiotyczne działanie. Przykładem takiego substratu jest laktoza; jednakże laktoza jest także substratem dla patogenu Candida albicans i gram ujemnych patogennych bakterii. Dlatego odpowiednie może być dostarczenie preparatu bakteryjnego z substratem, który nie stanowi substratu dla Candida albicans. Dlatego zgodnie z wynalazkiem dostarczane są preparaty dopochwowe, zawierające szczepy bakteryjne wykazujące zdolność kolonizacji pochwy i substrat, który nie jest fermentowany przez Candida albicans. Korzystnie substratem jest oligosacharyd, korzystniej substratem jest laktitol, oligofruktoza i/lub laktuloza, najkorzystniej substratem jest laktitol. Badano wpływ laktitolu na przyleganie szczepu Lactobacillus acidophiius Lba EB01 i szczepu Lactobacillus paracasei Lbp PB01 do linii komórkowej HEp-2 i linii komórkowej WEHI w warunkach in vitro. Stwierdzono, że laktitol nie wpływa na ogólną zdolność szczepów bakteryjnych do przylegania do komórek i w ten sposób nie wpłynie na przyleganie w warunkach in vivo. W korzystnej postaci wynalazku do wytwarzania preparatu dopochwowego zawierającego bakterie w celu zahamowania wzrostu Candida albicans stosowany jest substrat, który nie jest lub nie jest z łatwością fermentowany przez Candida albicans lub przez patogenne bakterie gram ujemne; substratem korzystnie jest oligosacharyd, korzystniej substratem jest laktitol, oligofruktoza i/lub laktuloza a najkorzystniej substratem jest laktitol. Szczepy bakteryjne w postaci np. kapsułek można stosować jako urządzenia medyczne w celu otrzymania stabilnego ekosystemu drobnoustrojów u ssaka w warunkach in vivo. Poniższe przykłady należy interpretować w odniesieniu do figur rysunku opisanych poniżej. Fig. 1 Przyleganie szczepu Lactobacillus acidophiius EB01, szczepu Lactobacillus paracasei PB01 i Lactobacillus casei GG do hodowli komórek Caco-2. Obliczono liczbę związanych bakterii i przedstawiono w postaci średniego procentowego przylegania ± odchylenie standardowe (SD). Fig. 2 Przyleganie szczepu Lactobacillus acidophiius EB01, szczepu Lactobacillus paracasei PB01 i Lactobacillus casei GG do izolowanych komórek nabłonka pochwy. Obliczono liczbę związanych bakterii i przedstawiono w postaci średniego procentowego przylegania ± SD. Fig. 3 Korelacja między przyleganiem do komórek VEC i komórek Caco-2. Rysunek ten opiera się na danych z fig. 1 i fig. 2. Wynalazek ilustrują poniższe przykłady. P r z y k ł a d 1 Izolacja szczepów bakteryjnych

10 10 PL B1 Dwa szczepy Lactobacillus, oznaczone jako Lactobacillus acidophiius Lba EB01 i Lactobacillus paracasei Lbp PB01, wyizolowano z komórek nabłonka pochwy uzyskanych od zdrowych ludzkich dawców i zdeponowano w DSMZ. Lactobacillus acidophiius Lba EB01 otrzymał następujący numer dostępu: DSM a Lactobacillus paracasei Lbp PB01 otrzymał następujący numer dostępu: DSM Data zdeponowania to 18 marca 2002 roku. Cztery szczepy Lactobacillus, oznaczone jako szczep Lactobacillus acidophiius Lba EB02, szczep Lactobacillus plantarum Lbpl PB02, szczep Lactobacillus Lbxx EB03 i szczep Lactobacillus Lbxx PB03, wyizolowano z komórek nabłonka pochwy uzyskanych od zdrowych ludzkich dawców i zdeponowano w DSMZ. Data zdeponowania to 20 marca 2003 roku. Lactobacillus casei GG, probiotyk dostępny w sprzedaży, uzyskano z Valio (Finlandia). Powyższe szczepy hodowano w warunkach beztlenowych w bulionie Man, Rogosa i Sharpe (Merck) w temperaturze 