Joanna Augustynowicz, Barbara Szaraniec, Paweł Kaszycki, Henryk Kołoczek

Biotechnologia 3(1-2) 2004, 3-12 WPŁYW TREHALOZY NA PROCESY STABILIZACJI BIOCENOZ BIOPREPARATU PRZEZNACZONEGO DO DEGRADACJI ZWIĄZKÓW ROPOPOCHODNYCH Joanna Augustynowicz, Barbara Szaraniec, Paweł Kaszycki, Henryk Kołoczek Akademia Rolnicza w Krakowie Streszczenie. W pracy badano wpływ disacharydu trehalozy na przeŝywalność mikroorganizmów biopreparatu składającego się z komórek bakterii i droŝdŝy w celu opracowania optymalnych warunków jego przechowywania i magazynowania. Stwierdzono, Ŝe obecność trehalozy powoduje 20-krotny wzrost przeŝywalności mikroorganizmów w temperaturze 20ºC w stosunku do kontroli. Odwodnienie i liofilizacja biopreparatu zawierającego trehalozę równieŝ przebiega znacznie korzystniej w porównaniu do prób nie zawierających disacharydu. Wykryto zaleŝność efektu stabilizacji biopreparatu wywołanego przez ten cukier od gęstości komórek biopreparatu. Słowa kluczowe: biopreparat, liofilizacja, suszenie, trehaloza, zamraŝanie, związki ropopochodne WSTĘP ZamraŜanie i liofilizacja znajdują szerokie zastosowanie w biotechnologii jako sposoby konserwacji organów, komórek czy enzymów [Schiraldi i in. 2002, Wolkers i in. 2001]. Działanie niskich temperatur i procesy dehydratacji mogą powodować jednak nieodwracalne zmiany w strukturze i własnościach makrocząsteczek i w konsekwencji destabilizację struktur biologicznych. W przypadku komórek spadek temperatury poniŝej 0 ºC powoduje letalne zmiany na skutek powstawania kryształów lodu wewnątrz cytoplazmy (IIF ang. intracellular ice formation). Podobne efekty, jak w przypadku IIF, obserwuje się na skutek desykacji, czyli znacznej utraty wody przez komórkę. Bezpośrednią konsekwencją IIF i desykacji Praca finansowana z grantu KBN 3 P04G 058 23. Adres do korespondencji Corresponding author: Joanna Augustynowicz, Zakład Biochemii Akademii Rolniczej w Krakowie, 31-425 Kraków, al. 29 Listopada 54, e-mail: koloczek@ogr.ar.krakow.pl

4 J. Augustynowicz i in. jest wzrost stęŝenia jonów, co w dalszej kolejności skutkuje wysoleniem i denaturacją białek. ObniŜenie temperatury i desykacja prowadzą równieŝ do zmian w strukturze plazmolemy, m.in. występuje zmiana wartości temperatury przejść fazowych lipidów błonowych, powstania tzw. fazy heksagonalnej II (silnego oddziaływania sąsiadujących grup polarnych lipidów) bądź teŝ separacji faz. W efekcie błona komórkowa przestaje funkcjonować selektywnie następuje wyciekanie elektrolitów, dochodzi do zaburzeń w transporcie do- i zewnątrzkomórkowym. Wreszcie zamraŝanie moŝe powodować mechaniczne uszkodzenia komórek, na skutek efektu objętościowego, zwiększenia objętości wody przy zmianie jej stanu z ciekłego na stały [Wolfe i Bryant 2001, Xie i Timasheff 1997]. Synteza związków osmotycznie czynnych jest strategią stosowaną przez świat Ŝywych organizmów w celu uniknięcia następstw IIF czy desykacji [Kenneth 1997, Wolfe i Bryant 2001]. W grupie tych związków trehaloza zajmuje szczególne miejsce. Ten nietoksyczny dwucukier zbudowany jest z dwóch cząsteczek α-d-glukozy połączonych wiązaniem α (1-1) [Elbein i in. 2003, Richards i in. 2002]. W naturze trehaloza występuje w licznych organizmach róŝnych grup taksonomicznych: bakteriach, grzybach, bezkręgowcach, roślinach (głównie niŝszych) [Clegg 2000, Müller i in. 1995]. Działanie trehalozy opiera się na kilku mechanizmach. Po pierwsze cukier