ĆWICZENIA LABORATORYJNE Z BIOCHEMII

ĆWICZENIA LABORATORYJNE Z BIOCHEMII 2016/2017 semestr zimowy

Literatura pomocna w przygotowywaniu sie do ćwiczeń z biochemii: 1. J.M. Berg, J. L. Tymoczko, L. Stryer:,,Biochemia" Wydawnictwo Naukowe PWN, W-wa 2005 (starsze wydanie 1998 r.) 2. L. Kłyszejko-Stefanowicz:,,Ćwiczenia z biochemii" Wydawnictwo Naukowe PWN. (W-wa 2005 (starsze wydanie 1999 r.) 3. B. D. Hames, N. M. Hooper, J. D. Houghton "Krótkie wykłady: Biochemia" Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2002 Uwaga! Na wszystkich ćwiczeniach z biochemii obowiązuje znajomość przeliczania stężeń

REGULAMIN ĆWICZEŃ Z BIOCHEMII 1. Ćwiczenia laboratoryjne z Biochemii prowadzone są w formie 7 ćwiczeń. 2. Student ma obowiązek przygotować się samodzielnie do ćwiczeń z zagadnień oraz przebiegu ćwiczenia podanych w instrukcji. Student ma obowiązek posiadać instrukcję opisującą dane ćwiczenie na zajęciach. 3. Student ma obowiązek nosić fartuch przebywając w Sali laboratoryjnej. 4. W przypadku braku fartucha lub/i instrukcji do danego ćwiczenia Student nie będzie miał możliwości uczestniczyć w zajęciach. 5. Obecność na ćwiczeniach jest obowiązkowa. 6. W przypadku nieobecności (np. choroba), Student ma obowiązek dostarczyć na kolejnych zajęciach Prowadzącemu stosowne usprawiedliwienie (zwolnienie lekarskie, opatrzone datą, pieczątką i podpisem lekarza). Dopuszczalna jest 1 usprawiedliwiona nieobecność w semestrze. 7. W przypadku nieobecności, istnieje możliwość odrobienia danego ćwiczenia z inną grupą (o ile liczba osób w danej grupie nie przekroczy 12), ale tylko po wcześniejszym uzgodnieniu z Prowadzącym. 8. Za każde wykonane ćwiczenie Student otrzymuje ocenę, na którą składa się: a. ocena ze sprawdzianu z materiału obejmującego część teoretyczną i zagadnienia podane w instrukcji; - sprawdzian może odbyć się przed rozpoczęciem części doświadczalnej (wejściówka) lub w trakcie trwania ćwiczenia (w zależności od przebiegu ćwiczenia). - uzyskana ocena ze sprawdzianu jest oceną ostateczną, nie ma możliwości poprawy oceny w innym terminie - na podstawie oceny ze sprawdzianu wystawiana jest ocena końcowa za ćwiczenie b. poprawne wykonanie części doświadczalnej ćwiczenia, aktywność - Student może uzyskać dodatkowy punkt za aktywność na zajęciach, wiedzę dodatkową na dany temat oraz za aktywny udział w dyskusji, co może wpłynąć na podwyższenie oceny za ćwiczenie. - Student może również stracić punkt, w przypadku wyjątkowej bierności i nieprzygotowania do zajęć, co może wpłynąć na obniżenie końcowej oceny za ćwiczenie. c. zaliczenie sprawozdania z ćwiczenia z poprawnymi wnioskami. - Student ma obowiązek wykonać sprawozdanie z wykonanego ćwiczenia wg wskazówek Prowadzącego. Sprawozdanie należy oddać na kolejnych zajęciach. Błędnie wykonane sprawozdanie może być jeden raz zwrócone do Studenta w celu poprawy. Poprawione sprawozdanie należy oddać na następnych zajęciach. Nie oddanie sprawozdania lub jego poprawy w terminie, niepoprawne wykonanie sprawozdania (brak uwzględnienia wskazówek Prowadzącego) skutkuje niezaliczeniem ćwiczenia i otrzymaniem oceny 2.0. 9. Zajęcia kończą się kolokwium, obejmującym całość materiału ze wszystkich ćwiczeń. Kolokwium zostanie przeprowadzone po zakończeniu wszystkich ćwiczeń, w terminie ustalonym przez Koordynatora ćwiczeń. 10. Student może zostać zwolniony z kolokwium końcowego jeśli średnia ocen cząstkowych z każdego ćwiczenia wyniesie co najmniej 3.0. 11. W przypadku nieobecności usprawiedliwionej, Student ma obowiązek napisać sprawdzian z danego ćwiczenia, w terminie ustalonym po konsultacji z Prowadzącym ćwiczenie. Ocena ze sprawdzianu jest oceną końcową z danego ćwiczenia. 12. W przypadku nieobecności nieusprawiedliwionej, Student nie ma możliwości napisania sprawdzianu z danego ćwiczenia, a ćwiczenie uważa się za niezaliczone i nie wystawiana jest za nie ocena. Ćwiczenie jest jednak brane pod uwagę przy obliczaniu średniej oceny końcowej (za ćwiczenie niezaliczone z powodu nieobecności nalicza się 0, a sumę ocen cząstkowych z pozostałych ćwiczeń dzieli się przez 7).

13. Podstawą zaliczenia przedmiotu na ocenę pozytywną jest pozytywna ocena z kolokwium końcowego lub średnia ocen cząstkowych min. 3.0 14. Po zakończonych zajęciach obowiązkiem każdego Studenta jest uporządkowanie stanowiska pracy. 15. Student może opuścić salę laboratoryjną tylko na wyraźną zgodę Prowadzącego. Opuszczając salę ćwiczeń Student powinien zdjąć fartuch laboratoryjny. 16. Wszelkie pytania dotyczące organizacji ćwiczeń, proszę kierować do Koordynatora. Koordynator : dr inż. Karolina Stojowska-Swędrzyńska pokój 329A karolina.stojowska@biol.ug.edu.pl

I. IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO Escherichia coli METODĄ LIZY ALKALICZNEJ. ELEKTROFOREZA DNA W ŻELU AGAROZOWYM. I. WSTĘP TEORETYCZNY Kwasy nukleinowe (DNA i RNA) są polinukleotydami. Nukleotydy są zbudowane z zasady azotowej, cząsteczki cukru (pentozy) oraz reszty kwasu fosforowego. Zasadami azotowymi występującymi w DNA są puryny (adenina i guanina) oraz pirymidyny (cytozyna i tymina). W RNA zamiast tyminy występuje uracyl. Cukrem wchodzącym w skład DNA jest deoksyryboza, a w RNA ryboza. Zasady połączone wiązaniem N-glikozydowym z rybozą lub deoksyrybozą tworzą nukleozydy. Nukleozydy z resztą kwasu fosforowego tworzą nukleotydy. Poszczególne nukleotydy połączone są ze sobą wiązaniami fosfodiestrowymi. Kwas rybonukleinowy występuje z reguły w postaci jednoniciowej, ale niektóre cząsteczki RNA zawierają odcinki komplementarne, co umożliwia tworzenie wewnątrzcząsteczkowych rejonów dwuniciowych. Natomiast DNA jest helisą, zbudowaną z dwóch owiniętych wokół siebie łańcuchów biegnących antyrównolegle. Na zewnątrz helisy DNA występuje rdzeń fosforanowo-cukrowy, a wewnątrz znajdują się zasady, między którymi tworzą się wiązania wodorowe. Adenina tworzy komplementarną parę z tyminą (dwa wiązania wodorowe), a guanina z cytozyną (trzy wiązania wodorowe). W komórkach eukariotycznych (jądrzastych) DNA występuje głównie w jądrze komórkowych oraz w małych ilościach w chloroplastach i mitochondriach. DNA w jądrze jest liniowy i upakowany w postaci chromosomów. W komórkach prokariotycznych (bezjądrzastych) DNA występuje w cytoplazmie, ma postać kolistą (zamkniętą), nazywany jest nukleoidem lub chromosomem bakteryjnym. DNA chromosomu bakteryjnego przyjmuje postać negatywnie skręconej superhelisy i tworzy kompleksy z białkami podobnymi do histonów. Komórki bateryjne mogą zawierać dodatkowe, niewielkie cząsteczki DNA, replikujące się niezależnie od chromosomu, nazywane plazmidami. Plazmidy mogą występować w kilku (niskokopijne) lub w wielu (wysokokopijne) kopiach w komórce. Zawierają one najczęściej kilka genów, w tym gen (geny) warunkujące oporność na antybiotyki. W inżynierii genetycznej plazmidy są często wykorzystywane jako wektory w klonowaniu. Plazmidy są kolistymi cząsteczkami DNA przyjmującymi formę superheliksu. Superzwinięta, kowalencyjnie zamknięta, kolista cząsteczka DNA nazywana jest formą CCC (ang. covalently closed circular DNA). Jeśeli jedna z nici DNA zostanie przerwana, znikają superskręty i powstaje forma OC (ang. open circular). Po pęknięciu obu nici DNA w tym samym miejscu powstaje cząsteczka liniowa L (ang. linear). Izolacja plazmidowego i chromosomalnego DNA z komórek prokariotycznych i eukariotycznych wymaga odmiennych technik. Obecnie istnieje wiele metod pozyskiwania DNA, których celem jest odseparowanie materiału genetycznego od innych składników komórki i jego ochrona przed degradacją