37 C. W celu wyznakowania znacznikiem promieniotwórczym 40 μl 3 H-adeniny dodawano do 20 ml bulionu i inkubowano przez godzin a nadmiar znacznika promieniotwórczego usuwano przez dwukrotne płukanie i wirowanie bakterii. Bakterie stosowane w oznaczeniu VEC nie były znakowane znacznikiem promieniotwórczym, ale poza tym były traktowane jak wyżej. W celu modyfikacji stężeń bakterii posługiwano się gęstością optyczną hodowli bakteryjnych przy długości fali 600 nm, jak podano w literaturze. P r z y k ł a d 2 Przyleganie probiotycznych szczepów do VEC Przy użyciu tego testu badano przyleganie probiotycznych szczepów Lactobacillus do VEC. VEC uzyskano w czasie badania ginekologicznego i umieszczano w jałowej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w ph 7,2. Po około 20 godzinach do komórek dodawano gentamycynę i płodową surowicę bydlęcą. Ostateczne stężenia wynosiły 100 μg/ml gentamycyny i 2% surowicy. Następnie komórki przechowywano przez kolejne 24 godziny w temperaturze 4 C. Przed oznaczeniem przylegania komórki płukano dwukrotnie przy użyciu buforu PBS z 2% surowicą. Wypłukane probiotyczne szczepy przeprowadzono w zawiesinę w 10 mm mleczanie i 150 mm buforowanym NaCl przy ph 4,5 i gęstość optyczną doprowadzano do 1,00 ± 0,03. Zawiesinę bakteryjną mieszano w stosunku 1:1 z zawiesiną VEC i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37 C. Po inkubacji komórki płukano 4-krotnie przy użyciu buforu PBS z 2% płodową surowicą bydlęcą i ostatecznie płukano jednokrotnie przy użyciu czystego PBS. Po ostatnim wirowaniu peletkę komórek przeprowadzono w zawiesinę w kilku μl buforu i przenoszono na szkiełka mikroskopowe. Komórki następnie suszono w temperaturze 90 C. Wysuszoną plamę utrwalano w metanolu i bawiono 0,1% fioletem krystalicznym. Wybarwiony preparat badano przy użyciu mikroskopu świetlnego z immersją olejową pod powiększeniem 100x. Liczbę bakterii oceniano na losowo wybranych komórkach/dawcę. Wyniki przedstawione na fig. 2 pokazują przyleganie trzech szczepów do VEC. Wartości oznaczają średnią ± SD (odchylenie standardowe) z 5 dawców. Szczep EB01 przylega najsilniej, przy około 20 bakteriach na komórkę po 1-godzinnej inkubacji. Lactobacillus GG wykazuje najniższą liczbę przylegających bakterii, podczas gdy szczep EB01 wykazuje pośrednie wartości. P r z y k ł a d 3 Przyleganie probiotycznych szczepów do hodowli komórek Caco-2. Przy użyciu tego testu badano przyleganie probiotycznych szczepów Lactobacillus do Caco-2. Linię komórkową Caco-2 (CRL-2102, ATCC, USA) hodowano w pożywce Eagle według modyfikacji Dulbecco (Sigma-Aldrich) z 4 mm L-glutaminą, dostosowanym tak, że zawierało 4,5 g/l glukozy, 1,5 g/l wodorowęglanu sodu, 1,0 mm pirogronianu sodu (Sigma-Aldrich), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (Merck) i 1% penicylinę/streptomycynę (Merck), w temperaturze 37 C w atmosferze 5% CO 2 /95% powietrza. W celu oznaczenia przylegania komórki Caco-2 wysiewano w stężeniu 1,5 x 10 5 w 96-studzienkowych płytkach do mikromianowania. Hodowle komórek utrzymywano przez 2 tygodnie przed użyciem. Pożywkę do hodowli komórek zmieniano co drugi dzień i zmieniano 2 godziny przed oznaczeniem przylegania. Przyleganie szczepów bakteryjnych do hodowli komórek Caco-2 badano przez dodanie 200 μl znakowanej znacznikiem promieniotwórczym zawiesiny bakteryjnej do studzienek. Przed dodaniem bakterii studzienki płukano dwukrotnie pożywką MEM-Eagle (Sigma-Aldrich), wzbogaconą 0,5% FBS, 1% L-glutaminą i 0,1% endogennych aminokwasów. Po inkubacji przez 1 godzinę hodowle komórek płukano czterokrotnie 250 μl buforowanego roztworu soli fizjologicznej w Multiwash Plus AR (Labsystems)