ten w przypadku deficytu wody, czy to na skutek tworzenia lodu czy teŝ dehydratacji, moŝe ją niejako zastępować poprzez tworzenie wiązań wodorowych z białkami i fosfolipidami błon. Związane z trehalozą cząsteczki białek nie tracą w ten sposób swej natywnej struktury i nie tworzą agregatów [Singer i Lindquist 1998, Xie i Timasheff 1997]. Z kolei obecność trehalozy w błonach komórkowych znacznie obniŝa temperaturę przejść fazowych lipidów (T m ). Związane jest to z osłabieniem oddziaływań van der Waalsa pomiędzy acylowymi resztami fosfolipidów. ObniŜenie T m pozwala na zachowanie struktury ciekłokrystalicznej błony pomimo braku wody czy teŝ obniŝenia temperatury [Crowe i in. 1992]. Cukier ten równieŝ, podobnie jak inne sacharydy, bierze udział w witryfikacji, czyli tworzeniu tzw. stanu zeszklenia cytoplazmy (ang. glassy matrix). Cytoplazma w tym stanie charakteryzuje się duŝą lepkością, co skutecznie hamuje powstawanie centrów krystalizacji lodu. Wykazano, iŝ obecność trehalozy, najefektywniej spośród wszystkich cząsteczek cukrów syntetyzowanych w komórkach Ŝywych organizmach, podnosi temperaturę przejścia cytoplazmy ze stanu zeszklenia w stan płynny [Crowe i in. 1998, Crowe 2002]. Przedstawiona poniŝej praca miała na celu wyznaczenie optymalnych parametrów przechowywania biopreparatu przeznaczonego głównie do rozkładu długołańcuchowych związków węglowodorowych, z zastosowaniem trehalozy jako czynnika stabilizującego. Wyznaczenie optymalnych parametrów przechowywania i magazynowania biopreparatu wynika z konieczności jego zastosowania w nagłych przypadkach awarii i katastrof ekologicznych. MATERIAŁ I METODY Przygotowanie biopreparatu W badaniach wykorzystano biopreparat skonstruowany w Zakładzie Biochemii AR w Krakowie słuŝący do biodegradacji związków ropopochodnych, odpadów tłuszczowych oraz innych organicznych pochodnych węglowodorów. Biopreparat ten jest zło- Acta Sci. Pol.

5 Ŝoną mieszaniną organizmów pro- i eukariotycznych [Kaszycki i in. 2000, 2001, 2002]. Mikroorganizmy biopreparatu wzrastały na minimalnym podłoŝu płynnym o składzie: 23 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 1 mm MgSO 4 7H 2 O, 7 mm KH 2 PO 4, 1 mm CaCl 2 5H 2 O (PoCh, Gliwice, Polska), 0,025% pepton kazeinowy (ICN Biomedicals, Inc., USA), 0,025% ekstrakt droŝdŝowy (BTL Sp z o.o., Łódź, Polska). Źródło węgla stanowił 0,5% roztwór złoŝony z mieszaniny oleju napędowego (Eko-diesel), przepracowanego oleju silnikowego oraz nafty świetlnej zmieszanych w stosunku 1:1:1. Hodowlę prowadzono w temperaturze 25 ºC w biofermentorze o pojemności 50 l w warunkach pełnej areacji, przy zastosowaniu systemu minikompresorów. Do eksperymentów pobierano biopreparat znajdujący się w późnej fazie logarytmicznego wzrostu drobnoustrojów. Ilość komórek w 1 ml biopreparatu mieściła się w zakresie od 0,65 do ok. 6 10 9. Inkubacja z trehalozą Trehalozę (ICN Biomedicals, Inc., USA) dodawano do zawiesiny preparatu mikroorganizmów w medium hodowlanym. W trakcie inkubacji biopreparat wytrząsano przy ok. 150 rpm. Inkubację prowadzono w czasie 4 lub 48 godzin, w temperaturze pokojowej. StęŜenia trehalozy w zawiesinie biopreparatu wynosiły 25, 50, 100, 200 i 300 mm. W kaŝdym przypadku wykonywano próbę kontrolną, którą stanowiła próbka drobnoustrojów nie zawierająca trehalozy. Do określenia przeŝywalności komórek bakteryjnych w obecności róŝnych stęŝeń trehalozy stosowano metodę posiewów