przez enzymy komórkowe. Techniki oczyszczania DNA muszą być wystarczająco łagodne, by nie spowodować uszkodzeń mechanicznych łańcucha DNA. Różnice w procedurach izolacji DNA plazmidowego i DNA genomowego są zależne od ich różnych mas cząsteczkowych, pierwszo- i drugorzędowej struktury i z superzwinięcia DNA plazmidowego. Metody izolacji DNA plazmidowego są znane od ponad 30 lat i do dziś powstało ich kilkanaście, mimo to większość z nich składa się z podobnych etapów: namnożenie bakterii, liza komórek i oczyszczanie DNA plazmidowego. Najlepsze są te, które charakteryzują się dużą efektywnością, pozwalającą na uzyskanie czystego preparatu o wysokim stężeniu i pochłaniają niewiele czasu. Jednym z najbardziej popularnych sposobów izolacji DNA plazmidowego jest metoda lizy alkalicznej znana od 1979 roku (Birnboim i Doly). Metoda ta wykorzystuje fakt występowania DNA plazmidowego w formie superzwiniętej (CCC). W tej metodzie można wyróżnić trzy etapy: zawieszenie komórek w buforze obniżającym wytrzymałość ściany komórkowej i hamującym działanie DNaz, zniszczenie komórek, degradacja RNA, odwracalna denaturacja kwasów nukleinowych i nieodwracalna denaturacja białek, denaturacja plazmidowego DNA i oddzielenie go od sprecypitowanego chromosomalnego DNA i wytrąconych białek. Najpierw niszczy się ścianę komórkową, następnie doprowadza się do lizy komórek bakteryjnych przez dodanie roztworu zawierającego detergent SDS (dodecylosiarczan sodu) i NaOH. SDS powoduje zniszczenie błon komórkowych i denaturację białek, natomiast wysokie ph (ok. 12) powoduje denaturację DNA do pojedynczych nici, przy czym forma superzwinięta DNA plazmidowego jest nadal spleciona (nici podwójnej helisy nie oddalają się zbytnio od siebie). Obniżenie ph (neutralizacja) poprzez dodanie stężonego roztworu octanu potasu prowadzi do precypitacji (wytrącania) genomowego DNA, ponieważ w tych warunkach renaturacja tak długich fragmentów DNA nie jest możliwa (przypadkowa hybrydyzacja dwóch komplementarnych nici prowadzi do powstania strątów). Ponadto w tych warunkach następuje również precypitacja białek i tego RNA, które nie uległo hydrolizie z udziałem RNAazy obecnej w buforze do zawieszania komórek. Superzwinięte DNA plazmidowe bardzo szybko renaturuje ze względu na bliskość komplementarnych nici i pozostaje w roztworze. Wirowanie umożliwia oddzielenie supernatantu zawierającego plazmidy od wytrąconego kompleksu. W celu pozbycia się reszty białek stosuje się ekstrakcję mieszaniną fenol:chloroform:alkohol izoamylowy lub samym chloroformem. DNA zagęszcza się przez wytrącenie 96% etanolem. Osad przepłukuje się 70% etanolem, żeby pozbyć się soli. Po odwirowaniu osad DNA rozpuszcza się w buforze TE, zawierającym EDTA, który chelatuje jony Mg 2+ niezbędne do aktywności nukleaz degradujących DNA. Elektroforeza jest techniką wykorzystującą przemieszczanie się cząstek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym. Technika ta, wykorzystywana przez biochemików i biologów molekularnych od ponad 50 lat, jest szczególnie przydatna do rozdziału, charakterystyki, analizy i oczyszczania kwasów nukleinowych. Fragmenty DNA rozdzielone w żelu agarozowym można wykorzystać do innych technik biologii molekularnej np. do ligacji.

Żele agarozowe stosuje się najczęściej w zakresie stężeń od 0,3% do 2%. Procentowość żelu dobiera się do wielkości rozdzielanych cząsteczek DNA. Fragmenty DNA o długości mniejszej niż 500 pz zazwyczaj rozdziela się na żelach poliakrylamidowych. Najczęściej stosowanymi buforami w elektroforezie agarozowej są bufory TAE (Tris-acetate-EDTA), TBE (Tris-borate-EDTA), TPE (Tris-phosphate-EDTA). Do nanoszenia próbek na żel służą odpowiednie bufory (tzw. bufory obciążające), zwiększające gęstość próbek, dzięki czemu nie dyfunduje ona do buforu, w którym prowadzi się elektroforezę, lecz opada na dno studzienki. Dodatkowo bufor do nanoszenia nadaje próbkom zabarwienie, umożliwiając obserwację ich migracji podczas rozdziału w żelu. Najczęstszym składnikiem buforów do nanoszenia jest błękit bromofenolowy, nadający niebieskie zabarwienie, a czynnikiem zwiększającym gęstość sacharoza lub glicerol. DNA w żelu agarozowym migruje w kierunku elektrody dodatniej ze względu na ujemnie naładowanie reszt fosforanowych. Szybkość migracji DNA zależy m.in. od: stężenia żelu, składu i siły jonowej buforu elektrodowego, natężenia pola elektrycznego oraz wielkości i konformacji kwasu nukleinowego. Mniejsze liniowe cząsteczki DNA migrują szybciej niż większe. Jednak nawet jeśli cząsteczki mają tę samą masę, mogą poruszać się z różną szybkością ze względu na różnice w konformacji. W żelach agarozowych ruchliwość elektroforetyczna kwasów nukleinowych nie zmienia się w istotny sposób w zależności od składu zasad i temperatury rozdziału. Formy plazmidowego DNA (CCC, OC, L) mają odmienną konformację przestrzenną, zatem mimo tej samej masy migrują z różną szybkością. W buforze TAE najszybciej migruje forma CCC, potem forma liniowa i OC. Położenie fragmentów DNA po rozdziale w żelu agarozowym można określić po wybarwieniu DNA bromkiem etydyny. Jest to barwnik fluorescencyjny, który interkaluje między zasady i świeci w świetle UV. W celu wybarwienia DNA bromek etydyny można dodawać bezpośrednio do roztworu agarozy przed zastygnięciem lub barwić żel dopiero po zakończonym rozdziale. II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA: 1. Budowa kwasów nukleinowych DNA i RNA (model budowy DNA Watsona-Cricka, pojęcia nukleotyd, nukleozyd, obowiązuje znajomość wzorów chemicznych; różnice w budowie DNA i RNA). 2. DNA jako nośnik informacji genetycznej (definicja genu, powstawanie mutacji) 3. Metody przekazywania plazmidowego DNA u bakterii (transformacja, transdukcja, koniugacja). 4. Organizacja DNA w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych. 5. Ogólny przebieg replikacji DNA w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych (etapy, enzymy uczestniczące w replikacji). 6. Rodzaje i funkcje RNA. 7. Plazmidy (pojecie, funkcje, cechy). 8. Elektroforeza agarozowa DNA (cel, zasada rozdziału).

III. APARATURA I SZKŁO LABORATORYJNE 1. Mikrowirówka (jedna na grupę) 2. Probówki typu Eppendorf 3. Łaźnia lodowa / lód 4. Pipety automatyczne (2-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) 5. Końcówki do pipet automatycznych (żółte: do 2-20 µl, 20-200 µl i niebieskie: do 200-1000 µl) 6. Aparat do elektroforezy agarozowej (jeden na grupę) 7. Zasilacz prądu stałego 8. Transiluminator IV. ODCZYNNIKI 1. Sol I: 2. Sol II: 50 mm glukoza 25 mm Tris-HCl (ph 8.0) 10 mm EDTA (ph 8.0) 0.2N NaOH 1% SDS UWAGA! Roztwór przygotowuje sie bezpośrednio przed użyciem. 3. Sol III: 4. Chloroform 3MK + 5M CH 3 COO - 5. 96 % i 70 % roztwory etanolu 6. Bufor TE o składzie: 7. Agaroza 8. TAE o składzie: 10 mm Tris-HCl (ph 8.0) 1 mm EDTA 40 mm Tris-octan ph 8.0 1 mm EDTA 9. Bufor obciążający do elektroforezy DNA o składzie: 0.25% błękit bromofenolowy 40% sacharoza 10. Wodny roztwór bromku etydyny (5 mg/ml) 11. Roztwór plazmidu wzorcowego V. WYKONANIE ĆWICZENIA A. IZOLACJA PLAZMIDOWEGO DNA 1. Osad z 3 ml hodowli bakteryjnej E. coli zawierających plazmid zawiesić w 0. l ml buforu Sol I. 2. Inkubować w lodzie przez 5 min. 3. Dodać 0.2 ml schłodzonego w lodzie roztworu Sol II.

