Chemiczna modyfikacja białek

Rozdział 6 Chemiczna modyfikacja białek 6.1. Postulat selektywnej modyfikacji reszt aminokwasowych białka Jedną z wielu wyjątkowych cech białek jest łatwość, z jaką ulegają one zmianom pod wpływem rozmaitych odczynników chemicznych. Wśród ogromnej liczby poznanych do tej pory reakcji chemicznych białek wyróŝnić moŝna w pierwszym rzędzie takie, które badano pod kątem potencjalnych zastosowań do ilościowego oznaczania samych białek lub wchodzących w ich skład aminokwasów. Zachowanie integralności cząsteczek białka nie było konieczne w tego typu zastosowaniach. Reakcje chemiczne, związane z destrukcją struktury białka, stanowią m.in. podstawy zaawansowanych technik analitycznych współczesnej chemii białek, takich jak selektywne chemiczne rozszczepianie łańcuchów polipeptydowych czy oznaczanie sekwencji aminokwasów w peptydach. Techniki te omówiono w dalszych rozdziałach niniejszej monografii. dmienny cel przyświecał badaniom reakcji chemicznych, zachowujących zasadnicze cechy strukturalne białka: integralność wiązań peptydowych oraz naturalną (natywną) konformację łańcucha polipeptydowego. Dopiero te stosunkowo łagodne reakcje zasługują na nazwę chemicznej modyfikacji, gdyŝ słowo to oznacza zmianę, ale nie zniszczenie. Rozbudowana metodyka chemicznej modyfikacji białek wyrosła głównie na gruncie poszukiwań odpowiedzi na pytania typu:, co jest szczególnego w strukturze danego białka, Ŝe ma ono taka a nie inną aktywność?. W przypadku enzymów pytanie to zawęŝa się przede wszystkim to tzw. centrum aktywnego, tj. bocznych reszt aminokwasowych cząsteczki białka, zaangaŝowanych w realizację aktywności katalitycznej. Przydatne dla takich badań metody chemiczne miały zatem słuŝyć moŝliwie selektywnej modyfikacji konkretnych rodzajów reszt aminokwasowych w celu określenia ich udziału w chemicznych, fizycznych i biologicznych właściwościach białek. Stosowane po dziś dzień metody łagodnej, selektywnej modyfikacji reszt aminokwasowych białek są jednym z najuŝyteczniejszych podejść eksperymentalnych w badaniach struktury i funkcji tych biopolimerów. 1

6.2. ZróŜnicowana reaktywność reszt aminokwasowych Reaktywność jednej substancji względem drugiej zaleŝy od właściwości kaŝdej z nich oraz od otoczenia, w którym zostały one umieszczone. Reaktywność jakiejś grupy chemicznej białka z konkretnym odczynnikiem zaleŝy m.in. od wpływu otoczenia na te grupę oraz od zdolności odczynnika do wejścia w to otoczenie. PoniewaŜ białka są stosunkowo duŝe, wiele z tworzących je reszt aminokwasów jest zasłoniętych przed rozpuszczalnikiem i dlatego nie reagują one z rozpuszczonym odczynnikiem modyfikującym. Z drugiej strony, pewne reszty, być moŝe właśnie z powodu obecności w centrum katalitycznym, wykazują nietypowo wysoką reaktywność. kreślenie względnej reaktywności wobec rozmaitych odczynników moŝe pomóc w zdefiniowaniu połoŝenia róŝnych reszt w trójwymiarowej strukturze białka. Takie informacje są niezwykle cenne dla interpretacji wyników badań metodami rentgenografii strukturalnej, natomiast jeśli struktura krystalograficzna białka nie jest znana stanowią źródło informacji o strukturze trzeciorzędowej. 6.2.1. Specyficzność bocznych reszt aminokwasowych RóŜne właściwości chemiczne reszt aminokwasowych stanowią podstawę ich zróŝnicowanej reaktywności (patrz dalsze podrozdziały). Większość odczynników do modyfikacji białek reaguje z więcej niŝ jednym rodzajem reszty. Brak zadowalającej specyficzności ogranicza uŝyteczność szeregu odczynników. Wiele najreaktywniejszych łańcuchów bocznych moŝe występować w róŝnych formach protonacji w zaleŝności od warunków. PoniewaŜ formy te mają zasadniczo róŝne własności chemiczne, ph ma istotny wpływ na przebieg modyfikacji chemicznej tych grup. Reaktywność z wybranym odczynnikiem jest zwykle zdeterminowana przez to, czy w danych warunkach grupa jest sprotonowana czy nie. Przykładowo, anion tyrozyny reaguje szybko z jodem, ale niezjonizowana reszta - bardzo powoli lub wcale. Faktycznie w przypadku większości grup najreaktywniejsza jest najbardziej nukleofilowa forma o najniŝszym stopniu sprotonowania. I tak, przyłączenie protonu do grupy aminowej lub imidazolowej powoduje utratę ich reaktywności względem większości odczynników. Kwas jodooctowy (I-CH 2 -CH), w zaleŝności do warunków, moŝe reagować w róŝnym stopniu z grupami sulfhydrylowymi, aminowymi, imidazolowymi i metionylowymi. Niemal we wszelkich warunkach prędkość reakcji z grupami sulfhydrylowymi jest o wiele większa niŝ z wszystkimi pozostałymi z wymienionych grup, a z kolei prędkość reakcji z tymi ostatnimi jest zróŝnicowana, zwłaszcza w zaleŝności do ph. Wykorzystując róŝnice w prędkościach reakcji róŝnych grup w róŝnych warunkach, moŝna osiągnąć wysoką 2

selektywność, niemal dokładnie taką, jaka jest w danej chwili potrzebna. ChociaŜ ph ma ogromy wpływ na reaktywność grup aminowych i imidazolowych, niemal nie wpływa na reaktywność tioeterowej grupy metioniny. W niskim ph, gdy dwa pierwsze rodzaje grup są sprotonowane, a zatem niereaktywne, moŝna więc selektywnie zmodyfikować metioninę. W środowisku obojętnym, gdzie grupy aminowe są sprotonowane ale imidazolowe nie, ta ostatnia staje się najreaktywniejsza. W jeszcze wyŝszym ph najbardziej reaktywne stają się wreszcie grupy aminowe. Zmiany reaktywności pod wpływem ph są najwygodniejszym sposobem kontrolowania przebiegu wielu typów modyfikacji białek. Niestety, uŝyteczność tego podejścia ograniczona jest przez stosunkowo wąski zakres ph, w którym mieszczą się wartości pk a grup, występujących w białkach (Tabela 6-1). Tabela 6-1: Typowe wartości pk a jonizowalnych grup, występujących w białkach. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Grupa Reszta aminokwasowa Spodziewana wartość pk ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ α-ch koniec karboksylowy 2.1 2.4 β-ch kwas asparaginowy 3.7 4.0 γ-ch kwas glutaminowy 4.2 4.5 imidazoliowa histydyna 6.7 7.1 + α-nh 3 koniec aminowy 7.6 8.0 - SH cysteina 8.8 9.1 + ε-nh 3 lizyna 9.3 9.5 fenolowa tyrozyna 9.7 10.1 guanidyniowa arginina >12 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6.2.2. Grupy wyeksponowane i ukryte Względne połoŝenie róŝnych grup w cząsteczce białka ma oczywiste znaczenie dla fizycznych, chemicznych i biologicznych własności tych biopolimerów. Reszty we wnętrzu makrocząsteczki oddziałują słabiej ze składnikami roztworu niŝ reszty powierzchniowe. ChociaŜ, rzecz jasna, najlepszą metodą określenia lokacji kaŝdej reszty jest rentgenografia strukturalna, częściowych informacji na ten temat dostarczają teŝ badania względnej reaktywności tych reszt względem rozmaitych odczynników chemicznych. MoŜna się 3