płytkowych na 2,5% agarze wzbogaconym. Czynniki stresowe W badaniach nad wpływem czynników stresowych komórki biopreparatu inkubowano przez 4 godziny w medium hodowlanym zawierającym 100 mm trehalozy. Pozostałe parametry inkubacji zostały opisane powyŝej. Biopreparat poddawano działaniu trzech grup czynników stresowych: działaniu niskiej temperatury, suszeniu w temperaturze pokojowej oraz liofilizacji. Parametrem określającym wpływ czynnika stresowego na kondycję fizjologiczną bakterii była ich przeŝywalność określona jako procent wyjściowej ilości drobnoustrojów. W celu określenia liczebności wykonywano posiewy płytkowe. Temperatura Biopreparat traktowano niskimi temperaturami: -20 ºC, -70 ºC oraz -196 ºC. Stosowano takŝe kombinacje jednokrotnego zamraŝania w -196ºC, a następnie przechowywania w -20 lub -70 ºC przez okres 2, 7 i 21 dni. Wykonano równieŝ pojedynczą serię doświadczeń związanych z przechowywaniem biopreparatu w temperaturze -20ºC przez okres 5 miesięcy. Po zakończeniu działania niskiej temperatury biopreparat przenoszono do temperatury pokojowej. Próbki odmraŝano w temperaturze pokojowej poprzez dwugodzinne wytrząsanie, ok. 150 rpm i wykonywano test przeŝywalności bakterii. Suszenie pod nawiewem i liofilizacja Suszenie przeprowadzano w temperaturze pokojowej pod nawiewem przez 1 dobę. Biopreparat wirowano (10000 rpm, 15 min), a osad drobnoustrojów poddawano suszeniu. Wysuszony osad zawieszano w wodzie destylowanej do objętości równej objętości wyjściowej i po 2 godzinach wytrząsania (150 rpm) testowano przeŝywalność bakterii znajdujących się w biopreparacie. Liofilizację prowadzono w liofilizatorze Alpha 1-4 Biotechnologia 3(1-2) 2004

6 J. Augustynowicz i in. (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Niemcy) przez 1 dobę. Do liofilizacji uŝywano 0,5 ml próbek drobnoustrojów biopreparatu zawieszonych w medium hodowlanym. Próbki zamraŝano w ciekłym azocie, a następnie natychmiast umieszczano w liofilizatorze pod ciśnieniem 0,35 mbara co, zgodnie z krzywą pręŝności pary nad lodem, odpowiada temperaturze -30 ºC. Na wstępie temperaturę półki zwiększano o 5 ºC co godzinę. Po osiągnięciu przez półkę temperatury -15 do -10 ºC (po 3-4 godzinach od rozpoczęcia liofilizacji) temperaturę półki pozostawiano na stałym poziomie przez 14 16 godzin. W dalszej kolejności ponownie zwiększano temperaturę półki o 5 ºC co godzinę, aŝ do uzyskania temperatury produktu ok. +20 ºC. Po zakończeniu procesu liofilizacji uzyskany liofilizat traktowano jak w przypadku wysuszonego osadu. Metoda posiewów płytkowych Do określenia liczebności (gęstości) komórek bakteryjnych stosowano posiewy płytkowe na 2,5% agarze wzbogaconym (Wytwórnia Surowic i Szczepionek, Biomed, Warszawa, Polska), który stanowił podłoŝe selekcyjne do wzrostu bakterii. Przed posiewem, w celu rozbicia agregatów komórkowych, zawiesinę biopreparatu (0,5ml w probówkach Eppendorfa) poddawano przez 10 min działaniu ultradźwięków (sonifikator UN-2 Unitra/Unima, Olsztyn, Polska). Kolonie liczono po 3 dobach inkubacji w 37 ºC, podając średnią z dwóch powtórzeń. W kaŝdym powtórzeniu wykonywano serię róŝnych rozcieńczeń. Przedstawione w pracy wyniki stanowią średnią z 3 do 4 niezaleŝnych eksperymentów. Odchylenie standardowe dla poszczególnych pomiarów przedstawiono w postaci graficznej na rysunkach. OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW Efekt ochronny trehalozy na