11 PL B1 11 i traktowano 150 μl 2% SDS w 0,01 M NaOH przez 20 minut w celu rozpuszczenia bakterii, które mierzono zliczając ciekłą scyntylację. Obliczano odsetek przylegania (%) porównując radioaktywność z oryginalną zawiesiną bakteryjną. Dane przedstawione na fig. 1 pokazują przyleganie trzech probiotycznych szczepów do hodowli komórek Caco-2. Niemalże 30% dodanych bakterii szczepu Lactobacillus paracasei Lbp PB01 przylegało do hodowli komórek 1 w czasie 1- godzinnego okresu inkubacji, w porównaniu z około 20% szczepu Lactobacillus acidophiius Lba EB01 i około 10% Lactobacillus GG. P r z y k ł a d 4 Korelacja między przyleganiem co hodowli komórek Caco-2 a przyleganiem do VEC. Jak pokazano na fig. 3 istnieje dobra korelacja między przyleganiem do hodowli komórek Caco-2 a przyleganiem do VEC. P r z y k ł a d 5 Skład kapsułek dopochwowych Składniki: mg/kapsułkę: Laktitol 328,00 Glukoza 20,00 Guma ksantanowa 25,00 Lactobacillus acidophiius Lba EB01 12,50 Lactobacillus paracasei Lbp PB01 12,50 Stearynian magnezu 2,00 Liofilizowaną hodowlę pałeczek kwasu mlekowego utrzymywano do chwili użycia wolną od obcych zanieczyszczeń. Stwierdzono, że odżywcza pożywka wzrostowa, składająca się z bezwodnej glukozy, bezwodnego laktitolu i gumy ksantanowej jest optymalna dla bakterii mlekowych. Stearynian magnezu jest hydrofobowym środkiem poślizgowym o właściwościach przeciwadhezyjnych, zapewniającym przepływ proszku w czasie wypełniania nim kapsułek. Wszystkie zaróbki przesiano przy użyciu sita Frewitt i wymieszano przy użyciu mieszadła Cubus. Następnie kapsułki napełniono jednorodnym proszkiem. Wszystkie procesy prowadzi się zgodnie z ogólną praktyką farmaceutyczną. Nieprzetworzony materiał hodowli, zaróbki i gotowy produkt są skrupulatnie kontrolowane przez zastosowanie uznanych metod analitycznych do identyfikacji, badania czystości, zanieczyszczeń i oznaczania. P r z y k ł a d 6 Skład tabletek do żucia Składniki: mg/tabletkę: Laktitol 330,50 Ksylitol 90,00 Mandarynkowy środek smakowo-zapachowy 3,50 Kwas mlekowy 9,00 Podwójnie powlekane Lactobacillus Lbp paracasei 6,25 Podwójnie powlekane Lactobacillus Lba acidophillus 6,25 Stearynian magnezu 4,50 Liofilizowaną hodowlę pałeczek kwasu mlekowego utrzymuje się do chwili użycia wolna od obcych zanieczyszczeń. Stwierdzono, że odżywcza pożywka wzrostowa, laktitol, jest optymalna dla bakterii mlekowych. Stearynian magnezu jest hydrofobowym środkiem poślizgowym o właściwościach przeciwadhezyjnych, zapewniającym przepływ proszku w czasie prasowania tabletek. Mandarynkowy środek smakowo-zapachowy w proszku i kwas mlekowy w proszku są dodawane dla ich właściwości smakowozapachowych. Wszystkie substancje przesiano przy użyciu sita Frewitt i wymieszano przy użyciu mieszadła Cubus. Następnie jednorodny proszek sprasowano w tabletki, przy wadze tabletek wynoszącej 450 mg. Wszystkie procesy prowadzi się zgodnie z ogólną praktyką farmaceutyczną. Nieprzetworzony materiał hodowli, substancje pomocnicze i gotowy produkt są skrupulatnie kontrolowane przez zastosowanie zwalidowanych metod analitycznych do identyfikacji, badania czystości, zanieczyszczeń i oznaczania.