spodziewać, Ŝe reszty powierzchniowe mają reaktywność taką, jak te same grupy w prostym peptydzie, natomiast reszty zagrzebane powinny wykazywać reaktywność obniŝoną. ChociaŜ wiele dodatkowych czynników moŝe powodować odchylenia od tej prostej reguły, wyniki uzyskane metodami chemicznymi na ogół są zgodne z przewidywaniami płynącymi z analiz rentgenostrukturalnych. Podział na reszty wyeksponowane i ukryte zastosowano najwcześniej w odniesieniu do reszt tryptofanu i tyrozyny. Są one chromoforami, których własności spektralne zaleŝą od polarności otoczenia. Skądinąd wiadomo, Ŝe wnętrze cząsteczki białka wypełnione jest grupami o charakterze hydrofobowym. Z rozmaitych badań spektroskopowych wynika, Ŝe znaczna część chromoforów tyrozyny i tryptofanu występuje w otoczeniu hydrofobowym i jest trudno dostępna dla hydrofilowego rozpuszczalnika. Istnieje jednak równieŝ frakcja reszt wyeksponowanych, których widma, o cechach wskazujących na otoczenie hydrofilowe, ulegają perturbacji pod wpływem dodawanych do roztworu domieszek rozpuszczalników organicznych. Chemiczne metody określania dostępności reszt tyrozyny i tryptofanu, oparte na badaniach względnej podatności na działanie róŝnych odczynników modyfikujących (np. N-acetyloimidazolu lub tetranitrometanu dla tyrozyny czy N-bromobursztynoimidu dla tryptofanu) prowadzą zwykle do wniosków zgodnych z danymi, uzyskanymi metodami fizykochemicznymi. Liczba i natura reszt ukrytych jest bardzo zmienna w róŝnych białkach. Większe i stosunkowo sztywne białka zwykle mają większą proporcję takich reszt, w porównaniu z białkami małymi i luźno ufałdowanymi. Ukryte reszty moŝna wyeksponować, działając na białka czynnikami denaturującymi takimi jak mocznik, chlorowodorek guanidyny czy bufory o skrajnych wartościach ph. Tym samym frakcję reszt ukrytych określić moŝna, porównując wyniki modyfikacji danej reszty w białku natywnym oraz białku zdenaturowanym. Proporcja reaktywnych, tj. wyeksponowanych reszt jest często zmienna w zaleŝności od rodzaju uŝytego odczynnika. Uwarunkowane to jest rozmaitą zdolnością odczynników do penetrowania głębszych, bardziej hydrofobowych regionów cząsteczki białka. ChociaŜ koncepcja reszt ukrytych i wyeksponowanych pierwotnie odnosiła się tylko do reszt hydrofobowych, została później rozciągnięta na inne typy reszt. Tym samym obniŝona reaktywność reszt konkretnego typu jest często automatycznie interpretowana jako wynik ukrycia reszty we wnętrzu makrocząsteczki. Zmiany w liczbie reaktywnych grup, rejestrowane w trakcie tworzenia rozmaitych dwucząsteczkowych kompleksów, wykorzystywane były czasem do oceny wielkości powierzchni oddziaływania lub zakresu zmian konformacyjnych towarzyszących wiązaniu. Warianty tych procedur znalazły szerokie 4

zastosowanie do identyfikacji reszt aminokwasowych, występujących w centrach aktywnych, co w sposób bardziej szczegółowy omawiane jest w kolejnym podrozdziale. 6.3. Modyfikacja reszt aminokwasowych, istotnych dla aktywności białka 6.3.1. Miejsca aktywne i grupy istotne Badanie zaleŝności własności białka od konkretnych reszt aminokwasowych stanowi aktualnie najwaŝniejszą dziedzinę zastosowań chemicznej modyfikacji tych biopolimerów. Słabym punktem tych metod jest niemoŝność rozróŝnienia reszt absolutnie niezbędnych dla aktywności od takich, które są po prostu obecne w centrum aktywnym, czy teŝ przylegają do tego obszaru albo w jakiś inny sposób są pośrednio powiązane z badanym rodzajem aktywności. Jednak i tak aktualne koncepcje centrów aktywnych na ogół nie definiują precyzyjnie ich granic. ChociaŜ tendencja do rozwaŝania aktywnych miejsc jako ograniczonych obszarów na powierzchni białka jest współcześnie dobrze ugruntowana, nie oznacza to wcale, Ŝe znacznie większe fragmenty makrocząsteczki nie są waŝne dla jej funkcji. W przeszłości, typowym podejściem w badaniach katalitycznie waŝnych reszt była modyfikacja prawie wszystkich reszt danego rodzaju i oznaczanie, czy ta modyfikacja spowodowała utratę lub zmianę danej aktywności. Badania tego rodzaju zostały zastąpione przez modyfikacje mniej intensywne i ich korelowanie z obserwowanymi zmianami aktywności biologicznej. Resztami istotnymi nazywa się grupy, które są zaangaŝowane w rozpatrywany rodzaj aktywności. pisane wyŝej aktywne centra składają się z jednej lub kilku takich reszt. Z operacyjnego punktu widzenia, grupy istotne to takie, których modyfikacja pociąga za sobą utratę aktywności białka. Zakłada się, Ŝe inaktywacja wynika ze zmiany w charakterze chemicznej tej grupy. Tego, Ŝe modyfikacja funkcjonalnie witalnej grupy nie zawsze musi prowadzić do utraty aktywności, zwykle nie bierze się pod uwagę. Z praktycznego punktu widzenia waŝniejsze są fałszywe grupy istotne, których modyfikacja powoduje eliminację rozpatrywanej aktywności wskutek efektów wtórnych. Identyfikacja takich grup, chociaŝ często niezmiernie trudna, jest jednak niezbędna dla prawidłowej interpretacji zaleŝności pomiędzy funkcją a chemiczną strukturą. Gdy modyfikacja reszty aminokwasowej w białku prowadzi do utraty aktywności, resztę tę zwykle rozwaŝa się jako istotną. Czasem jednak taka naiwna dedukcja okazuje się nieprawidłowa. Przykładowo, inaktywacja moŝe być pozorna, gdyŝ oznaczana jest w 5