działanie czynników stresowych w przypadku układów biologicznych jest znany, jakkolwiek szczegółowy mechanizm oddziaływania tego disacharydu nie jest w pełni wyjaśniony. Przedstawione w niniejszej pracy wyniki mają aspekt praktyczny związany z wyborem optymalnych warunków przechowywania biopreparatu przeznaczonego do degradacji związków ropopochodnych. Biopreparat jest złoŝoną biocenozą, utworzoną z mikroorganizmów pro- i eukariotycznych, aktywnie rozkładającą związki organiczne zawarte w oleju napędowym i benzynach. W jej składzie oznaczono bakterie z rodzaju: Pseudomonas (do 80% liczebności całkowitej), Acinetobacter, Bacillus, Ochrobactrum, Chromobacterium, Citrobacter, Micrococcus, Flavobacterium, Serratia, Alcaligenes, a takŝe droŝdŝe glebowe z rodzaju: Candida i Pichia [Kaszycki i in. 2001]. Dotychczas, według naszej wiedzy, nie przeprowadzano badań związanych z zastosowaniem trehalozy jako czynnika stabilizującego heterogeniczne biopreparaty, zawierające w swym składzie zarówno pro- jak i eukarionty. Test przeŝywalności w obecności róŝnych stęŝeń trehalozy Przeprowadzono testy mające na celu wykluczenie hamującego wpływu trehalozy na rozwój mikroorganizmów biopreparatu. Jakkolwiek dane literaturowe wskazują na korzystny wpływ obecności trehalozy na przeŝywalność monokultur mikroorganizmów w warunkach stresu, konieczne było zweryfikowanie doniesień literaturowych Acta Sci. Pol.

7 w oparciu o badania na zróŝnicowanej biocenozie drobnoustrojów. Testy przeŝywalności w obecności róŝnych stęŝeń trehalozy wykonano równieŝ w celu wyznaczenia optymalnego stęŝenia tego dwucukru do dalszej części eksperymentów. Wykonano serię doświadczeń z 25, 50, 100, 200 i 300 mm stęŝeniami trehalozy. Inkubację prowadzono przez 2 doby. 100 mm stęŝenie trehalozy było najwyŝszym, które nie hamowało przeŝywalności komórek biopreparatu (dane nie prezentowane). Stąd teŝ do dalszych testów wybrano stęŝenie 100 mm, co jest równieŝ zgodne z doniesieniami literaturowymi, dotyczącymi badań nad przeŝywalnością Escherichia coli oraz Bacillus thuringiensis po liofilizacji [Leslie i in. 1995]. Efekt zamroŝenia W pierwszej serii doświadczeń próbki biopreparatu zamraŝano natychmiast przez zanurzenie w ciekłym azocie. Nie zaobserwowano znaczących róŝnic pomiędzy prze- Ŝywalnością komórek biopreparatu w próbach kontrolnych i po inkubacji z trehalozą. W obydwu przypadkach średnia liczebność Ŝywych komórek po ustaniu czynnika stresowego wynosiła ok. 45 50% (rys. 1). Obserwowana dosyć wysoka odporność komórek na natychmiastowe zamroŝenie moŝe być związana z faktem, iŝ nagłe zamroŝenie powoduje gwałtowny wzrost lepkości cytoplazmy, co w konsekwencji minimalizuje prawdopodobieństwo tworzenia centrów krystalizacji lodu w komórce [Wolf i Bryant 2001]. Wydaje się równieŝ, Ŝe znaczący wpływ na wysoką przeŝywalność biocenozy w warunkach szybkiego zamroŝenia moŝe mieć obecność endogennych czynników stabilizujących, wytwarzanych przez drobnoustroje biopreparatu. W przypadku szeregu przebadanych monokultur bakteryjnych, w analogicznych warunkach, przeŝywalność nie przekraczała 10 % (wyniki nie prezentowane). liczebność komórek[% kom.órek [% gęstości początkowej] cell number [% of of the the initial density] 60 50 40 30 20 10 0 kontrola / control trehaloza / trehalose Rys. 1. Wpływ natychmiastowego zamroŝenia w ciekłym azocie na przeŝywalność komórek biopreparatu Fig. 1. The influence of instant freezing in a liquid nitrogen on cell survival Biotechnologia 3(1-2) 2004

