Ćwiczenie nr 2 KINETYKA HYDROLIZY SACHAROZY I. Kinetyka hydrolizy sacharozy reakcja chemiczna Zasada: Sacharoza w środowisku kwaśnym ulega hydrolizie z wytworzeniem -D-glukozy i -D-fruktozy. Jest to reakcja pseudo-i-rzędowa. H + sacharoza + H 2 O -D-glukoza + -D-fruktoza Prędkość początkową V 0 wyznaczamy badając przyrost stężenia produktów w czasie trwania reakcji. Stężenie powstającej glukozy oznacza się metodą kolorymetryczną. Odczynniki: 0,08% roztwór sacharozy 6 mol/l roztwór HCl 10% roztwór NaOH nasycony roztwór kwasu pikrynowego równomolowy roztwór glukozy i fruktozy zawierający glukozę w stężeniu 0,83 mm/l (wzorcowy roztwór glukozy) ĆWICZENIE PRAKTYCZNE Wykonanie: Doświadczenie wykonywane jest w 3 zespołach, z których każdy przeprowadza reakcję w innej temperaturze (30 C, 35 C, 40 C). 1. Hydroliza sacharozy a) Do 7 przygotowanych, suchych probówek umieszczonych w statywie dodać po 1,5 ml roztworu NaOH. b) Do probówki nieoznaczonej numerem odmierzyć: 5 ml roztworu sacharozy, 5 ml roztworu HCl c) Probówkę z mieszaniną reakcyjną zakorkować i wymieszać jej zawartość. 1
Uwaga! Czynności opisane w punktach d), e) i f) należy wykonywać równocześnie!!! d) Z probówki pobrać pipetą automatyczną 0,5 ml mieszaniny reakcyjnej i umieścić ją w probówce nr 1 (zawierającej roztwór NaOH). e) Rozpocząć pomiar czasu. f) Probówkę z mieszaniną reakcyjną umieścić w termostatowanej łaźni wodnej: Zespół I temp. 30 C Zespół II temp. 35 C Zespół III temp. 40 C Uwaga! Probówka z mieszaniną reakcyjną pozostaje w łaźni wodnej do zakończenia doświadczenia!!! g) Po czasie podanym w tabeli pobrać po 0,5 ml mieszaniny reakcyjnej i dodawać je do probówek zawierających roztwór NaOH (probówki nr: od 2 do 6). Dokładnie wymieszać zawartość probówek. Nr probówki 1 2 3 4 5 6 7 wzorzec Czas [min] 0,0 2,5 5,0 10,0 15,0 20,0 - Absorbancja przy 550 nm Stężenie glukozy [mm/l] 0,83 2
2. Oznaczenie stężenia glukozy Zasada: Glukoza redukuje kwas pikrynowy (2,4,6-nitrofenol) do kwasu pikraminowego (2-amino-4,6-dinitrofenol). Reakcja zachodzi w środowisku zasadowym, w temp.100 C. Natężenie barwy powstającego, czerwonego związku jest wprost proporcjonalne do stężenia glukozy. a) Do probówki nr 7 (zawierającej już 1,5 ml roztworu NaOH) dodać 0,5 ml wzorcowego roztworu glukozy i dokładnie wymieszać. b) Do wszystkich probówek (nr: od 1 do 7) dodać po 1 ml roztworu kwasu pikrynowego. Zawartość po zakorkowaniu dokładnie wymieszać. Usunąć korki, a probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej i gotować przez 8 minut. c) Probówki ochłodzić pod bieżącą wodą i uzupełnić ich objętość wodą destylowaną z butelki do 10 ml (czyli dodać do każdej probówki 7 ml wody destylowanej). Probówki zatkać korkami i dokładnie wymieszać zawartość. d) Odczytać absorbancję przy długości fali światła równej 550 nm wobec próby nr 1 (nie zawiera glukozy). e) Obliczyć stężenie glukozy w poszczególnych probówkach, stosując wzór: E wzorca C w E próby badanej C x E próby badanej x C w C x = E wzorca gdzie: C w stężenie wzorca glukozy C x stężenie glukozy w próbie Opracowanie wyników: 1) Każdy zespół sporządza wykres zmiany stężenia glukozy w czasie c = f(t), a następnie wyznacza graficznie szybkość początkową reakcji V 0. Jej wartość jest równa tangensowi kąta nachylenia stycznej do krzywej w punkcie t = 0. 2) Sporządzić wykres zależności prędkości początkowych V 0 od temperatury V 0 = f(t) na podstawie wartości uzyskanych przez wszystkie pracujące zespoły. 3