12 12 PL B1 P r z y k ł a d 7 Kompozycja dla produktu nabiałowego Wytwarzanie probiotycznego szczepu Lactobacillus acidophiius Lba EB01 i kultur jogurtowych: Odtłuszczone mleko pasteryzuje się w bardzo wysokich temperaturach, około 98 C przez co najmniej 3 minuty. Odtłuszczone mleko w proszku lub serwatka w proszku mogą być wzbogacane w tym procesie w celu zwiększenia zawartości procentowej suchego materiału. Pasteryzowane w wysokiej temperaturze mleko odtłuszczone następnie standaryzuje się pod względem zawartości tłuszczu i białka, tak aby ostatecznie procentowo zawierało 3,5-4,0% tłuszczu i 3,8-4,0% białka. Standaryzowane mleko następnie homogenizuje się w temperaturze C i pod ciśnieniem MPa. Standaryzowane i homogenizowane mleko następnie pasteryzuje się w temperaturze C przez 3-5 minut. Mleko następnie ochładza się i pompuje do kadzi fermentacyjnej w celu inkubacji w stałej temperaturze fermentacji wynoszącej C przez cały czas trwania procesu fermentacji. Hodowlę stanowiącą wyjściowy zakwas mleczarski dla jogurtu oraz wyjściowy zakwas mleczarski szczepu Lactobacillus Lba EB01 umieszcza się bezpośrednio w mleku w trakcie intensywnego mieszania. Wyjściowe zakwasy mleczarskie hodowli fermentacyjnych są dostarczane z np. zamrożonych hodowli (peiety przechowywane w temperaturze -40 C przed użyciem) i bezpośrednio umieszczane w kadzi fermentacyjnej. Proces fermentacji prowadzi się do momentu, gdy ph osiągnie poziom 4,6-4,4. Następnie jogurt miesza się i ochładza do temperatury C. Następnie jogurt ochładza się do temperatury około C i pompowany bezpośrednio do zbiornika buforowego, gdzie przechowuje się go w temperaturze 20 C do momentu napełniania nim ostatecznych opakowań (z lub bez dżemu owocowego) i przechowuje w chłodzie w temperaturze 2-5 C. P r z y k ł a d 8 Badanie pilotażowe z zastosowaniem kapsułek dopochwowych Badanie kliniczne: Działanie i poziom zadowolenia pacjenta. Cele badania pilotażowego: 1. Zbadanie działania klinicznego kapsułek dopochwowych u kobiet z rozpoznaną waginozą bakteryjną (BV). 2. Zbadanie, czy kapsułki dopochwowe są przyjazne dla pacjentów. Grupa pacjentów: 21 kobiet z rozpoznaną BV. Lekarz rozpoznał BV zgodnie z następującymi kryteriami: Kobiety z upławami o nieprzyjemnym zapachu - Nadmierna objętość szarych i białawych upławów - ph wyższe od 4,5 - dodatni wynik testu zapachowego Postać dawkowania Kapsułki dopochwowe wytwarzane według przykładu 5, zawierające ludzkie bakterie kwasu mlekowego (Lba EB01 i Lbp PB01). Leczenie: Po postawieniu rozpoznania kobiety były leczone przez jeden tydzień kapsułkami dopochwowymi. 2-3 tygodnie po leczeniu kobiety były badane klinicznie a następnie proszone o wypełnienie kwestionariusza pacjenta. Miejsce prowadzenia badania: Badanie przeprowadzono w klinice ginekologicznej w Drammen (Norwegia). Wyniki: U wszystkich pacjentek występowały upławy o nieprzyjemnym zapachu, dodatkowo u 12 występowały upławy o nadmiernej objętości, u 5 niewielkie krwawienie, podczas gdy 3 podawały dyskomfort związany ze świądem. 2/3 pacjentek chorowało przez kilka lat. 13 (62%) próbowało samodzielnie stosowanego leczenia: 8 przeciwgrzybiczy preparat Canesten, 3 czopki z kwasu mlekowego, 1 antybiotyk.