8 J. Augustynowicz i in. W drugiej serii eksperymentów biopreparat stopniowo zamraŝano przez umieszczenie w -20 ºC lub -70 ºC, a następnie przechowywano odpowiednio w temperaturze jak wyŝej. Czas przechowywania wynosił 2, 7 i 21 dni oraz 5 miesięcy. Testowano równieŝ przeŝywalność drobnoustrojów po natychmiastowym zamroŝeniu w ciekłym azocie i przechowywaniu preparatu w -20 ºC bądź -70 ºC. Wykazano pozytywny efekt obecności trehalozy na przeŝywalność biopreparatu po zadziałaniu wszystkich rodzajów czynników stresowych. Równocześnie, podobnie jak w serii pierwszej, zaobserwowano korzystny wpływ natychmiastowego zamroŝenia na przeŝywalność próby kontrolnej przechowywanej w niskich temperaturach (rys. 2). Najbardziej korzystny wpływ obecności trehalozy na przeŝywalność biocenozy biopreparatu w warunkach stresu temperaturowego stwierdzono przy przechowywaniu w -20 ºC (rys. 3). Liczba Ŝywych komórek po zakończeniu stresu osiągała tu wartość ok. 20-krotnie większą w przypadku próbki zadanej trehalozą w porównaniu do próbki kontrolnej (obserwacja po 5 miesiącach przechowywania). W badanych warunkach wydłuŝonego czasu przechowywania biopreparatu w obecności trehalozy przeŝywalność komórek bakteryjnych utrzymywała się na wysokim poziomie, osiągającym do 75% początkowej liczebności komórek. liczebność komórek[% gęstości początkowej] cell number quantity[% of the initial density] 35 30 25 20 15 10 5 0 kontrola / control trehaloza / trehalose A B C D Rys. 2. Wpływ obecności trehalozy na przeŝywalność komórek biopreparatu w zaleŝności od sposobu wstępnego zamroŝenia i warunków dalszego przechowywania (7 dni); A zamroŝenie w ciekłym azocie, przechowywanie w -70 ºC, B zamroŝenie i przechowywanie w -70 ºC, C zamroŝenie w ciekłym azocie, przechowywanie w -20 ºC; D zamro- Ŝenie i przechowywanie w -20 ºC Fig. 2. The survival effect of the microbial community in the presence of trehalose in terms of the initial freezing and storage conditions (7 days); A initial liquid nitrogen freezing, storage at -70 ºC; B freezing and storage at -70 ºC, C liquid nitrogen freezing, storage at -20 ºC; D freezing and storage at -20 ºC Acta Sci. Pol.

9 liczebność liczebność komórek[*10 kom.órek 9 [*10 komórek/ 9 komórek/ml] ml] cell number [*10 9 cells/ml] cell number [*10 9 cells / ml] 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 kontrola / control trehaloza / trehalose liczebność początkowa initial cell density 2 dni/2 days 7 dni/7 days 5 miesięcy/5 months Rys. 3. Wpływ obecności trehalozy na przeŝywalność komórek biopreparatu w zaleŝności od czasu przechowywania (temperatura -20 ºC) Fig. 3. The influence of trehalose on the survival of microorganisms measured after various storage time at -20 ºC Powolne obniŝanie temperatury stanowi dla komórek silny stres, związany z indukowaniem przejść fazowych błon komórkowych oraz zmianami struktur białek cytoplazmy. Podczas stopniowego zamarzania dochodzi do zmiany stanu lipidów błonowych z ciekłokrystalicznego w Ŝel. Wzrost temperatury prowadzi do procesu odwrotnego. Ponadto, wraz ze spadkiem temperatury następuje obniŝenie potencjału wody w komórce. W efekcie dochodzi do nieodwracalnych uszkodzeń protoplastu [Crowe i in. 1998]. W takim przypadku obecność trehalozy w komórkach wykazuje spektakularny efekt protekcyjny. Po pierwsze, trehaloza powoduje