Podstawowe strategie i techniki genetyki molekularnej

Czym jest inżynieria genetyczna? Ang. recombinant DNA manipulacje DNA in vitro izolacja i amplifikacja DNA i cdna mapowanie i sekwencjonowanie DNA tworzenie nowych cząsteczek DNA przez rekombinację cząsteczek naturalnych przez syntezę de novo wprowadzanie konstruktów DNA do komórek i organizmów modyfikacje syntezy białek ekspresja heterologiczna bioinformatyka

A co nie jest inżynierią genetyczną? Inżynieria embrionalna (np. klonowanie) Tworzenie nowych form organizmów przez selekcję

Zastosowania Badania podstawowe Biotechnologia Granica między badaniami podstawowymi a stosowanymi jest płynna, stosowane techniki są podobne, różnice dotyczą głównie skali.

Podstawowe techniki Izolacja DNA ze źródeł naturalnych komórki i tkanki mikroorganizmy hodowane w laboratorium i występujące naturalnie antyczny DNA cdna izolacja RNA i przepisanie na DNA Chemiczna synteza DNA de novo

PCR 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

Elektroforeza DNA i RNA 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

Hybrydyzacja Wykorzystanie komplementarności kwasów nukleinowych do wykrywania określonej sekwencji DNA (Southern) lub RNA (Northern) 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

Hybrydyzacja Northern Podstawowa metoda badania poziomu ekspresji genu

Podstawowe techniki Enzymy restrykcyjne analiza fragmentów DNA (mapowanie) klonowanie

Wektory Umożliwiają utrzymanie DNA wprowadzonego do komórek (transformacja, transfekcja) wektory autonomiczne zdolne do replikacji (np. plazmidy, wirusy) wektory integracyjne wektory ekspresyjne umożliwiają ekspresję wprowadzonego genu (autonomiczne lub integracyjne) wektory kierujące rekombinacją (ang. targeting) integracyjne wektory bifunkcjonalne

Typowy wektor Sekwencje zapewniające replikację (w. autonomiczne) Sekwencje umożliwiające odróżnienie komórek z wprowadzonym wektorem markery selekcyjne Miejsce do wstawienia klonowanego DNA linker Opcjonalnie sekwencje umożliwiające odróżnienie wektora ze wstawką od wektora pustego marker rekombinacji

Klonowanie molekularne Włączenie danego fragmentu DNA (wstawki) do wektora autonomicznego

Przyk ady zastosowań Poznawanie sekwencji DNA (genów, genomów, mutantów) Diagnostyka molekularna Ekologia i filogenetyka molekularna Heterologiczna ekspresja białek (dla celów poznawczych i biotechnologicznych) Odwrotna genetyka inaktywacja wybranych genów u organizmów modelowych Terapia genowa

Sekwencjonowanie Dideoksynukleotydy zatrzymują syntezę na określonych nukleotydach Matryca 3 ATCGGTGCATAGCTTGT 5! Produkty reakcji A 5 TAGCCACGTATCGAACA* 3! 5 TAGCCACGTATCGAA* 3! 5 TAGCCACGTATCGA* 3! 5 TAGCCACGTA* 3! 5 TAGCCA* 3! 5 TA* 3!

Tradycyjny odczyt sekwencji Znakowanie radioaktywne, osobne reakcje A T C G +

Sekwencjonowanie CGTAA CGTAAC CGTAACC CGTAACCC CGTAACCCT CGTAACCCTT CGTAACCCTTG CGTAACCCTTGG Obecnie stosuje się dideoksynukleotydy wyznakowane fluorescencyjnie każdy innym kolorem

Sekwencjonowanie automatyczne

Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe Tzw. deep sequencing Generowanie w jednym przebiegu milionów niezależnych odczytów Pojedyncze odczyty krótkie (25-400 bp) Zastosowania sekwencjonowanie nowych genomów resekwencjonowanie np. analiza zmienności badanie ekspresji przez sekwencjonowanie cdna