13 PL B pacjentek konsultowało się ze swoim lekarzem i 50% otrzymało środek przeciwgrzybiczy, 25% Dalacin przeciw BV a 25% nie otrzymało żadnego leczenia. 90% kobiet podało (19 z 21), że objawy ustąpiły w czasie leczenia, u większości w ciągu kilku dni: w ciągu 2 dni: 6 kobiet w ciągu 5 dni: 9 kobiet w ciągu 8 dni: 4 kobiety Dla jednej kobiety wkładanie kapsułki dopochwowej stanowiło problem, podczas gdy pozostałe 20 kobiet było bardzo zadowolonych. Wszystkie kobiety z wyjątkiem jednej (1 z 2, według których leczenie było nieskuteczne) chciały zastosować kapsułki dopochwowe ponownie w przypadku nawrotu. Nie zgłaszano żadnych działań ubocznych. Wniosek: Okazuje się, że kapsułki dopochwowe zawierające szczepy bakteryjne według wynalazku wywierają korzystny efekt kliniczny na kobiety odczuwające objawy związane z BV i wyleczono 9 z 10 kobiet. Większość pacjentek próbowała samodzielnego stosowania leków i konsultowała się ze swoim lekarzem. Większość z nich próbowała środków przeciwgrzybiczych w celu uśmierzenia objawów. Kapsułki dopochwowe były uważane za przyjazne pacjentowi. P r z y k ł a d 9 Wytworzono różne preparaty dopochwowe w celu zbadania działania laktitolu w preparacie prebiotycznym według wynalazku u kobiet w warunkach in vivo Skład kapsułek dopochwowych (z laktitolem) Składniki: mg/kapsułkę: Laktitol 328,0 Glukoza 20,0 Guma ksantanowa 25,0 Lactobacillus acidophiius Lba EB01 12,5 Lactobacillus paracasei Lbp PB01 12,5 Stearynian magnezu 2,0 Skład kapsułek dopochwowych (z laktozą) Składniki: mg/kapsułkę: Laktoza 328,0 Glukoza 20,0 Guma ksantanowa 25,0 Lactobacillus acidophiius Lba EB01 12,5 Lactobacillus paracasei Lbp PB01 12,5 Stearynian magnezu 2,0 Skład kapsułek dopochwowych (bez szczepów bakteryjnych) Składniki: mg/kapsułkę: Laktitol 353,0 Glukoza 20,0 Guma ksantanowa 25,0 Stearynian magnezu 2,0 Kapsułki dopochwowe zawierające szczepy bakteryjne i laktitol są korzystnymi postaciami dawkowania do leczenia kobiet z problemami ginekologicznymi.

14 14 PL B1

15 PL B1 15 P r z y k ł a d 11 Skład kwasów tłuszczowych Lactobacillus acidophiius Lba EB01 i Lactobacillus paracasei Lbp PB01. Referencyjna baza danych Referencyjna baza danych Badany Badany Lb. AcidophiIus Lb. Paracasei Lb. AcidophiIus Lba EB01 Lb. Paracasei Lbp PB01 Kwas tłuszczowy Procent Kwas tłuszczowy Procent Kwas tłuszczowy Procent Kwas tłuszczowy 14:0 4,09 14:0 5,25 14:0 9,79 14:0 6,22 16:0 7,91 16:0 16,17 16:0 34,64 16:0 37,32 17:1 w8c 1,24 17:1 w8c 0,6 17:1 w8c 0 17:1 w8c 0 18:1 w9c 63,03 18:1 w9c 44,07 18:1 w9c 32,79 18:1 w9c 37,45 18:1 w7c 6,17 18:1 w7c 13,18 18:1 w7c 0 18:1 w7c 5,56 18:0 0,9 18:0 1,05 18:0 8,17 18:0 7,04 Suma 3 5,71 Suma 3 9,47 Suma 3 0 Suma 3 0 Suma 5 2,16 Suma 5 0,56 Suma 5 14,6 Suma 5 6,41 Suma 7 7,09 Suma 7 8,3 Suma 7 0 Suma 7 0 Suma % 98,3 98,65 99, Procent P r z y k ł a d 12 API Lactobacillus acidophiius Lba EB01 i Lactobacillus paracasei Lbp PB01 wykazujący zdolność szczepów do fermentacji różnych cukrów. Numer 1 = Lactobacillus acidophiius Lba EB01 (DSM 14869) Numer 2 = Lactobacillus paracasei Lbp PB01 (DSM 14870) Ogólny wniosek: Numer 1 = Lactobacillus acidophiius Lba EB01 (DSM 14869) Badanie API 50 CHL dało bardzo dobry wynik pod względem rodzaju, który jak stwierdzono był prawidłowy (Lactobacillus spp), natomiast identyfikacja na poziomie gatunku jest mniej pewna (L. acidophilus). Wyniki : API50CHL 1 Gliceryna Erytryt D-Arabinoza L-Arabinoza Ryboza D-Ksyloza L-Ksyloza Adonitol β-metylo-d-ksylozyd Galaktoza Glukoza Fruktoza Mannoza Sorboza