znaczne obniŝenie temperatury przejść fazowych lipidów błonowych. Po drugie, dwucukier ten bierze udział w procesie witryfikacji cytoplazmy (porównaj wstęp). Po trzecie wreszcie, trehaloza wpływa na wzrost ciśnienia osmotycznego w protoplaście, co zapobiega utracie wody z komórki, w momencie gdy jej dostępność zmniejsza się na skutek zewnątrzkomórkowego zamarzania. W sytuacji długoterminowego magazynowania biopreparatu w znacznych objętościach zamraŝanie w obecności trehalozy w temperaturze -20 ºC wydaje się bardzo obiecującym sposobem przechowywania. Dehydratacja Dehydratację mikroorganizmów biopreparatu prowadzono w dwojaki sposób. Pierwszy z nich polegał na suszeniu zagęszczonego biopreparatu (osadu mikroorganizmów), pod nawiewem, w temperaturze pokojowej. Drugi ze sposobów wiązał się z usuwaniem wody z komórek poprzez jej sublimację w procesie liofilizacji. Liofilizacja stanowiła podwójny czynnik stresowy, związany z obniŝeniem temperatury, połączony z utratą wody. Obecność trehalozy, podobnie jak przy oddziaływaniu niską temperaturą, Biotechnologia 3(1-2) 2004

10 J. Augustynowicz i in. istotnie zwiększała przeŝywalność mikroorganizmów biopreparatu w procesie liofilizacji. W przypadku suszenia biopreparatu w temperaturze pokojowej pod nawiewem stwierdzono ok. 3-krotny wzrost przeŝywalności komórek biopreparatu w stosunku do kontroli. Dla komórek liofilizowanych stosunek ten wynosił ponad 20. Równolegle zaobserwowano, iŝ liofilizacja przy braku trehalozy była procesem znacznie bardziej letalnym dla biocenozy biopreparatu (rys. 4). W handlu dostępnych jest szereg preparatów biologicznych w postaci sproszkowanej o róŝnej aktywności. Przywrócenie ich pełnej efektywności wymaga często długotrwałej preinkubacji po zawieszeniu w wodzie. Zaprezentowane na rysunku 4 wyniki wskazują, Ŝe badany biopreparat w obecności trehalozy cechuje się, w stosunku do kontroli, wysoką przeŝywalnością komórek bezpośrednio po uwodnieniu. Mechanizm pozytywnego wpływu trehalozy na przeŝywalność mikroorganizmów poddanych dehydratacji, podobnie jak dla stresu temperaturowego, moŝe być tłumaczony udziałem tego disacharydu w stabilizacji białek i lipidów błonowych. Wydaje się, iŝ tak przygotowany i przechowywany biopreparat mógłby być zastosowany w przypadku nagłych awarii, podczas których istnieje konieczność szybkiego podjęcia prac nad rekultywacja skaŝonego terenu. liczebność komórek [% gęstości początkowej] cell liczebność number komórek [% of the [% initial gęstości density] początkowej] cell number [% of the initial density] 25 20 15 10 5 0 kontrola / control trehaloza / trehalose liofilizacja freeze-drying suszenie dehydration Rys. 4. Wpływ obecności trehalozy na przeŝywalność komórek biopreparatu poddanych liofilizacji oraz suszeniu w temperaturze pokojowej Fig. 4. The influence of trehalose on the survival of microorganisms subjected either to freeze- -drying or dehydration at room temperature ZaleŜność wpływu trehalozy od początkowej gęstości biopreparatu W trakcie badań otrzymano interesujący wynik zaleŝności przeŝywalności biocenozy w obecności 100 mm trehalozy od początkowej gęstości biomasy (rys. 5). Stwierdzono korelację pomiędzy gęstością komórek uŝytych do doświadczenia a pozytywnym wpływem obecności trehalozy na przeŝywalność komórek poddanych działaniu stresu temperaturowego. ZaleŜność tę wykazano niezaleŝnie dla wszystkich eksperymentów Acta Sci. Pol.