Solexa 350 = Solexa Ultrahigh-throughput DNA Sequencing Platform

Pirosekwencjonowanie (454) Fragmenty DNA przyłączone do kulek (1 fragment na kulkę), następnie namnożone Kulki z DNA umieszczone w studzienkach Sekwencjonowanie przez syntezę: dodaje się kolejno 4 nukleotydy, gdy dodany nukleotyd komplementarny, to uwoniony pirofosforan daje reakcję z luminescencją Wynik: ~800,000 odczytów po 250-500 bp (~400 megabases) The development and impact of 454 sequencing Jonathan M Rothberg & John H Leamon Nature Biotechnology 26, 1117-1124 (2008)

Solexa (Illumina) Slides from http://www.illumina.com

Solexa (Illumina) Slides from http://www.illumina.com Wynik: 80-100 milionów odczytów po ~50 bp (~4Gb)!

Genomika Genomika jest dziedziną zajmującą się badaniem całych genomów (kompletu informacji genetycznej) różnych organizmów Techniki biologii molekularnej + robotyka + informatyka Sekwencjonowanie i charakteryzowanie genomów Badanie funkcji zawartych w nich genów

Metagenomika Izolacja DNA ze środowiska i sekwencjonowanie Jedyny sposób badania mikroorganizmów, które nie dają się hodować

Metagenomika Analiza sekwencji całości DNA wyizolowanego ze zbiorowiska organizmów

Odkrycia dzięki sekwencjonowaniu Tajemnicza UCYN-A Sinica (cyjanobakteria) Niewielki genom (1,4mln par zasad, 1200 genów) Brak zdolności fotosyntezy, cyklu Krebsa, syntezy niektórych aminokwasów Zdolność asymilacji azotu Symbioza? tajemnicza ekologia

Genom cz owieka

Craig Venter Francis Collins (NIH)

