PL B1. Nowe szczepy z rodzaju Lactobacillus i kompozycja składająca się z nowych szczepów z rodzaju Lactobacillus

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 1/20 ( ) A61K 35/74 ( ) C12R 1/225 ( ) A61P 15/00 ( ) (54) Nowe szczepy z rodzaju Lactobacillus i kompozycja składająca się z nowych szczepów z rodzaju Lactobacillus (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 19/06 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 09/11 (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT BIOTECHNOLOGII SUROWIC I SZCZEPIONEK BIOMED SPÓŁKA AKCYJNA, Kraków, PL (72) Twórca(y) wynalazku: PIOTR B. HECZKO, Kraków, PL MAGDALENA STRUS, Kraków, PL URSZULA SKORUPSKA, Kraków, PL BARBARA ŁUKAWSKA, Kraków, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Alina Magońska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku są nowe szczepy z rodzaju Lactobacillus i kompozycja składająca się z nowych szczepów z rodzaju Lactobacillus przeznaczone do leczenia zakażeń dróg rodnych kobiet i rekonstrukcji flory pochwy w celu zwalczania dysbakteriozy. W ostatnich kilkunastu latach znacznie wzrosła populacja kobiet zapadających na bakteryjne i grzybicze zakażenia dróg rodnych i moczowych. Zauważono, że niektóre gatunki Candida wykazują oporność na leki imidazolowe zaś kuracje antybiotykowe powodują powstanie nieprawidłowej flory bakteryjnej pochwy. W rezultacie narasta częstość niepowodzeń terapeutycznych zakażeń. Wobec trudności w skutecznym leczeniu tej jednostki chorobowej zaczęto poszukiwać alternatywnych form leczenia. Rozpatruje się możliwości zastosowania preparatów probiotycznych zawierających żywe bakterie z rodzaju Lactobacillus. W oparciu o badania prowadzone w warunkach in vitro udowodniono, że szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus produkują specyficzne metabolity (nadtlenek wodoru, produkty kwaśne, związki aromatyczne, peptydy zbliżone w swojej budowie do bakteriocyn), które powodują spadek populacji niepożądanych gatunków bakterii i grzybów. Antagonizm wobec bakterii i grzybów jest jednym z dokładniej poznanych i udowodnionych mechanizmów działania bakterii kwasu mlekowego w biocenozie pochwy. Polega on na eliminacji drobnoustrojów chorobotwórczych za pomocą: - znacznego obniżenia ph pochwy, mogącego dochodzić do 4.5, dzięki wytwarzanym metabolitom, takim jak kwas mlekowy i octowy pochodzących głównie z fermentacji węglowodanów, - syntezy swoistych związków antybakteryjnych (substancji podobnych do bakteriocyn, lantybiotyków), takich jak laktocyna (Lactobacillus spp.), czy acidofilina (Lactobacillus acidophilus). Substancje podobne do bakteriocyn lub bardziej precyzyjnie lantybiotyki są aktywnymi biologicznie, peptydowymi substancjami działającymi bakteriobójczo na blisko spokrewnione drobnoustroje. Mechanizm ich działania polega na wytworzeniu por w ścianie komórek wrażliwych bakterii, przez które wypływają niskocząsteczkowe substancje, takie jak jony i elektrolity zawarte w cytoplazmie, co w konsekwencji prowadzi do zniszczenia komórki. Szczepy wytwarzające bakteriocyny mają jednocześnie geny zabezpieczające je przed samounicestwieniem. - wytwarzania innych, drobnocząsteczkowych związków antybakteryjnych i przeciwgrzybicznych: peptydów i kwasów, - wytwarzania nadtlenku wodoru, który działa antybakteryjnie bezpośrednio lub poprzez inne mechanizmy (łączenie z rodankami, reakcja Fentona). Uważa się, że dzięki temu bakterie produkujące nadtlenek wywierają zdecydowanie konkurencyjne działanie w stosunku do typowych czynników etiologicznych zakażeń pochwy. Produkcja nadtlenku wodoru jest uważana za istotny mechanizm hamowania patogennej flory bakteryjnej pochwy przez bytujące w tej samej niszy ekologicznej bakterie z rodzaju Lactobacillus. Bakterie te ze względu na brak katalazy, wydzielają do otaczającego środowiska nie rozłożony nadtlenek wodoru. Mechanizm działania nadtlenku wodoru polega na niszczącym wpływie uwolnionych rodników tlenowych. Według innej hipotezy, nadtlenek wodoru powoduje redukcję tiocyjanków zawartych w płynach tkankowych do hipotiocyjanków, które są toksyczne dla wielu drobnoustrojów. W ostatnich latach udział nadtlenku wodoru w mechanizmach antagonistycznych Lactobacillus jest przedmiotem szczególnej uwagi badaczy zajmujących się