11 obejmujących stres temperaturowy. NajwyŜszy wskaźnik pozytywnego oddziaływania trehalozy na kondycję komórek biopreparatu zaobserwowano dla gęstości początkowej 1,5 10 9 komórek/ml, po dwóch dobach zamraŝania w -20 ºC (rys. 5). Podobną zaleŝność zaobserwowali równieŝ Wolkers i in. [2001] w badaniach nad płytkami krwi. NajwyŜszą przeŝywalność tych komórek po liofilizacji notowano dla gęstości wyjściowej 3 10 8 płytek/ml. PowyŜsze obserwacje sugerują podjęcie dalszych prac nad optymalizacją gęstości komórek podczas przygotowania biopreparatu do magazynowania, jak równieŝ otwierają perspektywy badań nad molekularnymi mechanizmami interakcji tego disacharydu z komórkami. liczebność kom.órek [% gęstości początkowej] cell number [% of the initial density] Rys. 5. Korelacja pomiędzy ochronnym efektem obecności trehalozy a początkową gęstością komórek (-20 ºC, 7 dni) Fig. 5. Correlation between the protective effect of trehalose and the initial density of cells subjected to stress factors (-20 ºC, 7 days) PIŚMIENNICTWO Clegg J.S., 2001. Cryptobiosis a peculiar state of biological organization. Comp. Biochem. Physiol. 128B, 613-624. Crowe J.H, Hoekstra F.A., Crowe L.M., 1992. Anhydrobiosis. Annu. Rev. Physiol. 54, 579-599. Crowe J.H., Carpenter J.F., Crowe L.M., 1998. The role of vitrification in anhydrobiosis. Annu. Rev. Physiol. 60, 73-103. Crowe L.M., 2002 Lessons from nature: the role of sugars in anhydrobiosis. Comp. Biochem. Physiol. 131A, 505-513. Elbein A.D., Pan Y.T., Pastuszak I., Carroll D., 2003. New insights on trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology 13, 17R-27R. Biotechnologia 3(1-2) 2004

12 J. Augustynowicz i in. Kaszycki P., Solecki T., Krawczyk A., Kołoczek H., 2000: Optymalizacja metod biologicznego oczyszczania zaolejonych gruntów. InŜynieria Ekologiczna 2, Technologie odolejania gruntów, odpadów, ścieków 40-47. Kaszycki P., Szumilas P., Kołoczek H., 2001. Biopreparat przeznaczony do likwidacji środowiskowych skaŝeń węglowodorami i ich pochodnymi. InŜynieria Ekologiczna 4, Biopreparaty w ochronie i uŝytkowaniu środowiska, 15-22. Kaszycki P., Krawczyk A., Kołoczek H., 2002. Stan i perspektywy biodegradacji ropopochodnych zanieczyszczeń w glebach południowej części Polski. InŜynieria Ekologiczna 7, Ekoin- Ŝynieria dla Ekorozwoju, 15-22. Kenneth B.S., 1997. Organic solutes in freezing tolerance. Comp. Biochem. Physiol. 117A, 319-326. Leslie S., Israeli E., Lighthart B., Crowe J.H., Crowe L.M., 1995. Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying. Appl Environ. Microbiol. 61, 3592-3597. Müller J., Boller T., Wiemken A., 1995. Trehalose and trehalase in plants: recent developments. Plant Science 112, 1-9. Richards A.B., Krakowka S., Dexter L.B., Schmid H., Wolterbeek A.P.M., Waalkens-Berendsen D.H., Arai S., Kurimoto M., 2002. Trehalose: a review of properties, history of use and human tolerance, and results of multiple safety studies. Food and Chemical Toxicology 40, 871-898. Schiraldi C., Di Lernia I., De Rosa M., 2002. Trehalose production: exploiting novel approches. Trends Biotechnol. 20, 420-425. Singer M.A., Lindquist S., 1998. Thermotolerance in Saccharomyces cerevisiae: the Yin and Yang of trehalose. Trends Biotechnol. 16, 460-468. Wolfe J., Bryant G., 2001. Cellular Cryobiology: thermodynamic and mechanical effects. International Journal of Refrigeration 24, 438-450. Wolkers W.F., Walker N.J., Tablin F., Crowe J.H., 2001. Human platelets loaded with trehalose survive freeze-drying. Cryobiology 42, 79-87. Xie G., Timasheff S.N., 1997. The termodynamic mechanism of protein stabilisation by trehalose. Biophys. Chem. 64, 25-43. INFLUENCE OF TREHALOSE ON THE STABILITY OF MICROBIAL COMMUNITIES USED FOR DEGRADATION OF PETROLEUM DERIVATIVES Abstract. In order to optimize the storage conditions of heterogeneous microbial community, the trehalose influence on the survival of bacteria and yeast cells was studied. It was shown that trehalose increases survival about 20 fold at -20ºC as compared to the control sample. Dehydration and desiccation lethal effect on the community in the presence of trehalose was significantly smaller in terms of cell viability. The dependence of the initial cell density of studied biocenoses on microbial survival in the presence of the disaccharide was revealed. Key words: dehydration, desiccation, freeze-drying, freezing, microbial communities, petroleum derivatives Zaakceptowano do druku Accepted for print: 10.12.2004 Acta Sci. Pol.