4. Delikatnie wymieszać przez 3-4-krotne odwrócenie probówki. 5. Inkubować w lodzie przez 5 min. 6. Dodać 0.15 ml schłodzonego w lodzie roztworu Sol III. 7. Delikatnie wymieszać jak w p.5. 8. Inkubować w lodzie przez 5 min. 9. Odwirować przez 10 min w mikrowirówce przy max. obrotach/min. 10. Przenieść supernatant do nowej probówki typu Eppendorf, osad wyrzucić. 11. Dodać równą objętość chloroformu. -. 12. Ekstrahować 2-3 min odwracając probówkę, 13. Próby odwirować przez 5 min w mikrowirówce przy max. obrotach/min. 14. Zebrać górną fazę i przenieść do nowej probówki. Uważać, aby nie pobrać zdenaturowanych białek z interfazy. 15. Dodać 2-krotną. objętość 96 % r-ru etanolu.... 16. Dokładnie wymieszać przez 3-4-krotne odwrócenie probówki. 17. Inkubować przez 10 min w -70 C. 18. Próbę odwirować w mikrowirówce przez 15 min. przy max. obrotach/min. 19. Supernatant odrzucić. 20. Osad zawierający DNA przemyć 1 ml 70 % r-ru etanolu. 21. Odwirować 10 min. 22. Ostrożnie usunąć supernatant. 23. Osad wysuszyć i rozpuścić w 20 µl buforu TE. B. ELEKTROFOREZA AGAROZOWA DNA 1. Przygotować aparat do elektroforezy. 2. Przygotować 1 % agarozę w buforze TAE (rozpuścić przez ogrzanie do wrzenia). 3. Do roztworu agarozy dodać bromek etydyny do stężenia 0,5 µg/ml. 4. Roztwór agarozy o temp. 45-50 C wlać do aparatu. 5. Pozostawić do zastygnięcia. 6. Do preparatu DNA dodać 4 µl buforu obciążającego. 7. 15 µl próbki nanieść do studzienki w żelu. 8. Przeprowadzić rozdział elektroforetyczny DNA przy napięciu 70-80V przez 30-40 min. 9. Oglądać żel w świetle UV. Uwaga! Bromek etydyny jest bardzo silnym środkiem mutagennym, wszystkie czynności powinny być wykonywane w rękawiczkach. VI. WYNIKI I WNIOSKI 1. Opisać etapy oczyszczania plazmidowego DNA (rola poszczególnych roztworów i ich składników) 2. Zinterpretować obraz rozdziału elektroforetycznego DNA plazmidowego. Opisać poszczególne ścieżki, wskazać różne formy plazmidowego DNA (o ile widoczne).

II. ELEKTROFOREZA BIAŁEK I REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE AMINOKWASÓW I. WSTĘP Białka zbudowane są z 20 aminokwasów o ogólnym wzorze: Centralnie położony atom węgla α (Cα) jest połączony z grupą aminową, grupą karboksylową, atomem wodoru i łańcuchem bocznym (grupa R). Wyjątkiem jest prolina, która zawiera drugorzędową grupę aminową. Łańcuch boczny może zawierać dodatkowe grupy aminowe, karboksylowe, karboksymidowe, tiolowe, tioeterowe, hydroksylowe lub pierścienie aromatyczne. Własności chemiczne wspólne wszystkim aminokwasom są uwarunkowane obecnością grupy karboksylowej i aminowej. Natomiast różnice w budowie łańcucha bocznego decydują o specyficznych własnościach fizykochemicznych i reaktywności aminokwasów. Dzięki temu niektóre aminokwasy dają charakterystyczne reakcje barwne, umożliwiające ich wykrywanie nawet w mieszaninie z innymi aminokwasami. Poszczególne aminokwasy w białku są połączone wiązaniami peptydowymi, które powstają miedzy grupą α-karboksylową jednego aminokwasu i grupą α-aminową następnego aminokwasu. Wiązanie peptydowe prawie zawsze występuje w konfiguracji trans. Liniowa sekwencja aminokwasów jest nazywana pierwszorzędową strukturą białka. Struktura drugorzędowa odnosi sie do regularnego pofałdowania rejonów łańcucha polipeptydowego. Najczęściej występującymi typami struktury drugorzędowej są helisa α i harmonijka β, istnieją również struktury typu wstęga-zwrot-wstęga oraz pętle. Struktura trzeciorzędowa oznacza przestrzenne ułożenie wszystkich aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Odpowiada ona natywnej, biologicznie aktywnej konformacji białka. Struktura czwartorzędowa dotyczy białek zbudowanych z co najmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych i oznacza przestrzenne ułożenie podjednostek polipeptydowych oraz określa oddziaływania miedzy nimi. Białka oprócz reakcji charakterystycznych dla łańcuchów bocznych wchodzących w ich skład aminokwasów, mogą dawać specyficzne reakcje dzięki obecności wiązań peptydowych. (

Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek 1. Reakcja na obecność cysteiny i cystyny - w środowisku silnie zasadowym z grupy tiolowej cysteiny lub ugrupowania disiarczkowego cystyny odszczepia się siarkowodór, który następnie reaguje z octanem ołowiawym i jest wytrącany w postaci czarnego, nierozpuszczalnego siarczku ołowiu. 2. Reakcja ksantoproteinowa - aminokwasy zawierające pierścień aromatyczny (fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna) zarówno wolne, jak i związane w białku, ulęgają nitrowaniu podczas ogrzewania ze stężonym kwasem azotowym. Żółte pochodne nitrowe w środowisku zasadowym tworzą sole o intensywnym zabarwieniu pomarańczowym. 3. Reakcja Hopkinsa i Cole'a - reakcja na obecność układu indolowego (w tryptofanie). W środowisku kwaśnym tryptofan reaguje z aldehydami (np. kwasem glioksalowym) dając barwny produkt kondesacji. W kwaśnych hydrolizatach peptydów i białek wynik reakcji jest ujemny ponieważ podczas kwaśnej hydrolizy tryptofan ulega zniszczeniu. 4. Reakcja na obecność histydyny - pierścień imidazolowy histydyny w środowisku zasadowym ulega sprzęganiu z jonem p-sulfobenzodiazoniowym. Produktem reakcji jest pomarańczowy barwnik azowy. 5. Reakcja ninhydrynowa - służy do wykrywania wolnych aminokwasów (peptydy i białka dają bardzo słaby odczyn). W ph>4 aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają najpierw utlenieniu a następnie dekarboksylacji i deaminacji. W obecności powstałego amoniaku zredukowana cząsteczka ninhydryny ulega kondesacji z utlenioną cząsteczką ninhydryny i powstaje charakterystyczny fioletowoniebieski produkt. Natężenie zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia aminokwasu. W przypadku aminokwasów - proliny i hydroksyproliny, które nie zawierają grupy α aminowej produkt reakcji kondensacji ma barwę żółtą. 6. Reakcja biuretowa - pozwala na odróżnienie białek od aminokwasów. W środowisku zasadowym następuje tautomeryzacja grup przy wiązaniu peptydowym ( -CO-NH- -C(OH)=N- ). Z sąsiadującymi ze sobą ugrupowaniami tego typu jony miedziowe tworzą kompleksy o barwie fioletowej. Wolne aminokwasy tworzą również kompleksy z jonami miedziowymi ale produkty takiej reakcji mają barwę niebieską. Dzięki obecności grup dysocjujących, aminokwasy i białka posiadają ładunek elektryczny, co jest podstawą ich rozdziału w procesie elektroforezy. Elektroforeza polega na ruchu naładowanych cząsteczek umieszczonych w polu elektrycznym, w środowisku przewodzącym, w kierunku odpowiednich elektrod. Szybkość migracji białka w polu elektrycznym zależy od natężenia pola elektrycznego, wypadkowego ładunku cząsteczki i współczynnika tarcia. Elektroforezę białek można przeprowadzić w żelach poliakrylamidowych (PAGE), które działają jak sito molekularne. Cząsteczki o wymiarach małych w stosunku do wielkości porów żelu migrują łatwo, natomiast bardzo duże cząsteczki pozostają prawie nieruchome. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym zawierającym SDS (SDS-PAGE) umożliwia rozdział białek na podstawie różnic w ich masach cząsteczkowych. Białka przed naniesieniem na żel denaturuje się, dzięki dodaniu SDS i czynnika redukującego. SDS (siarczan dodecylu) jest anionowym detergentem, który zrywa prawie (