warunkach standardowych a faktycznie nastąpiło tylko przesunięcie optimum ph i po korekcie kwasowości buforu aktywność zostaje uwidoczniona. Dalej, jeśli enzym wykazuje aktywność katalityczną wobec kilku substratów, zdarza się, Ŝe modyfikacja chemiczna powoduje większy spadek aktywności wobec jednego substratu niŝ wobec innych. Utratę aktywności wskutek modyfikacji reszt odmiennych od tych, które występują w centrum aktywnym (a więc reszt faktycznie nieistotnych ) tłumaczy się zwykle w sposób dwojaki, albo jako skutek sterycznego zablokowania przez podstawnik albo jako konsekwencję zmiany konformacyjnej białka. Pierwszą z moŝliwości moŝna czasem zweryfikować przez porównanie efektów modyfikacji białka za pomocą dwóch podobnych odczynników, znacznie róŝniących się wielkością wprowadzanego do białka podstawnika. Zmiany konformacyjne białka, które często zachodzą wskutek modyfikacji chemicznej, moŝna natomiast wykrywać rozmaitymi metodami fizykochemicznymi, np. spektroskopią dichroizmu kołowego. Najmniej wątpliwości budzić moŝe sytuacja, gdy modyfikacja chemiczna białka nie pociąga za sobą zmiany badanej aktywności. Dowodzi to raczej jednoznacznie, Ŝe reszty ulegające danej modyfikacji nie są dla aktywności istotne. 6.3.2. Chemiczna modyfikacja czy mutageneza punktowa? Mimo wszystkich wymienionych wyŝej, raczej oczywistych ograniczeń, metoda chemicznej modyfikacji pozostaje po dziś dzień najprostszym i najbardziej bezpośrednim sposobem identyfikacji reszt aminokwasowych istotnych dla funkcji białka. Znane są odpowiednio selektywne reakcje chemiczne wobec reszt kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, histydyny, lizyny, argininy, metioniny, tryptofanu, tyrozyny i cysteiny. Dostępnych jest ponadto kilka mniej satysfakcjonujących metod modyfikacji reszt seryny, treoniny, asparaginy i glutaminy. Niedostępne natomiast dla metod łagodnej modyfikacji chemicznej są reszty glicyny, alaniny, waliny, leucyny, izoleucyny, fenyloalaniny i proliny, gdyŝ łańcuchy boczne tych aminokwasów nie zawierają odpowiednio reaktywnych grup. Na szczęście to właśnie reaktywne grupy wymagane są dla waŝnych aktywności biologicznych białek, przeto metoda chemicznej modyfikacji pozwala na testowanie wszystkich potencjalnie funkcjonalnych rodzajów reszt aminokwasowych. Rozwinięta ostatnio technologia inŝynierii genetycznej białek pozwala na zastosowanie mutagenezy punktowej, dzięki której moŝliwe jest wprowadzanie do białka zmian o wiele bardziej specyficznych niŝ za pomocą tradycyjnej chemicznej modyfikacji. Korzystając ze specyficzności aparatu genetycznego, zmienia się wyłącznie konkretne reszty aminokwasowe, 6

w pojedynczych, ściśle określonych pozycjach łańcucha polipeptydowego. Mogą to być teŝ wymienione wyŝej reszty, niedostępne dla metod chemicznej modyfikacji. Metoda mutagenezy punktowej ma jednak ograniczenia, gdyŝ przed jej zastosowaniem muszą być wstępnie znane kandydatury na reszty istotne. Jeśli nie wiadomo byłoby, które reszty mogą być istotne, zbyt wielka liczba reszt musiałaby być testowana genetycznie. Takich informacji dostarczyć jednak moŝe z łatwością metoda chemiczne modyfikacji, tak więc obie metody są nie tyle konkurencyjne, co komplementarne. Chemiczna modyfikacja pozwala na wyselekcjonowanie reszt, które mogą być istotne; inŝynieria genetyczna pozwala na określenie szczegółowej ich roli w funkcji biologicznej białka. 6.3.3. chrona grup centrum aktywnego przez substrat W przypadku wielu enzymów, substraty lub spokrewnione z nimi związki skutecznie chronią istotne reszty, występujące w centrum aktywnym, przed modyfikacją chemiczną. RóŜnicowe znakowanie (tzn. najpierw modyfikacja w obecności substratu a potem bez niego) pozwala na identyfikację tych reszt. JeŜeli aktywność została zachowana po modyfikacji w obecności substratu ale w jego nieobecności nastąpiła inaktywacja, zwykle zakłada się, Ŝe aktywne centrum było chronione przez substrat. JeŜeli po modyfikacji w obecności substratu usunie się go a następnie ponownie przeprowadzi się modyfikację, tym razem połączoną z wprowadzeniem piętna radioaktywnego, z ilości znacznika przyłączonego do białka moŝliwe będzie określenie liczby reszt, których modyfikacja jest odpowiedzialna za inaktywację. Dzięki radioaktywnemu znacznikowi, po chemicznej lub enzymatycznej degradacji łańcucha polipeptydowego moŝliwa jest izolacja i identyfikacja fragmentu centrum aktywnego. Aczkolwiek określanie takich fragmentów mianem centrów aktywnych moŝe czasem być błędne, gdyŝ ochrona za pomocą substratu moŝe dotyczyć reszt spoza centrum, chronionych przez zmianę strukturalną cząsteczki enzymu, towarzyszącą wiązaniu substratu. 6.3.4. dczynniki selektywne wobec centrum aktywnego DąŜąc do wygodniejszego oznaczania grup istotnych wynaleziono tzw. odczynniki specyficzne miejscowo (ang. site-specific reagents). dczynniki te zaprojektowano tak, aby niekowalencyjnie łączyły się z konkretnymi miejscami na powierzchni białka, a następnie reagowały z resztami w tym miejscu lub w jego pobliŝu. JeŜeli wiązanie kowalencyjne, wytworzone w drugim etapie, jest stabilne w warunkach chemicznego lub enzymatycznego rozszczepiania łańcucha polipeptydowego, moŝna zidentyfikować i scharakteryzować 7

fragmenty pochodzące z wyznakowanego miejsca. dczynniki tego rodzaju dzieli się na: substraty jako znaczniki, pseudo-substraty oraz znaczniki bioswoiste (ang. affinity labels). Znakowanie substratami Substrat enzymu jest chyba przykładem najlepszego odczynnika specyficznego miejscowo. Niestety, wiązania tworzone między enzymami a ich substratami są zwykle nietrwałe i przejściowe. Specyficzność ich oddziaływania była jednak motorem do poszukiwań sposobów utrwalania tych wiązań. Na tej zasadzie oparte są np. metody specyficznej modyfikacji centrów aktywnych takich enzymów, w których cyklu katalitycznym występuje przejściowy związek o charakterze zasady Schiffa. Nietrwałe wiązanie podwójne w tym addukcie moŝna ustabilizować przez redukcję borowodorkiem sodu. Na rys. 6-1 zilustrowano schematycznie ten sposób modyfikacji, zastosowany do enzymu aldolazy. Rysunek 6-1: Znakowanie substratem centrum aktywnego aldolazy. Pseudo-substraty Proteinazy serynowe (trypsyna, chymotrypsyna itd.) oraz wiele esteraz (np. acetylocholinoesteraza) ulegają inaktywacji pod wpływem diizopropylofluorofosforanu (DFP, wzór strukturalny na rys. 6-2) wskutek jego reakcji z istotną katalitycznie resztą seryny w centrum aktywnym. We wszystkich wymienionych enzymach sekwencja aminokwasów wokół reaktywnej reszty seryny centrum aktywnego jest bardzo podobna. H 3 C CH H 3 C P F CH H 3 C CH 3 Rysunek 6-2: Przykład pseudo-substratu: diizopropylofluorofosforan (DFP). 8