Co to znaczy? TCACAATTTAGACATCTAGTCTTCCACTTAAGCATATTTAGATTGTTTCCAGTTTTCAGCTTTTATGACTAAATCTTCTAAAATTGTTTTTCCCTAAATGTAT ATTTTAATTTGTCTCAGGAGTAGAATTTCTGAGTCATAAAGCGGTCATATGTATAAATTTTAGGTGCCTCATAGCTCTTCAAATAGTCATCCCATTTTATACA TCCAGGCAATATATGAGAGTTCTTGGTGCTCCACATCTTAGCTAGGATTTGATGTCAACCAGTCTCTTTAATTTAGATATTCTAGTACATACAAAATAATACC TCAGTGTAACCTCTGTTTGTATTTCCCTTGATTAACTGATGCTGAGCACATCTTCATGTGCTTATTGACCATTAATTAGTCTTATTTGTTAAATGTCTCAAAT ATTTTATACAGTTTTACATTGTGTTATTCATTTTTTAAAAAATTCATTTTAGGTTATATGTATGTGTGTGTCAAAGTGTGTGTACATCTATTTGATATATGTA TGTCTATATATTCTGGATACCATCTCTGTTTCATGCATTGCATATATATTTGCCTATTTAGTGGTTTATCTTTTCATTTTCTTTTGGTATCTTTTCATTAGAA ATGTTATTTATTTTGAGTAAGTAACATTTAATATATTCTGTAACATTTAATGAATCATTTTATGTTATGTTTAGTATTAAATTTCTGAAAACATTCTATGTAT TCTACTAGAATTGTCATAATTTTATCTTTTATATACATTGATATTTTTATGTCAAATATGTAGGTATGTGATATTATGCACATGGTTTTAATTCAGTTAATTG TTCTTCCAGATGTTTGTACCATTCCAACATCATTTAAATCATTAAATGAAAAGCCTTTCCTTACTAGCTAGCCAGCTTTGAAAATCCATTCATAGGGTTTGTG TTAATATATTTTTGTTCTTTTTTTTCCTTTCTACTGATCTCTTTATATTAATACCTACTGTGGCTTTATATGAAGTCATGGAATAATACGTAGTAAGCCCTCT AACACTGTTCTGTTACTGTTGTTATTGTTTTCTCAGGGTACTTTGAAATATTCGAGATTTTATTATTTTTTAGTAGCCTAGATTTCAAGATTGTTTTGACGAT CAATTTTTGAATCAATTGTCAATATTTTTAGTAATAAAATGATGATTTTTGATTGGAAATACATTAAATCTATAAGCCAAATTGGAGATTATTGATATATTAA CAAAAATGAGTTTTCCAGTCCATGAATGTATGCACATTATAAAATTCATTCTTAAGTATGTCATTTTTTAAGTTTTAGTTTCAGCAGTATATGTTTGTTACAT AGGTAAACTCCTGTCATGGGGGTTAGTTGTACAGGTTATTTTATCATCCAGGCATAAAGCCCAGTACCCAGTAGTTATCTTTTCTGCTCCTCTCCCTCCTGTC ACCCTCCACTCTCAAGTAGACCCCAGTTTCTGTTGTTCTCTTCTTTGCATTAATGACTTCTCATCATTTAGATTGCACTTGTAAGTGAGAACAGGACGTATGT GGTTTTCTACTCCTGTGTTAGTTTGCTAAGGATAACCACCTCCATCTCCATCCATGTTCCCACAAAAGACATGATCTCCTTTTTTATGGCTGCATATTATTCC ATGGTATATATGTACCACATTTTCTTTATCCAATCTGTCATTGATGGACATTTAGGTTGTTTCCACATCATTGCCGTTGTAAATACTGCTGCAGTGAATATTC GTGTGTATGTCTTTATGGTAGAATGATTTATATTCCTCTGGGTATATTTCCAAGTAATGGGATGGTTGGGTCAAATGGTAATTCTGCTTTTAGCTTTTTGAGG AATTGCCATATTGCCTTTCACAACGGTTGAACTAATTTATACTCCCAAGAGTGTATAAGTTGTTCCTTTTTCTCTGCAACCTCGACATCACCTGTTATTTATG ACTTTTATATAATAGCCATTCTGCTGGTCTGAGATGGTATCTCATTATGATTTTGATTTGCATTTCTCTAATGCTCAGTGATATTGAGCTTGGCTGCATATAT GTCTTCTTTTAAAAATATCTGTTCATGTCCTTTGCCTAATTTATAACGGGGTTGTTTGTTTTTCTCTTGTAAATTTGTTTAAGTTCCTTATAGATTCTAGGTA TTAAACCTTTTTTCAGAGGCGTGGCTTGCAAATATTTTCTCCCATTCTATAGGTTGTCTGTTTATTCTGTTGATAGTTTCCCTTGCTGTGCAGAAGCTCTTAA CTTTAATTAGATCCGACTTGTCAATTTTTGCTTTGGTCGCAATTGCTTTTGATGTTATTGTCGTGAAATCTTTGCTAGTTCTTAGGTCCAGGATGATATTGCC CAAGTTGTCTTCCAGGGCTTTTATAATTTTGGATTTTACATTTAAGTCTTAATATATTTATTAAATTTGTTAGGGTTTCAGGATACAAGGACAATATAGCAGC AAACAATGTAAAAGTAAAATCTGAAAAATAATAGAAAACAGTTTAATTGAACACTTTACCATTATGTAATGCCCTTCTTTGTCTTTCCTGATCTTTGTTGGTT TGAAGTTCAAAAAAGACAAACTTAATGGTACAATAGGTATTGTAGATTTCAGGACTTTCTGTATAAAATATTTTGTATATATGAATAGATCATTTTTTATTTC CAGTCTTTAAACATTTTCTTAACATTTTCTTCTATTGCTTCACTTCACTCGCTAGGACCATCAGGACAGTGTTGAACAGAAATTGTCAGACTGATCATCACAA CTTTTTCTAGATTTTAGAAGGAAATTTTTCTTTATTTCAACATAAAGCAGCATGTTAATGCCAAGTTTTAATATGTGTTATCAGATTGAAATTTTTTTGTATA TTTCTACATTACCAAGAATTTTTAGCAAGAGTTTTTGTTGAGTTTTAATTTAAAAATCATTTGTTAATTTCATCTGATTTTTTTATTTCTCTTTTTACCTTAA GAGATTAAACTGACTACAGATTGAATATAAACAAACAAACAAACAAACAAAAACTCTAAAATGCTGTGGATCAACACCACTTAGTAATTTGTATACTTGGATT CAATTTGCTGAAATTTTGTTAGACATTTTTGCGTCGATATTTATGAGGGATGTTGATCTGTAAAAGTATTAAAATGCCTTTGACAGATAGTGTCACCATATAA AAAACTTTGAACAAAATCAGATTATATCACTGTGGATATTTCTATTTTGAACTAACTTAGATGATAATTTTAATCTATATCCTAGATGAACT Mały fragment chromosomu 21