wszystkie wiązania niekowalencyjne w białku oraz wiąże się z białkami nadając im wypadkowy ładunek ujemny, proporcjonalny do masy cząsteczkowej. Wiązania dwusiarczkowe są zrywane dzięki działaniu czynnika redukującego (β-merkaptoetanol lub ditiotretiol). Ruchliwość elektroforetyczna jest liniowo odwrotnie proporcjonalna do logarytmu masy. Białka o mniejszej masie cząsteczkowej migrują szybciej. Najczęściej stosowaną metodą detekcji białek po rozdziale w żelu poliakrylamidowym jest barwienie kwaśnym alkoholowym roztworem Coomassie Brilliant Blue. Zastosowanie kwaśnego alkoholowego roztworu powoduje utrwalenie białek w żelu, co zapobiega ich wymywaniu. W wiązaniu barwnika z białkami uczestniczą wiązania van der Waalsa i wiązania jonowe. Tą metodą można wykryć 0,1-1 µg białka. Znacznie czulszą metodą jest barwienie przy użyciu AgNO 3. SDS-PAGE jest szeroko stosowaną techniką rozdziału białek. Można ją stosować m. in. do badania jednorodności preparatu lub wyznaczania masy cząsteczkowej białek. II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA 1. Aminokwasy: budowa chemiczna- wzory, podział uwzględniający rożną polarność grup R, tworzenie wiązania peptydowego, jony obojnacze, punkt izoelektryczny, aktywność optyczna. 2. Białka: skład i wielkość, struktura I, II, III i IV-rzędowa, klasyfikacja białek na podstawie funkcji. 3. Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek. 4. Elektroforeza: istota procesu i typy. 5. Znajomość części doświadczalnej (+ przeliczanie stężeń). III. APARATURA I SZKŁO LABORATORYJNE 1. Mały aparat do elektroforezy poliakrylamidowej białek z kompletem szklanych płytek, przekładek i grzebieniem 2. Zasilacz prądu stałego 3. Pudełko plastikowe do barwienia żelu 4. Mikropipety nastawne 20-200 µl, 2-20 µl, 20-200 µl 200-1000 µl (1 komplet / grupa / stanowisko do przygotowania żelu). 5. Mikropipety nastawne 2-20 µl, 20-200 µl ( komplet / zestaw). 6. Rękawiczki gumowe 7. Pipety szklane (5 ml 2 szt./zestaw) + tubus pipet 5 ml przy stanowisku do wylewania żeli 8. Probówki (20 ml- 20 szt.) 9. Lignina 10. Wrząca łaźnia wodna 11. Łapy 12. Nakładki na pipety do 5 ml (1 szt./zestaw) 13. Klamry metalowe (6 szt.) 14. Pipety pasterowskie 15. Zlewki (3 szt. przy stanowisku do wylewania żeli) (

IV. ODCZYNNIKI 1. 30 % roztwór akrylamidów (29.2 % akrylamid i 0.8 % bis-akrylamid) 2. 1.5 M Tris (ph 8.8) 3. 1 M Tris (ph 6.8) 4. 10 % SDS 5. 10 % nadsiarczan amonu 6. TEMED 7. Roztwór Coomassie Brilliant Blue R-250: 0.25 g Coomassie rozpuścić w 125 ml metanolu, dodać 100 ml H 2 O i 25 ml kwasu octowego 8. Roztwór odbarwiacza: metanol: kwas octowy: H 2 O (stosunek obj. 2:1 :7) 9. Bufor elektrodowy (10 x): Tris- 15.125 g, glicyna- 72 g, SDS- 5 g/ 0.5 L H 2 O 10. Bufor do lizy białek (2x) (przechowywać w-20 C): 1 M Tris-HCl (ph 6.8) - 1.5 ml 10 % SDS - 4.8 ml 87 % glycerol - 2. 76 ml β-merkaptoetanol - 1.2 ml H 2 O - 13.74 ml + blekit bromofenolowy 11. 0.1 % acetonowy r-r ninhydryny 12. 1 %-owe roztwory wodne aminokwasów: glicyny, cystyny, cysteiny, fenyloalaniny, tyrozyny, tryptofanu i histydyny 13. Plazma krwi bydlęcej (10 x rozc.) 14. 1 % wodny roztwór żelatyny 15. 6N roztwór wodorotlenku sodu 16. Kwas azotowy (stężony) 17. Kwas siarkowy (stężony) 18. 0.5% roztwór siarczanu miedzi 19. 2% roztwór octanu ołowiawego 20. Roztwór kwasu glioksalowego w 2.5% kwasie octowym 21. 5% roztwór azotynu sodu 22. 1 % roztwór kwasu sulfanilowego w 1 N HCl 23. 10% roztwór węglanu sodu V. WYKONANIE ĆWICZENIA A. ELEKTROFOREZA BIAŁEK a. PRZYGOTOWANIE ŻELU POLIAKRYLAMIDOWEGO Zmieszać przygotowane roztwory wg poniższej tabelki. Katalizatory polimeryzacji, nadsiarczan amonu i TEMED dodać tuż przed wlaniem mieszaniny między płytki szklane. (

Żel rozdzielający (dolny) Końcowe stężenie żelu 12 % 10 ml 30% r-r akrylamidów 4,0 ml l.5 M Tris (ph 8.8) 2.5 ml 10% SDS 0,1 ml 10% nadsiarczan amonu 0,1 ml TEMED 0,004 ml H 2 O 3,3 ml Roztworu powinno być tyle, aby pozostało miejsce na grzebień i żel górny (ok. 1 cm wysokości). Na żel nawarstwić ostrożnie 0,2-0,5 ml wody (aby uniemożliwić dostęp tlenu- inhibitora polimeryzacji) i pozostawić do polimeryzacji na ok. 10-15 min. W tym czasie przygotować żel zagęszczający (górny) wg tabeli poniżej. Nadsiarczan i TEMED dodać tuż przed wlaniem żelu między płyty. Żel zagęszczający (górny) Końcowe stężenie żelu 5 % 5 ml 30% r-r akrylamidów 0,83 ml 1M Tris (ph 6.8) 0,63 ml 10% SDS 0,05 ml 10% nadsiarczan amonu 0,05 ml TEMED 0,005 ml H 2 O 3,4 ml Po spolimeryzowaniu żelu dolnego należy usunąć wodę i wlać roztwór żelu górnego. Natychmiast włożyć grzebień tak, aby nie pozostawić pęcherzy powietrza w żelu. Po spolimeryzowaniu żelu wyjąć grzebień i umieścić płyty w aparacie do elektroforezy. Górny i dolny zbiornik aparatu wypełnić buforem elektrodowym (l X). Aparat podłączyć do zasilacza (górny zbiornik do katody [-], dolny do anody [+]). Po przepłukaniu studzienek buforem elektrodowym nanieść próby (objętość ustalić z prowadzącym ćwiczenie), które należy przygotować wcześniej. b. PRZYGOTOWANIE PRÓB DO ELEKTROFOREZY I ROZDZIAŁ ELEKTROFORETYCZNY Do próby (osad lub ekstrakt bakteryjny) dodać równą objętość buforu do lizy (2x), probówkę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Próby odwirować (5.000 obr./min, 30 sec) i nanieść do studzienek w żelu. Włączyć zasilacz i prowadzić rozdział elektroforetyczny przy 100 V do momentu, gdy czoło barwnika znajdzie sie na granicy żelu górnego i dolnego. Następnie zwiększyć napięcie do 150-l80V. Elektroforezę zakończyć, gdy barwnik będzie znajdował sie przy końcu żelu. (

c. BARWIENIE ŻELU ROZTWOREM COOMASSIE BRILLIANT BLUE R-250 Żel inkubować z wytrząsaniem w roztworze Coomassie przez ok. 30 min. Żel odbarwiać w roztworze metanol : kwas octowy : H 2 O (w stosunku obj. 2: 1 :7) do uzyskania wyraźnych prążków. W odbarwiaczu można umieścić kawałek gąbki, która będzie pochłaniała barwnik. B. REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE a. REAKCJE NA OBECNOŚĆ CYSTEINY I CYSTYNY Do pięciu ponumerowanych probówek odmierzyć kolejno po 100 µl roztworów: glicyny, cystyny, cysteiny, żelatyny oraz plazmy krwi, a następnie do wszystkich probówek dodać po 4 krople 6N NaOH i po kropli octanu ołowiawego. Ogrzewać przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej. b. REAKCJA NA OBECNOŚĆ UKŁADÓW AROMATYCZNYCH (KSANTOPROTEINOWA) Do ponumerowanych probówek odmierzyć po 2 krople stężonego kwasu azotowego, a następnie dodać po 100 µl roztworów glicyny (1), fenyloalaniny (2), tyrozyny (3), tryptofanu (4), histydyny (5), żelatyny (6) oraz plazmy krwi (7). Probówki ogrzewać nad palnikiem do chwili wydzielania sie brązowych par tlenku azotu (OSTROŻNIE, otwór probówki skierować pod wyciąg!!!). Po ostygnięciu do każdej probówki dodać powoli kroplami, mieszając, po około 1.5 ml 6N roztworu NaOH (OSTROŻNIE). c. REAKCJA NA OBECNOŚĆ TRYPTOFANU (HOPKINSA I COLE'A) Do ponumerowanych probówek odmierzyć po 200 µl roztworów: glicyny (1), tryptofanu (2), żelatyny (3) oraz plazmy krwi (4). Do wszystkich probówek dodać po 2 krople roztworu kwasu glioksalowego, a następnie do każdej probówki dodawać ostrożnie stężony kwas siarkowy po ściance próbówki, nie mieszając. Objętość dodanego kwasu powinna być zbliżona do objętości roztworu wodnego w probówce. Należy zwrócić uwagę na zabarwienie, na granicy obu warstw. d. REAKCJA NA OBECNOŚĆ HISTYDYNY Do ponumerowanych probówek odmierzyć po 100 µl roztworów: glicyny (1), histydyny (2), żelatyny (3) oraz plazmy krwi (4). Do wszystkich probówek dodać po 100 µl świeżo przyrządzonej mieszaniny równych objętości roztworu azotynu sodu i roztworu kwasu sulfanilowego, a następnie po 200 µl roztworu węglanu sodu. e. REAKCJA NINHYDRYNOWA Do ponumerowanych probówek odmierzyć po 100 µl roztworów: glicyny (1), żelatyny (2), plazmy krwi (3) oraz wody destylowanej (4). Następnie do wszystkich probówek dodać po 100 µl roztworu ninhydryny i wstawić je na kilka minut do łaźni wodnej o temperaturze 100 C. (