II. Hydroliza sacharozy katalizowana przez inwertazę drożdżową Inwertaza (sacharaza, ß-D-fruktofuranozydaza) należy do hydrolaz i podklasy glikozydaz. Ułatwia ona zerwanie wiązania glikozydowego w sacharozie, rozkładając ją na glukozę i fruktozę. Enzym ten występuje głównie w komórkach roślinnych, gdzie związany jest ze ścianą komórkową. Najłatwiej uzyskać jest inwertazę z komórek drożdży. W organizmie ludzkim inwertaza, podobnie jak laktaza, znajduje się na wewnętrznej powierzchni komórek nabłonka wyściełającego jelito cienkie. Inwertaza występuje również w ślinie pszczół, biorąc udział w przetwarzaniu cukru z nektaru kwiatowego do cukrów prostych. Inwertaza działa optymalnie przy ph około 4,7 (aktywna jest w szerokim kwasowym zakresie ph od 4 do 6; przy ph 2 i 9 enzym jest praktycznie nieaktywny). Wraz ze wzrostem temperatury rośnie również szybkość reakcji enzymatycznej. Po osiągnięciu określonego optimum w danych warunkach, szybkość reakcji zaczyna maleć w następstwie denaturacji cieplnej enzymu. Większość enzymów traci nieodwracalnie aktywność, gdy temperatura przekroczy 65 0 C i tylko nieliczne wytrzymują krótkie gotowanie (żelatyna, rybonukleaza, czy też pepsyna w ph 1). W zakresie temperatur, w którym denaturacja enzymu jest praktycznie nieistotna, a więc około 37 0 C, wzrost temperatury o 10 0 C powoduje zwiększenie szybkości reakcji mniej więcej 2- krotnie. Odczynniki: ekstrakt z drożdży w 0,1mol/L buforze octanowym (ph=4,7) 0,18 mol/l sacharoza w 0,1 mol/l buforze octanowym (ph=4,7) 0,1 mol/l bufor octanowy (ph=4,7) 10% roztwór NaOH nasycony roztwór kwasu pikrynowego równomolowy roztwór glukozy i fruktozy zawierający glukozę w stężeniu 0,83 mm/l (wzorcowy roztwór glukozy) Wykonanie: Doświadczenie wykonywane jest przez 1 zespół, przeprowadzający reakcję w temperaturze 30 C. 4
1. Hydroliza sacharozy a) Przygotować 9 suchych probówek opisując je kolejno od 1 do 6, zaś trzy ostatnie z nich jako W, R i O b) Do probówek od 1 do 6 i W i O dodać po 1,5 ml 10% roztworu NaOH. c) Do probówki R odmierzyć: 1 ml buforu octanowego, 2 ml roztworu sacharozy i dokładnie wymieszać jej zawartość. d) Probówkę R przenieść do termostatowanej łaźni wodnej (temp.30 C). Uwaga! Probówka R z mieszaniną reakcyjną pozostaje w łaźni wodnej do zakończenia doświadczenia!!! e) Po 8 min. do probówki R dodać 2 ml ekstraktu z drożdży, zamieszać energicznie i natychmiast pobrać z probówki R pipetą automatyczną 0,5 ml mieszaniny reakcyjnej i umieścić ją w probówce 1 (zawierającej 1 ml NaOH). f) Rozpocząć pomiar czasu. g) Po czasie podanym w tabeli z probówki R pobierać po 0,5 ml mieszaniny reakcyjnej i dodawać ją do danej kolejnej probówki, zawierającej już 1 ml NaOH (probówki od 2 do 6). Dokładnie wymieszać zawartość probówek. W Nr probówki 1 2 3 4 5 6 wzorzec Czas [min] 0,0 2,5 5,0 10,0 15,0 20,0 - Absorbancja przy 550 nm Stężenie glukozy [mm/l] 0,83 5
2. Oznaczenie stężenia glukozy Zasada: Glukoza redukuje kwas pikrynowy (2,4,6-nitrofenol) do kwasu pikraminowego (2-amino-4,6-dinitrofenol). Reakcja zachodzi w środowisku zasadowym, w temp.100 C. Natężenie barwy powstającego, czerwonego związku jest wprost proporcjonalne do stężenia glukozy. a) Do probówki W (zawierającej już 1,5 ml NaOH) dodać 0,5 ml wzorcowego roztworu glukozy, a do probówki O ( zawierającej już 1,5 ml NaOH) dodać 0,5 ml wody destylowanej, po czym zawartość każdej z probówek dokładnie wymieszać. b) Do wszystkich probówek (od 1 do 6, O i W ) dodać po 1 ml roztworu kwasu pikrynowego. Zawartość po zakorkowaniu dokładnie wymieszać. Usunąć korki, a probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej i gotować przez 8 minut. c) Probówki ochłodzić pod bieżącą wodą i do każdej z nich dodać 7 ml wody destylowanej z butli. Probówki zatkać korkami i dokładnie wymieszać ich zawartość. d) Odczytać absorbancję przy długości fali światła równej 550 nm wobec próby odczynnikowej O. e) Obliczyć stężenie glukozy w poszczególnych probówkach, stosując wzór: E wzorca C w E próby badanej C x E próby badanej x C w C x = E wzorca gdzie: C w stężenie wzorca glukozy C x stężenie glukozy w próbie Opracowanie wyników: 1) Sporządzić wykres zmiany stężenia glukozy w czasie c = f(t), a następnie wyznaczyć graficznie szybkość początkową reakcji V 0. Jej wartość jest równa tangensowi kąta nachylenia stycznej do krzywej w punkcie t = 0. 6