zaburzeniami flory pochwy i szczepy produkujące ten związek są proponowane jako kandydaci do dopochwowych preparatów probiotycznych. Wymienione właściwości bakterii z rodzaju Lactobacillus są bardzo pożądane przy konstruowaniu preparatów probiotycznych. Jednak nie wszystkie występujące w pochwie gatunki Lactobacillus posiadają równocześnie wyżej wspomniane własności, a ponadto regulacja wydzielania czynników antybakteryjnych w środowisku biocenotycznym powoduje, że Lactobacillus w warunkach naturalnych in vivo stabilizuje i kontroluje skład flory pochwy nie powodując całkowitej eliminacji innych jej składników, co przypuszczalnie tłumaczy może fakt izolacji w stanie zapalnym pochwy zarówno typowych czynników patogennych np. grzybów, jak i bakterii kwasu mlekowego. Adherencja bakterii do komórek ustroju gospodarza stanowi jeden z ważniejszych elementów opisu aktywności powierzchniowej bakterii. Uważana jest za niezbędny, pierwszy etap kolonizacji błon śluzowych, dotyczący zarówno bakterii patogennych, jak i tych stanowiących normalną florę ludzkiego organizmu. Adherencja drobnoustrojów do komórek nabłonkowych jest wynikiem swoistego procesu, w którym biorą udział powierzchniowe adhezyny bakterii i receptory na powierzchni błony komórek śluzowych. Przeprowadzono bardzo wiele badań nad charakterystyką adhezyn bakterii Gram-ujemnych,

3 PL B1 3 szczególnie nad szczepami Escherichia coli powodującymi zakażenia dróg moczowych, z których wiadomo, że adhezyny stanowią fimbrie, filamenty ("fuzzy layer"), nie fimbrialne lektyny powierzchniowe (hemaglutyniny) i lektyny zewnątrzkomórkowe, rozpoznające swoiste cukry. Wszystkie te adhezyny nadają powierzchni komórki wysoką hydrofobowość. Bakterie z rodzaju Lactobacillus pochodzące z normalnej flory np. przewodu pokarmowego też wykazują wysoką hydrofobowość powierzchni, co może wskazywać, że prawdopodobnie wykorzystują te same mechanizmy do kolonizacji powierzchni śluzówek, co patogenne bakterie Gram-ujemne. Uważa się, że bakterie z rodzaju Lactobacillus mogą przylegać za pomocą struktur powierzchniowych zawierających kwasy teichowe i lipoteichowe związane z peptydoglikanem ściany komórkowej. Oporność szczepów bakterii probiotycznych na leki przeciwbakteryjne jest przedmiotem szczegółowych badań za względów bezpieczeństwa przyszłych preparatów leczniczych. Chodzi tu głównie o możliwość przeniesienia genów oporności na antybiotyki z podanych w preparacie, żywych bakterii na inne składniki flory chorego i rozpowszechnienie genów oporności wśród składników normalnej flory, co może spowodować uniemożliwienie leczenia ewentualnych zakażeń tego chorego lub jego kontaktów. Bakterie z rodzaju Lactobacillus wykazują oporność gatunkową, tzn. oporność, która na stałe związana jest z danym gatunkiem (np. bakterie Lactobacillus acidophilus są zawsze wrażliwe na wankomycynę, zaś np. Lactobacillus rhamnosus są na ten lek zawsze oporne). Oporność na dany antybiotyk pojawiająca się w jednym lub kilku szczepach danego gatunku odbiegająca od generalnej wrażliwości całego gatunku, lub znajdowana w szczepach wyizolowanych od chorego w trakcie leczenia antybiotykiem może oznaczać jednostkowe nabycie cechy oporności na drodze mutacji lub wymiany materiału genetycznego zlokalizowanego na plazmidzie, jest to już oporność plazmidowa (nabyta). Zjawisko nabywania oporności przez bakterie z rodzaju Lactobacillus nie jest korzystne, istnieje bowiem zagrożenie jej przekazywania enterokokom (również drogą plazmidową), które wraz ze szczepami Lactobacillus są naturalnym symbiontem przewodu pokarmowego. Tak więc dla uzyskania lepszych efektów terapeutycznych należy dążyć do wyizolowania szczepów, które wykazywałyby silny potencjał probiotyczny. Znane wynalazki z dziedziny leczenia chorób zapalnych narządu rodnego można podzielić na dwie grupy. Jedna opisuje metody i środki leczenia polegające na stworzeniu takich nowych warunków środowiska, wynikających ze składu substancji pomocniczych, tak aby każdy szczep z gatunku Lactobacillus wykazywał własności lecznicze. Druga grupa patentów dotyczy poszukiwania nowych szczepów o silnych własnościach leczniczych w każdych warunkach. Znany jest z polskiego opisu patentowego nr szczep Lactobacillus plantarum wykazujący zdolność do kolonizowania