f. REAKCJA BIURETOWA Do ponumerowanych probówek odmierzyć po 100 µl: wody destylowanej (1), roztworu glicyny (2), roztworu histydyny (3), żelatyny (4) oraz plazmy krwi (5). Następnie do wszystkich probówek dodać 4 krople 6N NaOH i po jednej kropli roztworu CuSO 4. VI. WNIOSKI / SPRAWOZDANIE: a. Zinterpretować wynik rozdziału białek w żelu poliakrylamidowym. Wyjaśnić dlaczego białka uległy rozdzieleniu. b. Opisać wyniki reakcji charakterystycznych w tabeli. (

nr testu Glicyna Cysteina (CysSH) Cystyna Histydyna Fenyloalanina Tyrozyna Tryptofan Żelatyna Plazma krwi H 2 O UWAGI

III. CHROMATOGRAFIA KOLUMNOWA NA ŻELU SEPHADEX G-75 I. WSTĘP Chromatografia na żelu Sephadex, określana też jako sączenie molekularne, jest techniką umożliwiającą analityczny bądź preparatywny rozdział substancji różniących się masą cząsteczkową. Sephadex jest handlową nazwą preparatu uzyskiwanego przez wytworzenie wiązań poprzecznych pomiędzy łańcuchami dekstranu. Preparaty żelu, mające postać granulek o średnicy 10-300 µm w zależności od stopnia usieciowania, różnią się zdolnością wchłaniania wody, co służy za kryterium ich podziału i decyduje o rozdzielczych właściwościach żelu. Mechanizm sączenia na żelu przedstawia się schematycznie w sposób następujący. Cząsteczki takie jak np. blue dextran, które są większe niż pory napęczniałych ziaren żelu nie mogą penetrować do ich wnętrza, a wiec przechodzą wyłącznie poprzez fazę wodną złoża i są eluowane jako pierwsze. Mniejsze cząsteczki wnikające w różnym stopniu do wnętrza ziaren, w zależności od swego kształtu i rozmiaru, są eluowane w kolejności zmniejszania się ich masy cząsteczkowej (w doświadczeniu będzie to najpierw cytochrom c - 13 kda, a następnie dwuchromian potasu - 0,3 kda). Charakteryzując kolumnę chromatograficzną oraz zachowanie się rozdzielonych substancji, stosuje się następujące pojęcia: objętość swobodna (zerowa) /V 0 / - objętość rozpuszczalnika znajdującego się pomiędzy ziarnami żelu objętość wewnętrzna /V i / - objętość rozpuszczalnika wypełniającego ziarna żelu objętość matrycy żelu /V g / objętość całkowita złoża /V t / oraz V t = V 0 +V i +V g objętość elucyjna /V e /, charakterystyczna dla danej substancji. Rozpatrując sączenie molekularne na żelu jako szczególny przypadek chromatografii podziałowej, stosujemy zależność pomiędzy objętością elucyjną substancji /V e /, a charakterystycznym dla danej substancji współczynnikiem podziału między fazę stacjonarną i ruchomą: V e = V 0 + K d V i gdzie: K d - współczynnik podziału V 0 - faza ruchoma V i - faza stacjonarna W chromatografii na żelu stosuje się dwa różne współczynniki podziału, w zależności od zdefiniowania fazy stacjonarnej.

Jeżeli jako fazę stacjonarną traktuje się rozpuszczalnik związany z żelem /V i / uzyskujemy zależność: K D = V e V 0 /V i Ponieważ w praktyce trudno jest ustalić V i, jako fazę stacjonarną przyjmujemy całą fazę żelową /tzn. V i +V g / i otrzymamy zależność: K AV = V e V 0 / (V t -V 0 ) Wartość K AV (współczynnik dostępności) jest łatwiejsza do wyznaczenia, stąd też częściej jest stosowana w praktyce. W pracy laboratoryjnej sączenie molekularne wykorzystuje się do: 1) rozdziału substancji różniących się masą cząsteczkową, 2) odsalania substancji wielkocząsteczkowych 3) wyznaczania ciężaru cząsteczkowego związków. II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA: 1. Technika chromatografii kolumnowej (formowanie i równoważenie kolumny, nanoszenie próby, rozwijanie chromatogramu, regulacja przepływu rozpuszczalników). 2. Sączenie molekularne: charakterystyka żeli typu Sephadex, inne rodzaje żeli filtracyjnych m.in. Sepharose, Sephacryl; mechanizm sączenia molekularnego, pojęcia charakteryzujące stosowaną w doświadczeniu kolumnę chromatograficzną oraz zachowanie się rozdzielanych związków (V t, V 0, V i, V g, V e, K), zastosowanie metody sączenia molekularnego. 3. Inne rodzaje metod chromatograficznych (chromatografia jonowymienna, powinowactwa, oddziaływań hydrofobowych i fazy odwróconej). Mechanizm oraz wady i zalety i wykorzystywania danej metody. 4. Budowa związków rozdzielanych na żelu Sephadex G-75 (blue dextran, cytochrom c, dwuchromian potasu). 5. Znajomość części doświadczalnej (+ przeliczanie stężeń). III. APARATURA I SZKŁO LABORATORYJNE 1. Kolumna chromatograficzna firmy Sigma-Aldrich (1 cm x 20 cm) 2. Probówki szklane ze skalą - 20 szt. 3. Mikropipeta nastawna 20-200 µl (2 szt./grupa) i 1000 µl (1 szt. /grupa) + pudełko z żółtymi i niebieskimi tipsami 4. Pipety pasteurowskie 5. Zlewki (250 ml) 6. Kolba Erlenmayera (500 ml) 7. Markery 8. Bagietka szklana 9. Spektrofotometry 10. Papier milimetrowy 11. Strzykawki (6 szt./ grupa) 12. Cylindry (50 ml) (6 szt./ grupa)

IV. ODCZYNNIKI 1. Sephadex G-75 w 90 ml roztworu NaCl (moczony przez 24 godz. i następnie odpowietrzony) 2. 0.85% r-r NaCl (500 ml) 3. Próbka do rozdzielenia: 1.5 ml 0.85% r-r NaCl zawierającego: 5 mg Blue dextranu, 10 mg cytochromu C, 9 mg dwuchromianu potasu, 2% sacharozy (dla całej grupy); UWAGA! do frakcjonowania próby pobiera się tylko 0.2 ml! [Masy cząsteczkowe: Blue dextran - 2000000; Cyt.c - 13000; dwuchromian potasu - 300] V. WYKONANIE ĆWICZENIA A. FORMOWANIE KOLUMNY Z ŻELU SEPHADEX Kolumnę szklaną, owiniętą kilkoma kawałeczkami ligniny, ustawić pionowo w,,łapie" metalowego statywu, zamknąć jej wylot zaciskaczem i wlać do niej ok. 2 ml NaCl. Następnie ostrożnie wlać (po bagietce) do kolumny zamieszaną uprzednio zawiesinę żelu Sephadex. Uwaga! Przed zamieszaniem, zawiesina w zlewce powinna być przygotowana tak, aby 2/3 jej objętości stanowił osiadły żel, a 1/3 r-r NaCl. Ostrożnie otworzyć zacisk kolumny. Roztwór soli powinien wypływać z szybkością 1 kropla/sek. Wysokość uformowanego żelu powinna wynosić 14-16 cm. Po uformowaniu warstwy o żądanej wysokości należy zamknąć wylot kolumny, pozostawiając nad powierzchnią żelu minimum 1 cm roztworu. Uwaga! Kolumna uformowana z żelu Sephadex musi zawsze być przykryta warstwą roztworu, aby nie dopuścić do wyschnięcia górnej powierzchni złoża i jego zapowietrzenia. B. RÓWNOWAŻENIE KOLUMNY Do cylindra miarowego przenieść ok. 15-20 ml r-r NaCl. Wykorzystując strzykawkę wzbudzić przepływ i równoważyć kolumnę z uformowanym żelem Sephadex G-75. C. FRAKCJONOWANIE NA ŻELU SEPHADEX Po przemyciu żelu zaznaczyć markerem górną granicę złoża, przerwać dopływ cieczy do kolumny, po czym zamknąć wylot kolumny, pozostawiając nad powierzchnią żelu warstwę minimum 1 cm r-ru. Przy pomocy mikropipety nanieść na żel 0,2 ml r-ru badanej próbki podwarstwiając ją ostrożnie pod r-r NaCl (nie wolno naruszyć powierzchni żelu!). Podstawić pod kranik kolumny I-szą probówkę ze skalą i ostrożnie podłączyć zbiornik z r-rem NaCl do kolumny. Otworzyć kranik i zbierać eluat. Pierwsze 4 ml wycieku zbierać do jednej probówki ze skalą (l-sza probówka), następnie zbierać frakcje o obj. 1 ml również do probówek ze skalą aż do momentu całkowitego zaniku żółtego zabarwienia eluatu. Przerwać elucję, wypakować żel z kolumny z powrotem do zlewki! Zmierzyć objętość, jaką zajmował żel, napełniając kolumnę wodą i mierząc cylindrem objętość wody, mieszczącej sie w części kolumny zaznaczonej uprzednio kreską. Wartość tę (V t ) zanotować.