Co to znaczy? Bez teorii ewolucji nie mielibyśmy możliwości poznania odpowiedzi na to pytanie Odszukujemy geny podobne do genów już zbadanych Możemy badać geny przez odwrotną genetykę tworzenie mutantów u organizmów modelowych Porównując genomy możemy wnioskować o biologii organizmu

Odwrotna genetyka od genu do funkcji Genetyka tradycyjna Genetyka odwrotna Funkcja (mutacja, fenotyp) Gen (z sekwencji całego genomu) Klonowanie genu Inaktywacja genu Analiza sklonowanego genu Analiza uzyskanego fenotypu

Odwrotna genetyka inaktywacja przez rekombinację

Inaktywacja warunkowa

Odwrotna genetyka interferencja RNA Odkrycie roku 2002 regulacyjna rola małych RNA Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie mechanizmu interferencji RNA A. Fire i C. Mello

sirna - jak to dzia a? Efekt degradacja mrna Hannon G.J.: RNA interference, Nature 418, July 11, 2002

Zastosowania sirna Badanie funkcji genów ( odwrotna genetyka ) - szczególnie skuteczne u nicienia Caenorhabditis, ale działa też w komórkach owadów, ssaków i roślin Hamowanie wybranych genów jako metoda leczenia (np. zwalczania wirusów czy nowotworów) przykład: obniżenie poziomu receptora LDL ( zły cholesterol ) u myszy

Ekspresja heterologiczna Wektor ekspresyjny Oczyszczanie białka

Fuzje bia kowe Do sekwencji kodującej białko dołącza się inną domenę, np. ułatwiającą wykrycie i/lub oczyszczanie znaczniki epitopowe GFP (zielone białko fluorescencyjne)

Green Fluorescent Protein- Aequorea victoria

Lokalizacja mitochondrialna nadejsprymowanej hpnpazy-myc w komórkach HeLa. MitoTracker anti-c-myc Nałożenie wt hpnpaza -52 hpnpaza

Ekspresja heterologiczna w biotechnologii

Inżynieria przeciwcia leki przysz ości W łańcuchach immunoglobulin obszary zmienne odpowiadają za rozpoznawanie różnych antygenów, obszary stałe nadają specyficzność gatunkową W klasycznych metodach wytwarzania przeciwciał monoklonalnych uzyskiwano przeciwciała zwierzęce Klonowanie i ekspresja genów kodujących przeciwciała jest alternatywnym sposobem ich uzyskiwania Możliwe jest uzyskiwanie przeciwciał humanizowanych obszary zmienne z genu przeciwciała zwierzęcego wstawione między obszary stałe przeciwciała ludzkiego Humanizowane i rekombinowane ludzkie przeciwciała są stosowane w terapii np. nowotworów

Terapia genowa Zastępująca wprowadzenie genu, którego defekt powoduje chorobę Trudności z opracowaniem wektorów i zapewnieniem ekspresji, zwłaszcza dla komórek nie dzielących się Stosowana dla chorób związanych z ekspresją genów w komórkach krwi (np. SCID gen ADA) i innych, które łatwo wprowadzić do organizmu (np. makrofagi choroba Gauchera) Inaktywująca zmniejszenie ekspresji genu, którego ekspresja powoduje chorobę (np. nowotworową) Technicznie łatwiejsze i bezpieczniejsze (sirna, modyfikowane oligonukleotydy) Ograniczone zastosowania, pacjent musi ciągle przyjmować kosztowne leki