ludzkiej śluzówki jelitowej, przeznaczony do wytwarzania leku do leczenia ostrego zapalenia żołądka i jelit. Szczep ten stosuje się również do wytwarzania leku hamującego przywieranie Escherichia coli eksprymujących fimbrie typu 1 do ludzkich komórek nabłonkowych pochwy i dróg moczowych. Lek przeznaczony jest do podawania doustnego. W opisie patentowym RU ujawniono nowy szczep Lactobacillus fermentum wyizolowany z pochwy kobiet. Jest on wariantem znanego i stosowanego już szczepu Lactobacillus fermentum 90-TS-4. Szczep ten wykazuje adhezję do nabłonka pochwy w obecności konkanavaliny A. Przeznaczony jest on do leczenia bakeriozy w praktyce ginekologicznej. W opisie patentowym nie ujawniono w jakiej postaci. W opisie patentowym WO 99/ ujawniono nowy szczep Lactobacillus plantarum w zastosowaniu do leczenia dróg moczowo-płciowych. Szczep ten hamuje wzrost patogennych organizmów i jest wytrzymały na dłuższe okresy przechowywania w temperaturze pokojowej. Szczep jest łatwo przenoszony na ludzką skórę i na nabłonek pochwy. Może być korzystnie włączony do kompozycji farmaceutycznych i do produktów do użytku osobistego, takich jak produkty do higieny intymnej kobiet, pieluchy i wkładki higieniczne. Wymienione powyżej opisy patentowe dotyczą pojedynczych szczepów bakterii z rodzaju Lactobacillus których zastosowanie podyktowane jest ograniczonymi właściwościami szczepu. Opisane szczepy służą także do przygotowania materiału do podania doustnego. Opisy nie ujawniają czy przedstawione szczepy posiadają własności probiotyczne. Rozwiązanie przedstawione w opisie patentowym US 6,468,526 polega na określeniu warunków, poprzez dobór odpowiedniej kompozycji ochronnej, umożliwiających optymalną kolonizację narządu rodnego szczepami Lactobacillus. Unikalne szczepy Lactobacillus, ujawnione w opisie patentowym US 6,468,526, po aplikacji przylegają do komórek nabłonka pochwy i kolonizują ją. Te unikalne szczepy mogą być przywrócone ze środowiska narządu rodnego po czasie. Tak utrzymana kolonizacja i żywotność szczepów Lactobacillus jest głównie związana z nową kompozycją ochronną ujawnioną w tym dokumencie. Zabezpieczenie uzy-

4 4 PL B1 skane dzięki kompozycji ochronnej według niniejszego wynalazku umożliwia szczepom Lactobacillus przylegać do komórek nabłonka pochwy w stanie metabolicznie nieaktywnym i utrzymać umiejscowienie podczas powrotu do stanu aktywnego, zdolnego do wytwarzania funkcjonalnie blokujących produktów ubocznych. Takie własności kompozycji komórek mikroorganizmów dotychczas nie zostały zaobserwowane. Kompozycja ochronna według niniejszego wynalazku jest elastyczna w procesie osuszania. Proces osuszania może być wykonywany różnymi metodami np. stosowanymi podczas produkcji kapsułek. Jedna z realizacji niniejszego wynalazku dotyczy leku dopochwowego. Taki lek zawiera dostatecznie czystą kulturę bakterii izolowanego szczepu z rodzaju Lactobacillus posiadającego identyfikujące cechy charakterystyczne, które obejmują: 1. wielkość procentowego udziału przylegania komórek, co najmniej 50%, 2. zdolność do wytwarzania więcej aniżeli 0.5 ppm nadtlenku wodoru w warunkach efektywnej kultury, Lek dopochwowy według wynalazku zawiera także kompozycję ochronną, która utrzymuje i zabezpiecza kulturę bakterii. Taka kompozycja zawiera: 1. biologicznie aktywny środek wiążący, 2. przeciwutleniacz, 3. polyol, 4. węglowodany, 5. materiał białkowy. Inne rozwiązanie, które ma doprowadzić do wyleczenia stanów zapalnych narządu rodnego przedstawiono w opisie patentowym US 6,180,100. Cel osiągnięto poprzez zastosowanie unikalnych szczepów z rodzaju Lactobacillus. w opisie patentowym US 6,180,100 przedstawiono metodę leczenia i zapobiegania infekcjom układu moczowo płciowego ssaków, także ludzi, która obejmuje stosowanie bezpiecznych i skutecznych ilości jednego lub więcej szczepu żywych komórek bakterii Lactobacillus, nieżywych całych komórek komórek, ściennych fragmentów komórek lub blokujących substancji. Także objęte niniejszym wynalazkiem są kompozycje właściwe do leczenia i zapobiegania infekcjom układu moczowo płciowego, które zawierają jeden lub więcej szczepów żywych komórek bakterii Lactobacillus, nieżywych całych komórek, ściennych fragmentów komórek lub blokujących substancji