VI. WYNIKI I OBLICZENIA Zmierzyć absorpcje frakcji zawierających blue dextran przy długości fali 620 nm a frakcji, zawierających cytochrom c i dwuchromianu potasu przy 450 nm. Zanotować wyniki: Nr fakcji/v e (ml) 1 / 4m 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 620 nm (blue dextran) Absorpcja 450 nm (cytochrom c. dwuchromian potasu) Sporządzić na papierze milimetrowym diagram elucji w/g wzoru. Obliczyć dla cytochromu c i dwuchromianu wartość K AV w/g wzoru: K AV = (V e V 0 )/ (V t V 0 ) gdzie: V e - objętość elucyjna badanej substancji V 0 - objętość elucyjna Blue Dextranu V 0 = V t - objętość całkowita złoża V t =

Uzupełnij tabelkę: Substancja V e (ml) V e V 0 (ml) (V e V 0 )/ (V t V 0 ) Cytochrom c Dwuchromian potasu II. WNIOSKI Sporządzić wnioski z ćwiczenia.

IV. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI KWAŚNEJ FOSFATAZY W HOMOGENACIE Z KIEŁKÓW PSZENICY I. WSTĘP Fosfatazy /fosfomonoesterazy/ są enzymami katalizującymi hydrolityczny rozpad estrów kwasu fosforowego do odpowiedniego alkoholu i kwasu fosforowego. Enzymy te powszechnie występują zarówno w tkankach roślinnych jak i zwierzęcych. Wyróżniamy dwie klasy fosfataz: kwaśne, które wykazują maksymalną aktywność przy ph 4-6 oraz zasadowe z maksymalną aktywnością przy ph 8-9. Kiełki pszenicy są łatwo dostępnym źródłem szeregu enzymów w tym również fosfatazy kwaśnej o małej specyficzności w stosunku do substratu. Rola fosfatazy kwaśnej w roślinie polega na uwalnianiu rezerw fosforanu znajdujących się w kiełkujących ziarnach w postaci m. in. sześciofosforanu inozytolu. Fosfataza kwaśna jest łatwo uwalniana w trakcie mieszania homogenizowanych kiełków w wodzie. Do oznaczania aktywności enzymu zostanie użyty syntetyczny substrat: nitrofenylofosforan sodu. Reakcja będzie przeprowadzana w warunkach optymalnych dla fosfatazy - w buforze cytrynianowym o ph 5,3. Produktem reakcji katalizowanej przez fosfatazę jest nitrofenol, bezbarwny w ph kwaśnym. Dodanie NaOH zatrzymuje reakcję i umożliwia przekształcenie nitrofenolu w barwny anion nitrofenolanowy. Ilość produktu reakcji można określić na podstawie pomiaru spektrofotometrycznego. Oznaczanie aktywności fosfatazy prowadzi się przy stałym stężeniu substratu. Ilość enzymu należy dobrać tak, aby stężenie substratu nie ograniczało szybkości katalizowanej reakcji. Zawartość enzymu określa się w jednostkach aktywności, przyjmując za jednostkę taką ilość enzymu, która hydrolizuje 1 µmol nitrofenylofosforanu w ciągu minuty. II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA 1. Enzymy jako katalizatory reakcji biochemicznych (wpływ enzymów na równowagę reakcji i energie aktywacji; miejsce aktywne enzymu, kompleksy enzym - substrat, specyficzność substratowa, klasyfikacja enzymów). 2. Czynniki wpływające na aktywność enzymatyczną (temperatura, ph, kofaktory, stężenie substratu). 3. Pojęcia: kofaktor, koenzym, grupa prostetyczna, holoenzym, apoenzym, izoenzymy, enzymy allosteryczne, jednostka enzymu (U), aktywność właściwa, aktywność molekularna (liczba obrotów). 4. Kinetyka reakcji enzymatycznej - równanie Michaelisa Menten.

III. APARATURA I SPRZĘT LABORATORYJNY 1. Probówki chemiczne zwykle 2. Pipety (1 ml, 5 ml) + nasadki 3. Statywy do probówek 4. Łaźnia wodna 5. Spektrofotometr 6. Mikser 7. Kolba stożkowa (500 ml) 8. Papier milimetrowy 9. Lejek, sączek 10. Cylinder miarowy (200 ml) 11. Pipety automatyczne (250 µl, 500 µl) IV. ODCZYNNIKI 1. 0,005 M roztwór nitrofenylofosforanu sodu (przygotować bezpośrednio przed użyciem) 2. 0,1 M bufor cytrynianowy ph 5.3 3. 1 N NaOH 4. 0,5 mm roztwór p-nitrofenolu w wodzie 5. H 2 O w lodówce do r-row 1 i 4 V. WYKONANIE ĆWICZENIA A. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU ENZYMATYCZNEGO Do 2,5 g kiełków pszenicy dodać 200 ml wody destylowanej. Korzystając z miksera przygotować homogenat z kiełków. Przesączyć. Przesącz należy rozcieńczyć 5 razy. Przesącz zawiera fosfatazę kwaśną, której aktywność należy oznaczyć. UWAGA! Otrzymany ekstrakt należy przechowywać w lodzie. B. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ a. Przygotowanie krzywej wzorcowej Do 6 probówek odmierzyć: Nr probówki 0,5 mm p-nitrofenol (ml) 1 N NaOH (ml) Woda destylowana (ml) 1 0,25 1 4,75 2 0,5 1 4,5 3 1 1 4 4 1,5 1 3,5 5 2 1 3 6 3 1 2

Próby wymieszać, zmierzyć ekstynkcję przy długości fali 430 nm (spektrofotometr wyzerować względem wody) i sporządzić krzywą wzorcową dla p-nitrofenolu (wykres 1). b. Przygotowanie mieszanin reakcyjnych Do 5 ponumerowanych czystych probówek laboratoryjnych odmierzyć roztwory: Nr probówki Homogenat z kiełków (ml) Woda destylowana (ml) Bufor cytrynianowy (ml) 1 - kontrola 0 2,0 1,0 2 0,5 1,5 1,0 3 1,0 1,0 1,0 4 1,5 0,5 1,0 5 2,0 0 1,0 Próby po dokładnym wymieszaniu wstawić do łaźni wodnej o temp. 37 C na 10 min. Następnie do każdej probówki szybko odpipetować po 2 ml 0,005 M roztworu nitrofenylofosforanu sodu o temp. 37 C i inkubować próby w temp. 37 C przez kolejne 10 min. Po tym czasie do każdej probówki dodać po 1 ml 1 N roztworu NaOH, wymieszać i przeprowadzić pomiar ekstynkcji przy długości fali 430 nm wobec kontroli (probówka nr 1- próba do wyzerowania spektrofotometru). Przedstawić krzywą hydrolizy p-nitrofenylofosforanu sodu w obecności kwaśnej fosfatazy (wykres 2) odkładając na osi rzędnych µmole zhydrolizowanego substratu/min, a na osi odciętych ilość dodanego homogenatu w ml. Na podstawie uzyskanych wyników, korzystając z krzywej wzorcowej, obliczyć ilość jednostek enzymu w 1 ml homogenatu z kiełków pszenicy. VI. WYNIKI i WNIOSKI Opisz uzyskane rezultaty, wykonaj wykresy i obliczenia, sformułuj wnioski.