Typowe reszty seryny, tj. inne reszty seryny w tych samych enzymach czy reszty seryny w innych białkach, nie reagują w tych samych warunkach. Chemiczne podstawy nietypowej reaktywności reszty seryny centrum aktywnego nie są w pełni zrozumiałe, ale wiadomo, Ŝe jest ona uzaleŝniona od natywnej struktury enzymu. Denaturacja enzymu znosi reaktywność względem DFP. DFP nazywa się pseudo-substratem, gdyŝ posiada pewne cechy wspólne z właściwymi substratami. Elektrofilowy atom fosforu DFP reaguje z nukleofilową grupą reaktywnej reszty seryny. Następuje eliminacja jonu fluorkowego i tworzy się stabilny addukt, diizopropylofosfoenzym, pod pewnymi względami przypominający acylo-enzym - naturalny produkt pośredni powstający w trakcie normalnej hydrolitycznej reakcji, katalizowanej przez wymienione enzymy. Znaczniki bioswoiste Bioswoiste znakowanie centrów aktywnych białek wykorzystuje normalne oddziaływania enzym-substrat aby zapewnić wysokie, lokalne stęŝenie odczynnika modyfikującego wokół centrum aktywnego. UzaleŜnione jest teŝ od zdolności reaktywnej grupy w cząsteczce odczynnika do tworzenia stabilnego wiązania kowalencyjnego z enzymem. Bioswoisty znacznik jest zatem zwykle analogiem substratu, zawierającym reaktywną grupę o niekoniecznie wysokiej specyficzności względem określonych rodzajów reszt aminokwasowych. Jest to wyrafinowana technika modyfikacji chemicznej białek, której zakres współcześnie wciąŝ się poszerza. Jej dokładniejsze omówienie znaleźć moŝna m.in. w literaturze uzupełniającej do niniejszego rozdziału (pozycje 1 i 2). W tym miejscu ograniczymy się do omówienia jednego z najwcześniejszych, ale spektakularnych zastosowań. Za pomocą chlorometyloketonu tosylofenyloalaniny (TPCK, rys. 6-3) moŝna bardzo specyficznie alkilować resztę histydyny w centrum aktywnym α-chymotrypsyny. 9

+ NH 3 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH C CH 2 CH C CH 3 S 2 NH CH 2 Cl CH 3 S 2 NH CH 2 Cl TPCK TLCK Rysunek 6-3: Przykłady bioswoistych znaczników dla α-chymotrypsyny (TPCK) oraz trypsyny (TLCK) dczynnik został tak zaprojektowany, aby posiadał strukturalną cechę przypominającą substrat, która kieruje go do centrum aktywnego, gdzie reaktywna cześć chlorometylowa nieodwracalnie łączy się z reaktywną resztą histydyny. TPCK nie wywiera wpływu na trypsynę, która hydrolizuje wiązania peptydowe utworzone przez zasadowe aminokwasy: lizynę i argininę, ale nie wiązania utworzone przez aminokwasy hydrofobowe: tyrozynę i fenyloalaninę, preferowane przez α-chymotrypsynę. Jednak podobny odczynnik, chlorometyloketon tosylolizyny (TLCK), przypominający substrat trypsyny, specyficznie i stechiometrycznie inaktywuje trypsynę. ba odczynniki są specyficzne względem konkretnego enzymu i reagują tylko z niezdenaturowanymi enzymami. 6.3.5. znaczanie liczby reszt istotnych Ilościowe oznaczanie reszt istotnych moŝliwe jest na róŝnych drogach. W przypadkach, gdy obserwowana jest ochrona reszty istotnej przez substrat, skuteczna moŝe okazać się róŝnicowa modyfikacja w obecności i nieobecności substratu i dalsze oznaczenie liczby reszt, które uległy protekcji przez substrat. Jeden z najogólniejszych sposobów oszacowania liczby reszt istotnych opracowany został przez Tsou (1962) i nazywany jest czasem metodą statystyczną. Polega on na badaniu korelacji pomiędzy stopniem inaktywacji białka o stopniem modyfikacji danego rodzaju reszt aminokwasowych w szeregu próbek białka niecałkowicie zinaktywowanego. Większość skutecznych zastosowań tej metody opiera się na najprostszym z przedstawionych przez Tsou modeli inaktywacji, zakładającym, Ŝe n reszt ulegających modyfikacji, wykazujących jednakową reaktywność względem odczynnika modyfikującego, zawiera i reszt istotnych, przy czym modyfikacja dowolnej reszty istotnej prowadzi do całkowitej inaktywacji. 10

Wówczas aktywność resztowa (a), wyraŝona jako frakcja aktywności białka natywnego, jest proporcjonalna do średniej liczby zmodyfikowanych reszt (m) zgodnie z równaniem: a 1/i = (n - m) / n Wartość i określona jest przez tą z szeregu zaleŝności a od m (tzw. wykresów Tsou), dla której otrzymuje się najlepsze dopasowanie linii prostej (tj. najwyŝszą wartość współczynnika korelacji prostoliniowej). Przykład takiej analizy przedstawiono na rys. 6-4. Rysunek 6-4: Zastosowanie statystycznej metody Tsou w celu oszacowania liczby istotnych reszt argininy w białku wiąŝącym ryboflawinę z jaj kurzych (RfBP) w oparciu o wyniki modyfikacji tego białka przy uŝyciu 1,2-cykloheksanodionu. Wykresy Tsou sporządzono na podstawie szeregu próbek zmodyfikowanego RfBP, dla których jednocześnie oznaczono aktywność tj. pojemność wiązania ryboflawiny (wyraŝoną jako frakcja aktywności białka niezmodyfikowanego, a) oraz stopniem modyfikacji (wyraŝonym jako średnia liczba reszt zmodyfikowanych m). Przedstawiono zaleŝności a 1/i od m dla i=1 ( ), i=2 ( ) oraz i=3 ( ). Do kaŝdej serii punktów dopasowano prostą regresji; odpowiednie współczynniki korelacji wynosiły 0.932, -0.898 oraz 0.891. Wynika stąd, Ŝe tylko jedna reszta argininy jest istotna dla aktywności wiązania ryboflawiny przez RfBP. Postać wykresów Tsou sugeruje, Ŝe część reszt argininy w RfBP, szybko reagujących z odczynnikiem, nie jest istotna dla wiązania. JeŜeli liczbę takich reszt oznaczymy jako s, a liczbę reszt wolniej reagujących, wśród których występują reszty istotne, oznaczymy jako p, to w sytuacji gdy m > s spełniona powinna być zaleŝność a 1/i = (p + s - m) / p. Prosta regresji, najlepiej pasująca do przedstawionych danych doświadczalnych (a = 1,91 0,37 m) jest zgodna z tym modelem dla s = 2, p = 3 oraz i = 1. (Zaczerpnięto z literatury źródłowej, pozycja 3). Inna, nieco trudniejsza metoda wyznaczania liczby reszt istotnych, nazywana metodą kinetyczną, zaproponowana została przez Raya i Koshlanda (1961). piera się ona na porównaniu krzywych kinetycznych obu procesów, tj. modyfikacji i inaktywacji, z prostymi modelami teoretycznymi. Badania prowadzi się w warunkach pseudo-pierwszorzędowych, realizowanych zwykle przez bardzo duŝy nadmiar odczynnika modyfikującego. Upraszcza to 11