i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, gdzie Lactobacillus jest co najmniej jednym ze szczepów, który przylega do komórek nabłonka pochwy lub przewodu moczowego. Istotą wynalazku jest metoda przywracania miejscowej flory układu moczowo płciowego, farmaceutyczna kompozycja skuteczna do odtwarzania lokalnej flory układu moczowo płciowego, metoda kolonizacji układu moczowo płciowego polegająca na stosowaniu terapeutycznie skutecznych ilości co najmniej jednego szczepu rodzaju Lactobacillus wybranego z grupy zdeponowanych szczepów zawierających szczepy: Lactobacillus casei var rhamnosus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus jenseni, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum. Celem wynalazku jest wyodrębnienie nowych szczepów z rodzaju Lactobacillus o własnościach probiotycznych działających kompleksowo i w każdych warunkach zdolnych do kolonizacji nabłonka pochwy kobiet. Przedmiotem wynalazku są nowe szczepy: Lactobacillus fermentum 57A zdeponowany pod numerem - B/00007, Lactobacillus plantarum 57B zdeponowany pod numerem - B/00008, Lactobacillus gasseri 57C zdeponowany pod numerem - B/00009, Lactobacillus plantarum 78B zdeponowany pod numerem - B/ Przedmiotem wynalazku jest kompozycja nowych szczepów z rodzaju Lactobacillus, która zawiera szczepy Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B, Lactobacillus gasseri 57C, których względne ilości wyznacza proporcja 0.5 : 0.5 : 1. Wyodrębnienie szczepów Materiałem do badań były wymazy pobrane z tylnego sklepienia pochwy zdrowych kobiet, wykazujących normalną florę pochwy. Mikrobiologiczną ocenę flory pochwy wykonano na podstawie oceny preparatu Grama zgodnie z dziesięciostopniową skalą Nugenta oraz na podstawie pomiaru ph (wynoszącego od ). Wybrane próbki wysiewano na stałe podłoże MRS (Oxoid) i inkubowano w temperaturze 37 C przez 48 godzin w warunkach beztlenowych lub tlenowych. Po upływie tego czasu z każdego podłoża MRS izolowano różnie wyglądające kolonie Lactobacillus, które następnie

5 PL B1 5 klasyfikowano fenotypowo za pomocą zestawu API 50CH i genotypowo w oparciu o łańcuchową reakcję polimerazy. W ten sposób utworzono kolekcję przechowywaną w temperaturze -70 C w płynnym podłożu Schaedlera z dodatkiem 50% glicerolu. Identyfikacja szczepu Szczepy Lactobacillus plantarum 57B, Lactobacillus plantarum 78B, Lactobacillus fermentum 57A oraz z Lactobacillus gasseri 57C zostały wyizolowane z pochwy zdrowej kobiety. Szczepy stanowią Gram dodatnie laseczki. Szczepy zostały zdeponowane zgodnie z Traktatem Budapesztańskim w dniu r. w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalne Polskiej Akademii Nauk, Wrocław, ul. R. Weigla 12, gdzie nadano im numery depozytowe: Lactobacillus fermentum 57A - B/00007, Lactobacillus plantarum 57B - B/00008, Lactobacillus gasseri 57C - B/00009, Lactobacillus plantarum 78B -B/ Zdolność szczepów do fermentacji Zdolność szczepów do fermentacji różnych węglowodanów podano w tabeli I Testy przeprowadzono z użyciem API 50CH T a b e l a I Zdolność szczepów do fermentacji węglowodanów Lactobacillus plantarum 57B Lactobacillus plantarum 788 Lactobacillus fermentum 57A Lactobacillus gasseri 57C Gliceryna Erytrytol D-arabinoza L-arabinoza Ryboza D-Ksyloza L-Ksyloza Adonitol β-metylo-ksylozol Galaktoza D-Glukoza D-Fruktoza D-Mannoza L-Sorboza Ramnoza Dulcytol Inozytol Mannitol Sorbitol α-metylo-d-mannozyd α-metylo-d-glukozyd N-Acetylo-glukozamina Amigdalina Arbutyna

6 6 PL B1 cd. tabeli Eskulina Salicyna Celobioza Maltoza Laktoza Melibioza Sacharoza Trehaloza Inulina Melecytoza D-rafinoza Skrobia Glikogen Ksylitol β-gencjobioza + +/- - - D-Turanoza D-Liksoza D-Tagaroza D- Fukoza L-Fukoza D-Arabitol L-Arabitol Glukonian Ketoglukonian Ketoglukonian Fenotypowo szczepy można zidentyfikować jako Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum i jako Lactobacillus gasseri. Genotypowa identyfikacja szczepów Genotypowa identyfikacja szczepów została przeprowadzona za pomocą metody PGR (łańcuchowa reakcja polimerazy) przy użyciu gatunkowo specyficznych starterów. Technika PGR była często wykorzystywana do identyfikacji pałeczek kwasu mlekowego występujących w produktach mleczarskich, a także do Lactobacillus z przewodu pokarmowego i pochwy. Jest to o wiele praktyczniejsza i dokładniejsza metoda niż metody fenotypowe choć nie jest pozbawiona wad. Startery nie zawsze są stuprocentowo specyficzne - szczególnie jeżeli różnicujemy wśród blisko spokrewnionych gatunków np. w obrębie grupy acidofilnej Lactobacillus. Przy stosowaniu metod genotypowych niezmiernie ważne jest także posiadanie dużej kolekcji dokładnie scharakteryzowanych szczepów wzorcowych. Gatunkowo specyficzne primery wykorzystane do amplifikacji DNA otrzymano bazując na sekwencji regionu pomiędzy 16S i 23S rrna lub sekwencji genu 16S rrna (według publikacji: J.Walter, G.W.Tannock, A.Tilsala-Timisjarvi, S.Rodtong, D.M. Loach, K.Munro, i T.Alatossava Detection and Identification of Gastrointestinal Lactobacillus Species by Using Denaturing Gradient Gel Electrophoresis and Specific-Species PGR Primers" Applied and Environmental Microbiology, Jan. 2000, Vol.66, No.l, p )

7 PL B1 7 L. gasseri I AGC TGA ACC AAC AGA TTC AC Acill ACT ACC AGG GTA TCT AAT CC L.plantarum 78B (region 16S-23S rrna) Lfpr GCC GCC TAA GGT GGG AGA GAT Plan II TTA CCT AAC GGT AAA TGC GA L.fermentum (region I6S-23S rrna) Lfpr GCC GCC TAA GGT GGG AGA GAT FermII CTG ATC GTA GAT GAG TCA AG L.plantarum 57B (region 16S-23S rrna) Lfpr GCC GCC TAA GGT GGG AGA GAT Plan II TTA CCT AAC GGT AAA TGC GA Chromosomalne DNA było izolowane przy użyciu kolumienkowego zestawu do izolacji genomowego DNA według zaleceń producenta, zmodyfikowano jedynie lizę komórek bakteryjnych stosując dodatkowo lizozym (1 mg/ml). Typowa mieszanina reakcyjna zawierała: bufor do polimerazy 1x (skład buforu: 10 mm Tris-HCl, ph 8.8, 1,5mM MgCl 2 w przypadku L.acidophilus a 2,5 mm MgCl 2 dla L.gasseri, 50 mm KCl, 0,1% Triton) oraz 200 μm każdego dntp, 1 μm starterów AciI i Acill lub GasI i GasiL, 50 ng bakteryjnego DNA i lu polimerazy Delta2. Próbkę pokrywano kroplą olejku mineralnego. Program amplifikacji DNA był następujący: 92 C przez 2 minuty, następnie 30 cykli (95 C przez 30 sekund, 55 C przez 30 sekund i 72 C przez 30 sekund), 72 C przez 1 minutę kończyło program. Produkty amplifikacji (0,3-0,5 kb) były analizowane na żelu agarozowym (10 μl próbki, 1% żel wybarwiany bromkiem etydyny). Określenie właściwości probiotycznych szczepów W celu określenia właściwości probiotycznych szczepów zostały wykonane następujące badania: 1. określenie stopnia adherencji do komórek linii A431 (linia ludzkich komórek nabłonka pochwy) 2. określenie antagonizmu metodą słupkową i/lub warstwową w stosunku do Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia uropatogennego szczepu E.coli, Streptococcus agalactiae, Candida albicans. 3. Oznaczenie poziomu produkcji H 2 O 2 metodą immunoenzymatyczną. Określenie antagonizmu Szczepy przebadano pod kątem zdolności do namnażania w warunkach przemysłowych, a otrzymane liofilizaty ponownie przetestowano w kierunku właściwości probiotycznych w celu stwierdzenia, czy warunki liofilizacji oraz namnażania na podłożach produkcyjnych nie wpływają na utratę pożądanych właściwości probiotycznych. W tym celu liofilizaty zawieszano na 0,5 godziny w podgrzanym do temperatury 37 C podłożu wybiórczym MRS, a następnie określano antagonistyczne działanie tych szczepów probiotycznych wobec następujących bakterii i grzybów wskaźnikowych posługując się metodą słupkową: 1. Uropatogenny szczep Eschericliia coli 2. Streptococcus agalactiae 3. Gardnerella vaginalis 4. Prevotella bivia 5. Candida albicans Badanie antagonizmu przeprowadzono za pomocą metody słupkowej. Wybrane drobnoustroje wskaźnikowe, które stanowiły tlenowe i beztlenowe czynniki patogenne zakażeń ludzkiego narządu rodnego uzyskano z kolekcji drobnoustrojów: Gardnerella vaginalis ATCC 14018, Streptococcus agalactiae DSM 2134, Prevotella bivia (dawny Bacteroides) DSM 20514, uropatogenny szczep Escherichia coli PZH 4. Tlenowe bakterie wskaźnikowe hodowano w optymalnych warunkach na bulionowym podłożu Mueller-Hintona (MH) (Difco) przez 24 godziny, w temperaturze 37 C. Po inkubacji, 1 oczko ezy przenoszono do 5 ml czystego bulionu MH i ponownie inkubowano przez 4-8 godzin w temperaturze 37 C w łaźni wodnej. Stężenie wskaźnikowych bakterii tlenowych doprowadzano do gęstości 0,5 według skali Mc Farland'a, rozcieńczając hodowlę solą fizjologiczną. Następnie 0,1 ml takiego inokulum przenoszono na odpowiednie