V. HAMOWANIE KOMPETYCYJNE I NIEKOMPETYCYJNE AKTYWNOŚCI DEHYDROGENAZY BURSZTYNIANOWEJ I. WSTĘP W kinetyce reakcji enzymatycznej podstawową funkcję odgrywają procesy inhibicji i aktywacji. Inhibitory to związki obniżające szybkość reakcji enzymatycznej. Mogą to być normalne metabolity komórkowe, które hamują enzym w ramach naturalnej kontroli odpowiedniego szlaku metabolicznego ale również substancje obce dla organizmu np. antybiotyki, narkotyki, trucizny i toksyny. Rozróżnia sie dwa typy inhibicji: inhibicję odwracalną i nieodwracalną. Przykładem inhibicji odwracalnej jest hamowanie kompetycyjne, kiedy substrat i substancja hamująca (inhibitor) konkurują z sobą o centrum aktywne enzymu. Centrum aktywne jest częścią enzymu, które dzięki odpowiedniej strukturze może przyłączyć substrat(y) (i ewentualnie koenzym) i doprowadzić do zajścia odpowiedniej reakcji. Inhibitor kompetycyjny wypiera substrat z centrum aktywnego enzymu. Przy nadmiarze substratu i małych stężeń inhibitora dochodzi do cofnięcia efektu inhibicji. Klasycznym przykładem hamowania kompetycyjnego jest hamowanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej przez malonian. Dehydrogenaza bursztynianowa - integralne białko błony mitochondrialnej - enzym uczestniczący w cyklu Krebsa, katalizuje utlenianie bursztynianu przez koenzym Q (ubichinon). Enzym nie odróżnia malonianu od bursztynianu ale kompleks enzym-malonian nie ulega rozpadowi i nie uzyskujemy produktów reakcji. Przy pomiarze aktywności dehydrogenazy bursztynianowej wykorzystuje się metodę, w której elektrony, będące jednym z produktów reakcji przenoszone są na sztuczny akceptor, którym w doświadczeniu jest żelazicyjanek potasu. Redukcji żelazicyjanku do żelazocyjanku towarzyszy zanik żółtej barwy roztworu. Efekt hamowania niekompetycyjnego dehydrogenazy bursztynianowej można wykazać przez dodanie do badanego układu soli metali ciężkich, np.: HgCl 2, który blokując grupy SH centrum aktywnego hamuje aktywność enzymatyczną. W tym przypadku nawet znaczne stężenie substratu nie jest w stanie cofnąć inhibicji. II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA 1. Ogólna klasyfikacja enzymów. 2. Budowa enzymu (apoenzym, holoenzyrn, koenzym, grupa prostetyczna, centrum aktywne). 3. Cechy enzymu (swoistość działania, swoistość do substratu - typy swoistości -przykłady). 4. Funkcja enzymów, ich znaczenie oraz charakter reakcji enzymatycznej. 5. Kinetyka reakcji enzymatycznej (równanie i krzywa Michaelisa-Menten), 6. Inhibicja enzymów: nieodwracalna i odwracalna (kompetycyjna, niekompetycyjna), hamowanie allosteryczne 7. Struktura i funkcja enzymów allosterycznych.

8. Dehydrogenaza bursztynianowa- struktura, funkcja, lokalizacja. 9. Znajomość części doświadczalnej (+ przeliczanie stężeń). III. APARATURA I SZKŁO LABORATORYJNE 1. Łaźnia wodna o temp. 37 C 2. Homogenizator 3. Zlewka (200 ml) 4. Probówki (20 ml- 24 szt.) 5. 2 statywy na probówki 6. Lejki (6-12 szt.) 7. Bibuła filtracyjna 8. Pipety (5 ml)+ nasadki na pipety i gumowe gruszki 9. Mikropipety (100 µl, 500 µl, nastawna na 1000 µl) 10. Nożyczki 11. Pęseta 12. Cylinder miarowy (200 ml) 13. Nóż, deska do krojenia 14. Bagietka szklana IV. ODCZYNNIKI 1. 0, M bufor fosforanowy ph 7.3 2. 0,1 M bursztynian sodu ph 7.0 3. 0,05 M malonian sodu ph 7.0 4. 0,01 M chlorek rtęciowy 5. 0,5 % żelazicyjanek potasu ph 7.0 6. 10 % kwas trójchlorooctowy (TCA) 7. 0,25 M sacharoza 8. Wątroba V. WYKONANIE ĆWICZENIA A. PRZYGOTOWANIE PROBÓWEK Z PŁYNAMI INKUBACYJNYMI Do 12 ponumerowanych probówek odmierzyć płyny inkubacyjne według załączonego schematu (tabela). Uwaga! Ze względu na silną toksyczność stosowanych substancji, do nabierania roztworów używać tylko pipet z nasadką lub z gumową gruszką!

Nr probówki 0,1 M bufor fosforanowy (ml) 0,1 M bursztynian sodu (ml) 0,05 M malonian sodu (ml) 0,01 chlorek rtęciowy (ml) 0,5% żelazicyjanek potasu (ml) 1 1 0 0 0 0,5 3,0 2 1 0,1 0 0 0,5 2,9 3 1 0,1 0 0 0,5 2,9 4 1 0,1 0 0 0,5 2,9 5 1 0,1 0,1 0 0,5 2,8 6 1 0,1 0,1 0 0,5 2,8 7 1 0,1 0 0,1 0,5 2,8 8 1 0,1 0 0,1 0,5 2,8 9 1 2 0,1 0 0,5 0,9 10 1 2 0,1 0 0,5 0,9 11 1 2 0 0,1 0,5 0,9 12 1 2 0 0,1 0,5 0,9 Woda (ml) Probówki nr 1 i 2 służą jako kontrola. Probówka nr 1 nie zawiera substratu dla dehydrogenazy bursztynianowej. W przypadku probówki nr 2 dodać 2 ml 10% TCA celem wytracenia białek (denaturacja enzymów czyli kontrola ta nie zawiera czynnego enzymu). Następnie wszystkie probówki wstawić do łaźni wodnej (37 C) na 10 min. B. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU ENZYMATYCZNEGO Rozdrobnioną porcję wątroby (dla całej grupy) umieścić w cylindrze miarowym i uzupełnić zimnym 0,25 M roztworem sacharozy do obj. 200 ml. Całość przenieść do homogenizatora i homogenizować przez 3 min. Uzyskany homogenat zawiera dehydrogenazę bursztynianową (należy go przechowywać w lodzie lub lodówce). C. INHIBICJA Do każdej probówki umieszczonej w łaźni wodnej (37 C) dodać po 1 ml homogenatu, wymieszać i inkubować przez 30 min. Następnie reakcję przerwać przez dodanie do każdej probówki 2 ml 10% TCA (z wyjątkiem probówki nr 2) i przesączyć przez małe sączki do innych probówek. Zaobserwować, w których próbówkach nastąpiło odbarwienie płynu i dane umieścić w tabeli:

Nr probówki 1 Stężenie molowe substratu [mm] Stężenie molowe malonianiu [mm] Stężenie molowe HgCl 2 [mm] Odbarwienie roztworu żelazicyjanku (obserwacje) WNIOSKI 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Obliczyć stężenie substratu oraz inhibitorów w poszczególnych próbówkach (przed dodaniem TCA) i wpisać do tabeli. Na podstawie wyników zestawionych w tabeli zastanowić się, w których próbówkach doszło do inhibicji. Przeanalizować stężenie użytego substratu i inhibitora i na tej podstawie określić, w których probówkach doszło do odwrócenia inhibicji.

VI. CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA I ILOŚCIOWE OZNACZANIE CUKRÓW I. WSTĘP Chromatografia cienkowarstwowa jest metodą rozdzielania mieszanin substancji przy zastosowaniu nośników uformowanych w postaci cienkich warstw na powierzchni szklanych płytek. Nośnikami najczęściej stosowanymi są: żel krzemionkowy, tlenek glinu, ziemia okrzemkowa, celuloza i jej pochodne. Używa się je w postaci drobno sproszkowanej, czasami z domieszką substancji wiążącej, np.: gipsu. Nośnik zawieszony w odpowiednim rozpuszczalniku daje się łatwo rozprowadzić na czystej powierzchni, dokładnie odtłuszczonej i suchej płytki, a po wysuszeniu twardnieje i przylega w postaci cienkiej warstwy do szkła. W niektórych przypadkach płytki wymagają aktywacji przez ogrzewanie w określonej temperaturze. W zależności od warunków chromatografii (rodzaj nośnika, układ rozpuszczalników) rozdzielenie mieszaniny substancji na chromatogramach może odbywać się w wyniku procesów adsorpcji, rozdziału między dwie nie mieszające się ze sobą fazy ciekłe lub wymiany jonowej. W porównaniu z chromatografią bibułową, metoda chromatografii cienkowarstwowej ma szereg zalet, które decydują o coraz szerszym jej stosowaniu. Najważniejsze z nich to: krótszy czas rozwijania chromatogramów, większa czułość i dzięki temu możliwość analizowania mniejszych ilości substancji, dobry rozdział mieszanin związków trudno rozdzielających się metodą chromatografii bibułowej, mniejsze rozmywanie się plam, możliwość wywoływania chromatogramów stężonymi roztworami kwasów i zasad (z wyjątkiem płytek celulozowych), możliwość odzyskania substancji z chromatogramu (przez wyskrobanie nośnika z płytki i elucję substancji z nośnika). Cukry dzieli sie na dwie grupy: 1) cukry proste (jednocukry, monosacharydy) 2) cukry złożone, do których sie zalicza: a) kilkocukry (oligosacharydy) b) wielocukry (polisacharydy) Do wykrywania i dalszej analizy cukrów wykorzystuje się reakcje oparte na następujących właściwościach tych związków: 1. Cukrowce o budowie cyklicznej mogą przekształcać sie w pochodne cyklicznego aldehydu - furfuralu i tworzyć z niektórymi związkami produkty kondensacji. 2. Niektóre wielocukrowce tworzą w obecności jodu kompleksy wielocukrowiec-jod. Kompleksy z jodem mogą tworzyć tylko cząsteczki o odpowiednio dużych rozmiarach i uporządkowanej strukturze. Do takich wielocukrów należą skrobia oraz glikogen. Skrobia składa sie z 2 składników: amylozy i amylopektyny. Amyloza charakteryzuje się nierozgałęzionymi łańcuchami, tworzącymi układy spiralne, przy czym na 1 skręt przypada 6 reszt cukrowych (α-d-glukozy). Natomiast amylopektyna posiada budowę rozgałęzioną, przez co odcinki helikalne są krótsze. Barwny efekt reakcji z jodem jest tym