kinetykę i ułatwia interpretację. W najprostszym modelu rozwaŝa się prostą modyfikację istotnych reszt aminokwasowych. ZałóŜmy, Ŝe makrocząsteczka posiada n reszt reaktywnych x 1, x 2,... x n, dla których stałe szybkości wynoszą odpowiednio k 1, k 2,..., k n. Frakcje poszczególnych reszt, które po czasie t pozostały niezmodyfikowane, określają równania: x 1 / (x 1 ) 0 = e - k 1 t... x n / (x n ) 0 = e - k t n ZałóŜmy ponadto, Ŝe niektóre z tych reszt aminokwasowych są istotne w tym sensie, Ŝe modyfikacja dowolnej z nich powoduje całkowitą utratę aktywności enzymu. Względna aktywność pozostająca po dowolnym czasie dana jest przez prawdopodobieństwo znalezienia cząsteczki białka, w której wszystkie reszty istotne są nienaruszone. JeŜeli istotne są reszty x i,... x i+j, zaleŝność aktywności od czasu opisuje równanie: a / a 0 = e -k a t = (e -k i t ) (e -k i+1 t )... (e -k i+j t ) A zatem k a jest równe sumie k i,... k i+j reszt, istotnych dla mierzonej aktywności. JeŜeli n reszt wykazuje tę samą reaktywność, tj. k 1 = k 2 =...k n = k χ, a i spośród nich jest istotnych, to wtedy: k a = i k χ Metoda kinetyczna pozwala podzielić reszty aminokwasowe białka na odrębne klasy, róŝniące się reaktywnością względem odczynnika modyfikującego. Przykład zastosowania tej metody przedstawiono na rys. 6-5. Rysunek 6-5: Zastosowanie kinetycznej metody Raya i Koshlanda w celu oszacowania liczby istotnych reszt argininy w białku wiąŝącym ryboflawinę z jaj kurzych (RfBP) w oparciu o wyniki modyfikacji tego białka przy uŝyciu 1,2- cykloheksanodionu. Pojemność wiązania ryboflawiny (a, ) oraz względną zawartość argininy (χ, ) mierzono w tych samych próbkach w funkcji czasu reakcji. Wykres zaleŝności czasowej dla modyfikacji rozłoŝono graficznie na dwie krzywe pseudopierwszorzędowego zaniku. Pseudo-pierwszorzędowa stała szybkości modyfikacji wolno reagujących reszt argininy jest bardzo zbliŝona do stałej prędkości inaktywacji białka. Wynik ten sugeruje, Ŝe jedna z wolno reagujących reszt argininy jest istotna dla 12

aktywności wiązania ryboflawiny. Do tego samego wniosku doprowadziła analiza tego układu metodą Tsou (rys. 6-4). Cząsteczka RfBP zawiera 5 reszt argininy. (Zaczerpnięto z literatury źródłowej, pozycja 3). Jak juŝ wspomniano, reszty aminokwasowe znajdujące się w centrum aktywnym bardzo często wykazują reaktywność, zdecydowanie róŝną od pozostałych grup tego rodzaju w danym białku. Najczęściej jest to reaktywność bardzo wysoka. Grupy takie stanowią zatem samoistnie wyodrębnioną klasę szybko reagującą z odczynnikiem modyfikującym. Przez odpowiedni dobór warunków reakcji moŝna ograniczyć modyfikację tylko do tych reszt. dpowiednio zaprojektowane odczynniki, wykorzystujące to zjawisko, mogą być uŝyte do selektywnego oznaczania reszt obecnych w centrum aktywnym. Szczególnie często spotykamy się z hiperreaktywnością grup sulfhydrylowych obecnych w centrach aktywnych róŝnych klas enzymów 6.3.6. Modyfikacja odwracalna Dobry dowód, Ŝe zmiany we własnościach białka są rzeczywiście wynikiem modyfikacji chemicznej tego biopolimeru, moŝna uzyskać usuwając modyfikującą grupę i prezentując powrót oryginalnych własności. Z tych względów jest bardzo poŝądane dysponowanie odczynnikami, które modyfikują reszty aminokwasowe w ten sposób, Ŝe moŝliwe jest późniejsze odtworzenie oryginalnej reszty. Takie odczynniki mogą być równieŝ uŝyteczne w celu tymczasowego zapobiegania reakcji reszt z innymi odczynnikami. Tego rodzaju podejście jest zadziwiająco rzadko stosowane, chociaŝ znanych jest wiele odczynników, których modyfikujące działanie jest potencjalnie odwracalne (patrz dalsze podrozdziały). 6.4. Modyfikacja chemiczna w celu zmiany struktury białka 6.4.1. Zmiany stanu jonizacji oraz konformacji białka Cząsteczki białka są naładowane elektrycznie, gdyŝ zawierają charakterystyczną liczbę zarówno anionowych jak i kationowych grup. Modyfikacja określonego typu naładowanych grup moŝe zmieniać ładunek netto makrocząsteczki, co moŝe powodować zniszczenie jej charakterystycznych własności. Wskutek takich modyfikacji często zachodzić zatem mogą: obniŝenie rozpuszczalności, zmiany konformacji cząsteczki oraz zmiany stopnia agregacji. Drobne zmiany konformacyjne mogą być trudno wykrywalne metodami fizyko-chemicznymi, 13

ale wciąŝ mogą znacząco wpływać na aktywność biologiczną. Natomiast zmiany stopnia agregacji na ogół łatwo stwierdzić. ChociaŜ większość modyfikacji chemicznych białek prowadzi się z nadzieją zminimalizowania takich zmian (określanych ogólnie jako denaturacja ), w pewnych przypadkach zmiany konformacji lub stopnia agregacji stają się poŝądanym celem. Przykładem odczynnika, stosowanego w tych celach, jest bezwodnik bursztynowy. Bursztynylacja powoduje ulokowanie anionowej grupy C - w miejsce kationowej grupy -NH + 3, co oznacza zmianę ładunku cząsteczki białka netto o dwie jednostki na kaŝdą zmodyfikowaną grupę. Nowe oddziaływania elektrostatyczne, trochę podobne do tych, jakie występują w białku niezmodyfikowanym w wysokim ph, mogą powodować dysocjację oligomerycznych białek na podjednostki (rys. 6-6). Bursztynylacja symuluje zatem dysocjujący wpływ wysokiego ph ale w warunkach, w których aktywność biologiczna moŝe zostać zachowana. Rysunek 6-6: Schemat ilustrujący wpływ bezwodnika bursztynowego na równowagę dysocjacji oligomerycznego białka na jego podjednostki. Znaczna zmiana ładunku netto cząsteczki białka poddanego bursztynylacji powoduje jej rozpulchnienie, a zarazem często zwiększenie rozpuszczalności. MoŜna zatem próbować tego typu modyfikacji w celu solubilizacji trudno rozpuszczalnych białek. 6.4.2. Redukcja i reoksydacja wiązań disiarczkowych W białkach tylko wiązania disiarczkowe są podatne na łagodną redukcję. Pełna redukcja tych wiązań na ogół wymaga całkowitego zniszczenia struktury trzeciorzędowej białka, np. przez działanie mocznika. Traktowanie takich zredukowanych białek kwasem jodooctowym lub akrylonitrylem moŝna zastosować w celu zablokowania wygenerowanych grup sulfhydrylowych i tym samym zapobiegnięcia odtwarzaniu mostków disiarczkowych po usunięciu czynnika redukującego. Wiele zredukowanych i całkowicie rozwiniętych białek, jeśli nie zostały poddane powyŝszej alkilacji, odzyskuje aktywność biologiczną po powrocie do niedenaturujących warunków i łagodnym utlenianiu na powietrzu. Tego rodzaju badania stały się podstawą hipotezy, Ŝe cała informacja niezbędna dla prawidłowego ufałdowania cząsteczki białka zawarta jest w jego strukturze pierwszorzędowej. 14

6.4.3. dczynniki spinające białka (odczynniki dwufunkcyjne) dczynniki zawierające dwie reaktywne grupy stosuje się w celu wprowadzania do białek wiązań krzyŝowych, zarówno wewnątrzcząsteczkowych jak i międzycząsteczkowych (rys. 6-7). Zastosowanie tych odczynników spinających (ang. cross-linking reagents) rozwaŝymy w kontekście dwóch typów pochodnych jakie mogą się tworzyć. Rysunek 6-7: Schemat reakcji sieciowania białka przy uŝyciu 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzenu Wewnątrz cząsteczkowe wiązania krzyŝowe wprowadza się przede wszystkim dla stabilizacji struktury trzeciorzędowej oraz szacowania odległości między grupami. Ten ostatni cel osiągnąć moŝna przez oznaczenie konkretnych aminokwasów, które łączą się z głowami indywidualnych odczynników dwufunkcyjnych. UŜywając róŝnych odczynników, lub, lepiej, serii homologicznych odczynników, w których głowy rozdzielone są łańcuchami o róŝnej długości, moŝna określić względne odległości pomiędzy róŝnymi grupami. Zwykle potrzebne są jeszcze uzupełniające badania z analogicznymi odczynnikami monofunkcyjnymi, aby wykryć uboczne zaburzenia, związane z modyfikacją. Międzycząsteczkowe wiązania krzyŝowe mogą łączyć ze sobą cząsteczki tego samego lub róŝnego rodzaju. trzymane produkty mogą być wykorzystywane jako modele dla badań oddziaływań białko-białko, jako wielkocząsteczkowe analogi jednego lub obu składowych białkowych, albo jako substancje łączące poŝądane atrybuty oby komponent w jednej cząsteczce. Międzycząsteczkowe wiązania moŝna teŝ zastosować w celu sprzęgnięcia biologicznie aktywnych cząsteczek do nierozpuszczalnych nośników oraz w celu sprzęgnięcia sąsiadujących ze sobą podjednostek białka oligomerycznego jako sposobu określenia ich układu geometrycznego. Warunki reakcji w znacznej mierze decydują o tym, czy przewaŝać będą wiązania wewnątrzczy międzycząsteczkowe. Przy wysokich rozcieńczeniach białka, faworyzowane jest tworzenie wiązań wewnątrzcząsteczkowych. Główne parametry, decydujące o ostatecznym rodzaju produktu, to stęŝenie białka, stosunek odczynnika do białka oraz czynniki takie jak ph czy siła jonowa do tego stopnia, w jakim wpływają one na oddziaływanie białko-białko w trakcie przebiegu modyfikacji. Aktualnie dostępna handlowo jest ogromna liczba odczynników sieciujących baiłka, obejmujących najrozmaitsze kombinacje grup reaktywnych. Dokładne omówienie własności i 15

zakresu zastosowań tych odczynników znaleźć moŝna w literaturze uzupełniającej do niniejszego rozdziału (pozycje 2 i 3). 6.4.4. Sprzęganie białek ze stałymi nośnikami (unieruchamianie) Aktywne biologicznie białka, sprzęgnięte z nierozpuszczalnymi w wodzie nośnikami lub uwięzione w nierozpuszczalnych w wodzie matrycach, mogą budzić zainteresowanie zarówno teoretyczne jak i praktyczne. W celu otrzymania takich materiałów opracowano duŝą liczbę technik, z których szereg pozwala na zachowanie znacznej części aktywności biologicznej unieruchamianego białka. Na poziomie teoretycznym, takie białka mogą słuŝyć jako modele białek związanych z błonami. ddziaływanie unieruchomionych białek z substratami jest interesujące z punktu widzenia kinetyki enzymatycznej, ilustrując wpływ zawad sterycznych oraz ograniczonej dostępności na aktywność enzymu. W odniesieniu do wielkocząsteczkowych substratów, preparaty takie są szczególnie uŝyteczne, umoŝliwiając ograniczanie działania enzymu. Nierozpuszczalność w wodzie pozwala na bardzo wygodne mechaniczne oddzielanie białka od substratu; takie preparaty białkowe moŝna pakować w kolumny, przez które przepływa roztwór rozpuszczalnego substratu. Zmieniając prędkość przepływu przez taką kolumnę, moŝna kontrolować stopień konwersji substratu. Sprzęganie białek do stałych nośników chromatograficznych stanowi podstawę części technik preparatyki biochemicznej, zaliczanych do tzw. chromatografii powinowactwa (patrz rozdział 3.5). Technologia unieruchamiania białek omówiona jest dokładniej w literaturze uzupełniającej do niniejszego rozdziału (pozycja 5). 6.5. Wprowadzanie do białek grup specjalnych 6.5.1. Zmiana podatności na proteolizę Enzymatyczna hydroliza wiązań peptydowych zaleŝy od rozpoznania rozszczepialnego wiązania przez konkretny enzym. Wiele proteolitycznych enzymów, w szczególności te, które są powszechnie stosowane do degradacji łańcuchów polipeptydowych dla celów analizy sekwencji aminokwasów, mają dość wąską specyficzność substratową a zatem rozcinają łańcuch w ograniczonej liczbie miejsc. Przykładowo, trypsyna hydrolizuje wiązania utworzone przez karboksylowe grupy lizyny i argininy. W korzystnych przypadkach taka ograniczona proteoliza prowadzi do powstawania ograniczonej liczby peptydów, które moŝna 16

wyizolować i indywidualnie oczyścić. Jednak aby ułatwić sekwencjonowanie takich peptydów, czasem wskazane jest zmniejszenie albo zwiększenie liczby punktów cięcia. Grupy ε-aminowe lizyny są podatne na takie rodzaje modyfikacji chemicznej, które czynią przyległe wiązania peptydowe odpornymi na hydrolizę przez trypsynę. Dla tych celów uŝyteczna jest zarówno trifluoroacetylacja jak i amidynacja, gdyŝ modyfikujące grupy moŝna później łatwo usunąć, regenerując podatność wiązania na działanie trypsyny. W trakcie trawienia tak zablokowanego łańcucha polipeptydowego, rozcinane są tylko wiązania tuŝ za resztami argininowymi. Frakcjonowanie i oczyszczanie powstałych peptydów, oraz dalsze usunięcie grup blokujących i ponowne traktowanie trypsyną, powoduje rozcinanie wiązań lizylowych. Dość łatwa analiza ostatecznie otrzymanych peptydów znakomicie ułatwia problem sekwencjonowania. Podobnie, modyfikacja grup guanidynowych argininy powoduje ich przekształcenie w reszty nie rozpoznawane przez trypsynę. Przykładowo, traktowanie białka przez 1,2- cykloheksanodion pozwala ograniczyć fragmentację łańcucha do wiązań za resztami lizynowymi. Niestety, Ŝadne znane modyfikacje reszt argininowych nie są w pełni odwracalne, co ogranicza ich uŝyteczność w analizach sekwencji. Czasem, na odwrót, potrzebne jest zwiększenie liczby hydrolizowalnych wiązań peptydowych. Dla tych celów opracowano metody modyfikacji reszt cysteinowych przy uŝyciu 2-bromoetyloaminy lub etylenoiminy, prowadzących do utworzenia reszt S-(2-aminoetylo)cyteinylowych. Są one na tyle podobne do reszt lizynowych, Ŝe rozpoznaje je trypsyna, rozcinając występujące za nimi wiązanie peptydowe. 6.5.2. Wzmacnianie immunogenności Często stosowaną techniką immunochemiczną jest modyfikacja chemiczna białek w celu wprowadzenia grup, zdolnych do indukcji wytwarzania przeciwciał po wstrzyknięciu adduktu do zwierzęcia doświadczalnego. Ta zdolność nazywa się immunogennością, a grupy wprowadzane do białek w celu jej wzmocnienia nazywa się haptenami. Same hapteny nie wywołują wytwarzania przeciwciał, jeśli nie są przyłączone do białka. Hapteny są uŝyteczne dla zwiększania immunogenności słabo immunogennych białek oraz dla kierowania produkcji przeciwciał na specyficzne, chemicznie zdefiniowane determinanty. Przyłączanie haptenów do białek realizuje się najczęściej na drodze reakcji z solami diazoniowymi lub z halogenkami arylowymi. ChociaŜ bardzo róŝne związki wykorzystywano w charakterze haptenów, najskuteczniejsze okazywało się stosowanie grup aromatycznych. 17

Przeciwciała skierowane przeciw haptenowi mają zdolność do wiązania się zarówno z immunogennym koniugatem, jak i osobno z częścią białkową oraz częścią haptenową. PoniewaŜ tworzenie kompleksu pomiędzy przeciwciałem a małą cząsteczką jest znacznie mniej skomplikowane niŝ pomiędzy przeciwciałem a duŝym antygenem, badania oddziaływań hapten-przeciwciało znakomicie przyczyniły się do naszego zrozumienia mechanizmów oddziaływania przeciwciało-antygen. Tworzenie kompleksów typu haptenprzeciwciało moŝna traktować tak jak inne oddziaływania białek z małymi ligandami. Stosunkowo proste techniki fizykochemiczne pozwalają wyznaczyć takie parametry jak stałe równowagi kompleksowania, stałe prędkości asocjacji i dysocjacji oraz liczbę miejsc wiąŝących ligand w cząsteczce białka. Dla przykładu, łatwo śledzić moŝna wpływ modyfikacji przeciwciała na zdolność tworzenia kompleksu z haptenem. Badając wiązanie serii spokrewnionych chemicznie haptenów, moŝna wysnuwać wnioski co do wpływu struktury na wiązanie. Badania wiązania haptenów do przeciwciał okazały się waŝnym źródłem informacji o wymaganiach strukturalnych dla reakcji przeciwciało-antygen. 6.5.3. Wprowadzanie do białek sond wraŝliwych na charakter lokalnego otoczenia Grupy, których własności spektralne silnie zaleŝą od środowiska, moŝna przyłączyć do białek i wykorzystać w celu monitorowania róŝnych aspektów białkowego otoczenia. Zmiany konformacji białka czy wszelkie inne zmiany wpływające na te znaczniki znajdują swe odzwierciedlenie w zmianach charakterystyki spektralnej znacznika. PoniewaŜ zwykle interesuje nas białko natywne, wprowadzenie znacznika nie moŝe znacząco zmieniać własności tej formy białka. Stosując rozmaite techniki znakowania skierowanego w konkretne miejsca, moŝna monitorować te miejsca oraz śledzić zmiany, towarzyszące specyficznym oddziaływaniom, takim jak np. wiązanie substratu czy inhibitora. Znaczniki fluorescencyjne Wprowadzanie fluoryzujących znaczników do białek wykorzystywane jest do lokalizowania białek w tkankach, demonstrowania oddziaływań białek z innymi molekułami oraz sondowania struktury białka. Techniki fluorescencyjne są szczególnie przydatne ze względu na ich wysoką czułość. Wiadomo, Ŝe same białka mają właściwości fluorescencyjne dzięki obecności w ich składzie fluoryzujących reszt tryptofanu i tyrozyny. Parametry widma emisji tryptofanu są bardzo wraŝliwe na wpływ otoczenia (polarność, obecność wygaszaczy fluorescencji). Maksimum emisji wolnego tryptofanu w roztworze wodnym występuje przy 353 nm (wzbudzenie przy 295 nm). W białkach maksimum emisji jest przesunięte w kierunku 18

fal krótszych (330-350 nm), wskutek wpływu hydrofobowego otoczenia, w którym znajduje się określona frakcja reszt tryptofanowych. Denaturacja białka powoduje przesunięcie maksimum emisji do 360-355 nm. Wynika stąd, Ŝe połoŝenie maksimum emisji białka jest miarą średniej ekspozycji reszt tryptofanowych do rozpuszczalnika. Niestety, naturalna fluorescencja reszt tryptofanowych białek okazuje się jednak niewystarczająca pod względem intensywności dla wielu typów pomiarów spektrofluorymetrycznych. Dlatego rozwinięto szereg technik, pozwalających na przyłączanie do białek barwników fluroescencyjnych, których własności fluorescencyjne silnie zaleŝą od środowiska. Powszechnie stosowaną sondą fluorescencyjną tego rodzaju jest reszta dansylowa. Wprowadzić ją moŝna do białek np. przez zastosowanie reagującego z grupami aminowymi chlorku dansylu (rys. 6-8). Rysunek 6-8: Wzór chlorku dansylu, znacznika fluorescencyjnego po raz pierwszy zastosowanego w badaniach struktury białek (Weber, 1951). W spisie literatury uzupełniającej do niniejszego rozdział zamieszczono pozycje 4 i 6, umoŝliwiające dokładniejsze zapoznanie się z róŝnymi wersjami spektroskopii fluorescencji z zastosowaniem znaczników fluoryzujących. Chromoforowe grupy reporterowe Nazwa grupy reporterowe stosowana jest od dawna w odniesieniu do odczynników, wiąŝących się kowalencyjnie z białkami i zawierających chromofor, którego własności spektralne są wraŝliwe na zmiany mikrootoczenia. Widma związanego z białkiem odczynnika zmieniają się wskutek lokalnych zmian ph lub polarności i dzięki temu mogą być uŝyte jako miejscowe monitory struktury białka. Przykładowe związki, za pomocą których wprowadzić moŝna do białek grupy reporterowe z widmami absorpcyjnymi szczególnie wraŝliwymi na otoczenie, przedstawiono na rys. 6-9. Rysunek 6-9: dczynniki, pozwalające na wprowadzenie do białek chromoforowych grup reporterowych: 2-bromoacetamido-4-nitrofenol (1), bromek 2-metoksy-5- nitrobenzylu (2), bromek 2-hydroksy-5-nitrobenzylu (3). Ilustracją zastosowania tych związków jest modyfikacji α-chymotrypsyny przy uŝyciu 2-bromoacetamido-4-nitrofenolu, który wiąŝe się z resztą metioniny, znajdującą się o trzy reszty przed resztą seryny centrum aktywnego. ddziaływanie tak zmodyfikowanej 19

chymotrypsyny z róŝnymi substratami oraz ich analogami związane było ze zmianami widma absorpcyjnego grupy reporterowej, świadczącymi o znacznych lokalnych zmianach mikootoczenia wokół chromoforu. Znakowanie spinowe pracowano szereg technik wprowadzania do białek małych, paramagnetycznych grup nazywanych znacznikami spinowymi. Pozwalają one zastosować spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) w odniesieniu do białek, które normalnie nie są paramagnetyczne. Widma EPR takich koniugatów moŝna wykorzystać do badań cech lokalnego otoczenia białkowego wokół znacznika spinowego. Zmiany konformacyjne białka odzwierciedlają się w zmianach widm EPR, które moŝna interpretować jako wynik konformacyjnych napięć, wywieranych na znacznik spinowy i jego mikrootoczenie. Jedną z zalet zastosowania spektroskopii EPR do tych celów jest wysoka czułość metody. Najczęściej stosowane znaczniki spinowe to nitroksylowe rodniki (rys. 6-10), które zwykle otrzymuje się z odpowiednich amin drugorzędowych przez utlenianie nadtlenkiem wodoru w obecności odpowiedniego katalizatora. Niesparowane elektrony, warunkujące wystąpienie sygnału EPR, są zlokalizowane na wiązaniu N-. Znacznik zawiera ponadto reaktywną grupę, pozwalającą na przyłączenie do odpowiedniej reszty aminokwasowej białka. Rysunek 6-10: Plan budowy typowego znacznika spinowego Widmo EPR takich związków zawiera trójpasmową strukturę nadsubtelną; dokładna jej postać zaleŝy od rodzaju znacznika oraz jego otoczenia. dzwierciedla ona swobodę rotacyjną rodnika nitroksylowego i staje się bardzo asymetryczna, gdy następuje ograniczenie swobody rotacji rodnika. Takie ograniczenia rotacji wynikać mogą ze wzrostu lepkości środowiska lub wskutek przyłączenia rodnika do białka. Na względną swobodę rotacyjną wpływa ciasnota dopasowania znacznika do białka oraz prędkość rotacji makrocząsteczki. Zmiany tych własności pozwalają monitorować zmiany konformacyjne białka. TakŜe polarność otoczenia wpływa na widmo EPR, co pozwala na badanie tego aspektu struktury białka w miejscu przyłączenia znacznika. 6.5.4. Podstawienie izomorficzne 20

Dynamiczny rozwój rentgenografii strukturalnej białek stymulował poszukiwania chemicznych metod otrzymywania pochodnych form białek, zawierających atomy metalu cięŝkiego. W większości badań rentgenostrukturalnych niezbędne bywało izomorficzne podstawienie atomu małego duŝym. Prawdziwie izomorficzne podstawienie musi zachodzić bez strukturalnych zmian w cząsteczce białka. CięŜki atom stanowi punkt odniesienia, dookoła którego moŝna lokalizować inne atomy. Upewnienie się, Ŝe w trakcie podstawiania nie nastąpiła zmiana konformacyjna białka, ma pierwszorzędowe znaczenie. W przypadku enzymów, zweryfikować to moŝna w pewnym stopniu przez stwierdzenie zachowania aktywności enzymatycznej przez kryształ zawierający atom cięŝki. W wielu przypadkach otrzymywano uŝyteczne preparaty przez moczenie kryształów białka w roztworach zawierających jony metalu cięŝkiego albo poprzez krystalizację w obecności takich jonów. Metody te są kłopotliwe i niepewne. Alternatywnym podejściem jest kowalencyjne przyłączenie do białka grupy zawierającej atom metalu cięŝkiego lub zdolnej do chelatowania takich atomów (rys. 6-11). Rysunek 6-11: Pochodne białek, zawierające atom metalu cięŝkiego, przydatne do badań struktury białek metodą dyfrakcji promieni X. 6.5.5. Znakowanie w celu wykrywania białek lub ich oznaczania ilościowego Szereg metod modyfikacji chemicznej białek słuŝy znakowaniu tych biopolimerów grupami, które mają własności pozwalające na ich wykrywanie w bardzo niskich stęŝeniach. Większość odczynników, zaprojektowanych do tego typu modyfikacji, zawiera część reaktywną, pozwalającą na przyłączenie do odpowiednich reszt aminokwasowych białka, oraz część znacznikową. Modyfikacja białka prowadzi do trwałego, kowalencyjnego umieszczenia znacznika na białku. Poprzez obserwację unikalnej, wykrywalnej cechy znacznika moŝna bezpośrednio śledzić losy wyznakowanego białka w złoŝonych układach pochodzenia biologicznego oraz jego oddziaływania z innymi biomolekułami. Wykrywanie znacznika odbywa się poprzez pomiar spektofotometryczny, poprzez pomiar radiometrycznych lub sposobem pośrednim, za pośrednictwem innej wyznakowanej substancji. Znaczniki chromogenne i fluoryzujące Znaczniki spektralne, przyłączane do białek w celach analitycznych, mogą być chromogenne lub fluoryzujące. Znaczniki chromogenne są zwykle stosowane do niekowalencyjnego 21

wybarwiania duŝych struktur w obrębie komórek i tkanek. Czułość wykrywania barwników absorbujących światło widzialne często nie jest jednak wystarczająca dla identyfikacji białek w odpowiednio niskich stęŝeniach. Za to znaczniki fluoryzujące pozwalają na osiągnięcie bardzo wysokiej czułości, przeto to one właśnie zyskały najszerszy zakres zastosowań do otrzymywania pochodnych białek uŝywanych do licznych oznaczeń ilościowych in vitro. Przykładowo, wyznakowane fluorescencyjnie przeciwciała moŝna stosować do testowania komórek i tkanek na obecność antygenów i wykrywać je przy uŝyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Dla wykrywania białek i ich oznaczeń stosuje się na ogół odmienne barwniki niŝ te, które wykorzystywane są jako sondy struktury białek (patrz wyŝej). Działanie tych ostatnich opiera się na ich wraŝliwości na cechy mikrootoczenia, a taka zmienność sygnału jest niekorzystna w zastosowaniach analitycznych. Najczęściej wykorzystuje się przeto pochodne fluoresceiny, rodaminy oraz kumaryny, które mają wysoki współczynnik absorpcji i wysoką wydajność kwantową fluroescencji, ale przesunięcie stockesowksie jest niewielkie a parametry fluorescencji w nieznacznym tylko stopniu zaleŝą od polarności rozpuszczalnika (rys. 6-12). Rysunek 6-12: Plan budowy znaczników fluorescencyjnych, zawierających jako fluorofor fluoresceinę (1), rodaminę (2) lub kumarynę (3). Podstawnik R moŝe zawierać róŝne reaktywne grupy, zdolne do modyfikacji konkretnych rodzajów reszt aminokwasowych w białkach. Znaczniki radioaktywne Znakowanie białek przy uŝyciu radioaktywnych odczynników było jednym z pierwszych sposobów kreowania moŝliwości bardzo czułej detekcji. Wiele z odczynników modyfikujących określone reszty aminokwasowe w białkach moŝna wyprodukować w wersjach, zawierających radioaktywne izotopy, najczęściej węgla 14 C, trytu 3 H, fosforu 32 P oraz siarki 35 S. Wymienione izotopy emitują promieniowanie β, którego detekcja wymaga zmieszania próbki z płynem scyntylacyjnym. Szczególnie popularne są zastosowania izotopu węgla 14 C oraz trytu, wysyłające bardzo miękkie promieniowanie, najmniej niebezpieczne dla zdrowia. Jeśli jednak chcemy osiągnąć maksymalną czułość detekcji, o wiele atrakcyjniejsze są izotopy jodu, 131 I oraz 125 I, nietrwałe (okresy połowicznego rozpadu odpowiednio 8,1 i 60 dni), emitujące twarde promieniowanie γ, łatwiej mierzalne niŝ promieniowanie β. Intensywność emisji izotopów jodu jest bardzo wysoka. Z wielu względów praktycznych przewaŝa 22