podłoża stałe: dla Escherichia coli agar Mueller-Hintona (MH) (Difco), dla Streptococcus agalactiae agar Mueller-Hintona (MH) (Difco) z dodatkiem 5% krwi baraniej i rozprowadzano je po powierzchni płytki wacikiem. Bakterie o szczególnych wymaganiach odżywczych, to znaczy Gardnerella, Prevotella były po odmrożeniu zawieszane w specjalnym bulionie ATCC 593, bezpośrednio wysiewane w objętościach po 0,1 ml i rozprowadzane na odpowiednich podłożach stałych. Dla Gardnerella vaginalis były to płytki z 20 ml agaru Columbia (Difco) z dodatkiem krwi ludzkiej, dla Prevotella -płytki z 20 ml agaru Brucella (Difco) z dodatkiem krwi ludzkiej, heminy i witaminy K1. Bakterie antagonistyczne z rodzaju Lactobacillus hodowano w temperaturze 37 C, w warunkach beztlenowych na płytkach z podłożem stałym MRS (OXOID) o objętości 40 ml. Po upływie 18 go-

8 8 PL B1 dzin inkubacji, w płytkach agarowych wycinano korkoborem okrągłe słupki o średnicy 9 mm, które następnie nakładano na płytki z naniesionymi, za pomocą wymazu, bakteriami wskaźnikowymi, po czym umieszczano je na 4 godziny w lodówce w temperaturze 4 C (za wyjątkiem bakterii beztlenowych). Dalszą inkubację przeprowadzano w temperaturze 37 C przez godziny w warunkach tlenowych, mikroaerofilnych, lub też beztlenowych w zależności od wymagań bakterii wskaźnikowych. Po inkubacji wokół słupka powstawała strefa zahamowania wzrostu bakterii wskaźnikowych, której średnicę w mm przyjmowano, jako miarę stopnia antagonizmu. Badanie antagonizmu wobec grzybów Candida przeprowadzono za pomocą metody warstwowej będącej modyfikacją metody Fitzsimmonsa i Berry'ego. Drobnoustrój wskaźnikowy stanowił szczep Candida albicans KM 135/2003 pochodzący z materiału ludzkiego (wymaz z pochwy). Badane szczepy Lactobacillus hodowano na stałym (10 ml) podłożu MRS (Oxoid) w temperaturze 37 C przez 24 godziny w warunkach mikroaerofilnych. Na powierzchnię płytki z wyrosłymi koloniami Lactobacillus wylewano następnie 10 ml podłoża MYPG (Bacto YM agar, Difco), tworząc w ten sposób drugą warstwę. Po zestaleniu podłoże MYPG posiewano 24 godzinną hodowlą C.albicans za pomocą wacika doprowadzając ją wcześniej do gęstości 0,5 według skali Mc Farlanda. Płytki po posianiu preinkubowano w 4 C przez 4 godziny, a następnie inkubowano przez 24 godziny w 37 C w warunkach tlenowych. Strefy zahamowania wzrostu C.albicans oceniano za pomocą skali półilościowej. - brak działania antagonistycznego Lactobacillus wobec Candida albicans (całkowity brak strefy zahamowania wzrostu Candida nad paskiem z wymazanym szczepem probiotycznym) + słabe działanie antagonistycznego Lactobacillus wobec Candida albicans (częściowe zahamowanie wzrostu Candida nad paskiem z wymazanym szczepem probiotycznym) ++ wyraźne działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec Candida albicans (całkowite zahamowanie wzrostu Candida nad paskiem z wymazanym szczepem probiotycznym) +++ bardzo silne działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec Candida albicans (całkowite zahamowanie wzrostu Candida nad paskiem i poza nim) Wyniki badań anatagonizmu przedstawiono w tabeli 2. T a b e l a 2 Wyniki antagonistycznego działania zliofilizowanych szczepów Lactobacillus pochodzenia pochwowego. Antagonizm wobec Nr szczepu G. vagin. P. bivia E. coli S. agal. C. albic. ATCC14018 DSM20514 PZH4 DSM2134 KM135/2003 L. fermentum 57A L. plantarum 57B L. gasseri 57C /++ L. plantarum 78B Badanie produkcji nadtlenku wodoru. Badanie ilościowe przeprowadzono metodą Picka i Mizela zaadaptowaną do pomiaru ilości H 2 O 2 w hodowlach bakterii. Hodowle Lactobacillus zawieszano w 1 ml płynnego podłoża MRS i inkubowano przez 24 godziny w 37 C w warunkach beztlenowych, a następnie w warunkach tlenowych na łaźni wodnej przez 4 godziny w 37 C. Końcowe stężenie bakterii wynosiło około 1 x 10 9 c.fu./ ml. Następnie hodowle wirowano przy 1200 obrotów przez 7 minut i 50 μl supernatantu przenoszono do dołka w 96-dołkowej płytce (Nunc). Do dołka dodawano 50 μl odczynnika 1 [(2 μl czerwieni fenolowej (Sigma), 2 μl peroksydazy chrzanowej (Sigma), 46 μl buforu DPBS (POCH)] i 10 μl 1N NaOH) i mierzono absorbancję przy 600 nm. Kontrolę stanowił albo sam bufor lub odczynnik 1 z NaOH. Wyniki podane w tabeli 3 uzyskano po odjęciu wartości kontrolnych.

9 PL B1 9 T a b e l a 3 Określenie ilości H 2 O 2 produkowanego przez poszczególne składniki mieszanin bakterii probiotycznych z rodzaju Lactobacillus. Nr szczepu Produkcja H 2 O 2 (mm) L. fermentum 57A 0 L. plantarum 57B 0 L. gasseri 57C L. plantarum 78B 0 Określenie właściwości adherencyjnych Określenie właściwości adherencyjnych szczepów i ich mieszanin przygotowanych w podobny sposób jak do badań antagonistycznych, tzn. namnożonych na podłożach przemysłowych, a następnie zliofilizowanych. W celu oznaczenia siły przylegania bakterii z rodzaju Lactobacillus do komórek ustroju ludzkiego posłużono się ludzką linią komórkową A 431 reprezentującą komórki pochodzące z nabłonka pochwowego. Hodowlę prowadzono przez wielokrotne pasaże, przy zastosowaniu podłoża MEM (Minimal Essential Medium) (Gibco), wzbogaconego dodatkiem 5% inaktywowanej, płodowej surowicy cielęcej. Ponadto, podłoże to zawierało 3 mm/ml L-glutaminy oraz antybiotyki: 100 μg/ml -1 streptomycyny i 100 U/ml -1 penicyliny. Hodowle prowadzono w temperaturze 37 C w atmosferze o zwiększonej wilgotności zawierającej 10% CO 2, zmieniając podłoże odżywcze 2 razy w tygodniu. W celu przeprowadzenia testu adherencji wysiewano komórki linii tkankowych o gęstości 10 4 /ml do 6-cio dołkowych plastikowych płytek (Corning). Używano 24-godzinnej hodowli komórkowej. Tak wyrośnięte komórki przemywano podgrzanym do 37 C PBS. Do testu adherencji zliofilizowane bakterie z rodzaju Lactobacillus zawieszano na okres 0,5 godziny w podgrzanym do temperatury 37 C podłożu wybiórczym MRS tak, aby uzyskać gęstość zawiesiny wynoszącą 10 9 /ml, a następnie 500 μl tej zawiesiny wraz z 500 μl podłoża hodowlanego MEM dodawano do dołków zawierających komórki A 431. Komórki linii tkankowych wraz z badanymi szczepami inkubowano w temperaturze 37 C, w atmosferze wzbogaconej 10% CO 2 przez 30 minut. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie PBS w celu usunięcia nie przyczepionych bakterii, a następnie utrwalano 3,7% formaldehydem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po utrwaleniu komórki ponownie przemywano podgrzanym do 37 C PBS i barwiono fioletem krystalicznym przez 3 minuty. Preparat oceniano mikroskopowo przy powiększeniu 1000 x. Liczono komórki Lactobacillus przylegające do 20 komórek nabłonkowych i obliczano wartość średnią, wyniki podano w tabelach 4. T a b e l a 4 Wyniki badania adherencyjnych właściwości szczepów Lactobacillus pochodzenia pochwowego do ludzkiej linii komórkowej A 431. Nr szczepu Adherencja do komórek linii A431 L. fermentum 57A ++/+++ L. plantarum 57B ++ L. gasseri 57C + L. plantarum 78B ++ Określenie stopnia adherencji dla tkanki A-431 Liczba komórek bakteryjnych powyżej powyżej w zakresie 20 do 40 + poniżej Liczbę komórek bakteryjnych podaje się jako średnią z 20 pól widzenia w preparacie - Do badań stosuje się 24 godzinną hodowlę tkanki A-431

10 10 PL B1 Określenie lekooporności szczepów. W badaniach zastosowano standardową metodę dyfuzyjno-krążkową według ogólnych standardów NCCLS (Brak standardów szczegółowych dla Lactobacillus). Badane pojedyncze szczepy Lactobacillus, posiewano po wieloboku na płytki MRS, a następnie inkubowano w warunkach beztlenowych i/lub tlenowych w temperaturze 37 C. Po 24 48h uzyskano pojedyncze kolonie, które zawieszano w 1 ml płynnego podłoża MRS i inkubowano w tych samych warunkach. Po 24 h stężenie zawiesiny bakteryjnej doprowadzono do gęstości 0,5 wg skali Mc Farlanda, rozcieńczając hodowle solą fizjologiczną. Następnie 100 μl takiego inokulum przenoszono do 1 ml NaCl. Rozcieńczoną hodowlę rozprowadzono przy użyciu jałowego wacika na całej powierzchni uprzednio przygotowanych płytek z podłożem stałym MRS Agar (Oxoid). Po ich wyschnięciu na płytki nakładano krążki z antybiotykami (po 7 krążków na każdą), a następnie inkubowano w warunkach tlenowych w temperaturze 37 C przez 24 h (24-48 h dla podłoża Brucella Agar). Po zakończeniu okresu inkubacji zmierzono za pomocą linijki strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół krążka. Średnicę stref podano w mm, uwzględniając również średnicę krążka. Oznaczenia powtarzano w celu uzyskania wartości średnich. Wyniki podano w tabeli 5. T a b e l a 5 Wrażliwość badanych szczepów Lactobacillus na antybiotyki oznaczona metodą krążkową wobec szczepów kontrolnych Antybiotyk stężenie L. fermentum 57 A Szerokość strefy zahamowania wzrostu (mm) dla: L. plantarum 57 B L. plantarum 78 B L. gasseri 57 C Penicylina 10 μg Ampicylina 10 μg Gentamycyna 10 μg Wankomycyna 30 μg Klindamycyna 2 μg Metronidazol 50 μg Sulfametoksazol 25 μg Norfioksacyna 10 μg Kwas nalidyksowy 30 μg Chloramfenikol 30 μg Tetracyklina 30 μg Badane szczepy wykazują oporność na antybiotyki zgodnie ze wzorcem oporności dla poszczególnych gatunków Lactobacillus przy zastosowaniu metody izolacji DNA plazmidowego z rodzajów takich bakterii jak Lactobacillus i Lactococcus. Nie stwierdzono obecności plazmidów w badanych szczepach. Przedstawione badania dowodzą, że nowe szczepy Lactobacillus plantarum 57B, Lactobacillus plantarum 78B, Lactobacillus fermentum 57A i Lactobacillus gasseri 57C spełniają wszystkie wymagania stawiane produktom probiotycznym. Na podstawie przeprowadzonych testów można wnioskować, że nowe szczepy są korzystniejsze w porównaniu z innymi przebadanymi szczepami. Dodatkowo każdy z wyselekcjonowanych i zdeponowanych szczepów posiada silną cechę wiodącą. Nowe szczepy Lactobacillus plantarum 57B i Lactobacillus plantarum 78B charakteryzują się silnymi właściwościami antagonistycznymi szczególnie na patogeny takie jak: Gardnerella vaginalis i Escherichia coli. Lactobacillus fermentum 57A bardzo dobrze przylega do komórek ustroju gospodarza, zaś Lactobacillus gasseri 57C wytwarza duże ilości nadtlenku wodoru. Nieoczekiwanie zaobserwowano, że w mikroflorze pochwy zdrowych kobiet najczęściej występuje po kilka gatunków Lactobacillus. Wykazano, że gatunkami najczęściej izolowanymi były szczepy z grupy acidofilnej: L. acidophilus (35%), L. fermentum (30%) i L. plantarum (30%). Można przypuszczać, że forma symbiozy pomiędzy szczepami różnych gatunków stwarza szansę skuteczniejszej obrony przed niepożądanymi drobnoustrojami wchodzącymi w skład lokalnej

11 PL B1 11 mikroflory. Zastosowano kompozycję bakterii składającą się z Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B i Lactobacillus gasseri 57C w ilościach wyznaczonych przez proporcję: 0.5 : 05 : 1. Poniżej przedstawiono wynik badania adherencji kompozycji Lactobacillus wobec szczepów wskaźnikowych (tabela 6) oraz badanie antagonizmu kompozycji szczepów Lactobacillus wobec szczepów wskaźnikowych (tab. 7). Kompozycja A1 zawiera L. fermentum 57A, L. plantarum 57B, i L. gasseri 57C w proporcjach: 0.5 : 0.5 : 1 T a b e l a 6 Kompozycja Szczepy Proporcja Stopień adherencji A1 57A, 578, 57C 0,5:0,5:1 ++ T a b e l a 7 Szczepy wskaźnikowe Strefy zahamowania wzrostu [mm] Escherichia coli 18/18 Streptococcus agalactiae 22/20 Gardnerella vaginalis 22/21 Prevotella bivia 18/18 Candida albicans ++/++ Na podstawie powyższych testów można wnioskować, że stosowanie kompozycji zawierającej L. fermentum 57A, L. plantarum 57B, i L. gasseri 57C w proporcjach: 0.5 : 0.5 : 1 jest bardzo korzystne. Tak dobrana kompozycja badanych szczepów posiada skonsolidowane cechy wiodące każdego ze szczepów. Zastrzeżenia patentowe 1. Nowy szczep Lactobacillus fermentum 57A zdeponowany pod numerem B/ Nowy szczep Lactobacillus plantarum 57B zdeponowany pod numerem B/ Nowy szczep Lactobacillus gasseri 57C zdeponowany pod numerem B/ Nowy szczep Lactobacillus plantarum 78B zdeponowany pod numerem B/ Kompozycja nowych szczepów z rodzaju Lactobacillus, znamienna tym, że zawiera trzy szczepy: Lactobacillus fermentum 57A zdeponowany pod numerem B/00007, Lactobacillus plantarum 57B zdeponowany pod numerem B/00008, Lactobacillus gasseri 57C zdeponowany pod numerem B/00009 i których względne ilości wyznacza proporcja 0.5 : 0.5 : 1.

12 12 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)