większy, im dłuższe są odcinki o strukturze helikalnej. Amyloza daje intensywną barwę niebieską; w miarę skracania długości łańcuchów następuje zmiana barwy na fioletowoczerwoną (amylopektyna) i ciemnoczerwoną (glikogen). 3. Cukrowce z wolną grupą karbonylową redukują niektóre związki i jony. 4. Cukrowce z wolną grupą karbonylową są zdolne tworzyć z fenylohydrazyną osazony. Cukry można oznaczać ilościowo a także wywoływać na chromatogramach przy pomocy charakterystycznych substancji barwnych. Ich podstawą jest tworzenie się pochodnych furfuralu z cukrów (pentoz, heksoz, kwasów uronowych) pod działaniem kwasów mineralnych w podwyższonej temperaturze. furfural hydroksy metylofurfural metylofurfural (z pentoz) (z heksoz) (z 6-dezoksyheksoz) Pochodne te mogą ulegać dalszym przemianom: Pochodne furfuralu po kondensacji ze związkami zawierającymi grupy fenolowe lub fenyloaminowe dają produkty barwne. W metodzie oznaczania cukrów wg Dubois stosuje się fenol, produkty kondensacji mają barwę różową. W próbie antronowej przeprowadza się kondensację z antronem uzyskując produkty zabarwione na kolor niebieski. Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości cukrów w próbie (przy ścisłym przestrzeganiu warunków reakcji).

II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA: 1. Węglowodany: budowa i nazewnictwo, podział węglowodanów (mono-, oligo-, polisacharydy, przykłady, występowanie i funkcje) 2. Właściwości chemiczne i fizyczne cukrów. 3. Wykrywanie cukrów, reakcje barwne. 4. Funkcje pełnione przez węglowodany w organizmie. 5. Chromatografia cienkowarstwowa: zastosowanie, dobór sorbenta i rozpuszczalnika, chromatografia podziałowa, współczynnik przesunięcia (Rf). 6. Znajomość części doświadczalnej. III. APARATURA I SPRZĘT LABORATORYJNY 1. Płytki szklane 20 x 10 cm 2 szt. 2. Cylinder miarowy 10 ml 1 szt. 3. Cylinder miarowy 50 ml 1 szt. 4. Bagietka 1 szt. 5. Kolba stożkowa 50 ml 1 szt. 6. Mikropipeta 1 µl 1 szt. 7. Pipety 1 ml 2 szt. 8. Pipety 5 ml 2 szt. 9. Nasadka do pipet 1 szt. 10. Probówki 11 szt. 11. Suszarka 60 C 12. Suszarka 130 C 13. Suszarka ręczna 14. Komora chromatograficzne 1 szt. 15. Spryskiwacz 1 szt. 16. Dozowniki 2 szt. 17. Łaźnia wodna 18. Statyw na probówki IV. ODCZYNNIKI 1. Żel krzemionkowy 2. 0,02 M roztwór octanu sodu 3. 2 % r- ry cukrów: 1) ksylozy, 2) fruktozy, 3) glukozy, 4) sacharozy, 5) laktozy 4. 2 % mieszanina cukrów: 1 + 2+ 3 + 4 + 5 5. Mieszanina rozpuszczalników chloroform: kwas octowy: woda (30: 35: 5) 6. Wywoływacz: 1 g dwufenyloaminy + 1 ml aniliny + 100 ml acetonu, dodać 10 ml 85 % H 3 PO 4 bezpośrednio przed użyciem! 7. 1 % r-ry cukrów: (1) glukozy, (2) sacharozy, (3) maltozy, (4) skrobi 8. 20% etanolowy roztwór α-naftolu 9. Stężony H 2 S0 4

10. Odczynnik Benedicta 11. Odczynnik Barfoeda 12. Roztwór jodu w jodku potasowym (plyn Lugola) 13. Sok owocowy Dodatkowe materiały: linijki, ołówki, gumowe rękawiczki, papier milimetrowy Uwaga! Podczas wykonywania części praktycznej ćwiczenia dotyczącej chromatografii cienkowarstwowej oraz przy pracy ze stężonym kwasem należy zachować szczególną ostrożność. Wszystkie czynności należy wykonywać pod wyciągiem. V. WYKONANIE ĆWICZENIA A. CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA a. Przygotowanie płytek Jedną płytkę szklaną (10 x 20 cm) dokładnie oczyszczoną i suchą odtłuścić watą lub ligniną nasyconą etanolem. b. Przygotowanie warstwy żelu krzemionkowego Do kolbki z 3 g żelu krzemionkowego dodać 10 ml 0,02 M octanu sodu. Mieszać delikatnie ruchem obrotowym około 1 min. Zawiesinę natychmiast wylać na odtłuszczoną płytkę szklaną. Posługując się bagietką rozprowadzić złoże równomiernie na powierzchni płytki (wyrównać poprzez przechylenie płytki na boki). Pozostawić w temp. pokojowej dla następnej grupy ćwiczeniowej. c. Przygotowanie płytek do nanoszenia prób Płytkę z żelem krzemionkowym obrysować w następujący sposób: 3 brzegi w odległości 5 mm od krawędzi. Nieobrysowany brzeg wąski posłuży jako linia startu dla rozdzielanych cukrów, które należy nanieść w odległości około 1,5 cm od dolnego brzegu płytki. Należy zachować odległości 1,5 cm pomiędzy nanoszonymi próbami. Uwaga! Płytkę z żelem krzemionkowym należy bezpośrednio przed użyciem zaktywować przez ogrzanie 15 min w 60 C! d. Nanoszenie prób Nanieś na płytki z żelu krzemionkowego po 1 µl 2 % roztworów cukrów. Kolejność nanoszenia: (1) ksyloza, (2) fruktoza, (3) glukoza, (4) sacharoza, (5) laktoza, (6) mieszanina cukrów 1 + 2 + 3 + 4 + 5, (7) zawiązek X (do identyfikacji). e. Rozwijanie chromatogram6w Płytkę z żelem krzemionkowym rozwijać w mieszaninie rozpuszczalników: chloroform: kwas octowy: woda (30: 35: 5)

Chromatogram na żelu krzemionkowym należy wyjąć z komory, gdy front rozpuszczalników osiągnie górną granicę płytki. Chromatogramy wysuszyć w temperaturze pokojowej. f. Wywołanie chromatogramów Płytkę z żelem krzemionkowym spryskać równomiernie wywoływaczem zawierającym: 1 g dwufenyloaminy, 1 ml aniliny, 100 ml acetonu. Bezpośrednio przed użyciem dodać 10 ml 85 % H 3 P0 4. Spryskaną płytkę ogrzewać przez 15 min w temp. 130 C. Obliczyć R f dla naniesionych cukrów (ksylozy, fruktozy, glukozy, sacharozy i laktozy). B. ILOŚCIOWE OZNACZANIE CUKRÓW a. Sporządzenie krzywej wzorcowej Do 5-ciu ponumerowanych probówek odmierzono roztwór glukozy o stężeniu 100 µg/ml i uzupełniono wodą wg tabeli. Probówka nr 6 stanowiła kontrolę. Nr probówki 1 2 3 4 5 6 Objętość roztworu glukozy [µl] 200 300 400 500 600 0 Objętość wody [µl] 400 300 200 100 0 600 Następnie do wszystkich probówek dodano 600 µl 5% roztworu fenolu i wymieszano. Dodano (ostrożnie!) po 3 ml H 2 SO 4 i ponownie wymieszano. Reakcję prowadzono przez 10 min w temp. pokojowej. Poszczególne próby przeniesiono do kuwet i zmierzono absorbancję w spektrofotometrze przy długości fali λ = 490 nm wobec próby kontrolnej. Otrzymano następujące wyniki: Nr probówki 1 2 3 4 5 Absorbancja 490 nm 0,41 0,57 0,75 0,92 1,1 Korzystając z powyższych danych wykreśl krzywą wzorcową dla glukozy: