MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: 259-265 Tomasz Dzieciątkowski 1, Maciej Przybylski 1, Małgorzata Gieryńska 2, Mirosław Łuczak 1 WYKORZYSTANIE METODY REAL-TIME PCR DO WYKRYWANIA DNA LUDZKIEGO HERPESWIRUSA TYPU 6 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny Kierownik: prof. dr hab. M. Łuczak 2 Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego Kierownik: prof. dr hab. M. Niemiałtowski Celem pracy było zaprojektowanie i zbadanie użyteczności metody real-time PCR do diagnostyki zakażeń ludzkim herpeswirusem typu 6, zwłaszcza u pacjentów poddanych immunosupresji w wyniku zabiegu przeszczepienia komórek krwiotwórczych. Ludzki herpeswirus typu 6 (human herpesvirus type 6; HHV-6) zaliczany jest do podrodziny β-herpesvirinae i wykazuje bliskie pokrewieństwo genetyczne z ludzkimi herpeswirusami typu 7 (HHV-7) oraz 5 (HHV-5, znanym powszechnie jako CMV) (1). Dokładna analiza genetyczna oraz badanie sekwencji nukleotydów w genomie wirusa pozwoliło na wyodrębnienie dwóch podtypów: HHV-6A oraz HHV-6B (9). U większości ludzi pierwotne zakażenie HHV-6 ma miejsce we wczesnym dzieciństwie (19), a wirus jest szeroko rozpowszechniony w populacji, bowiem występowanie specyficznych przeciwciał w klasie IgG stwierdzono u ponad 90% dorosłych (15). Podobnie jak pozostałe herpeswirusy, HHV-6 ustala stan latencji w śliniankach (6), monocytach (10) lub też komórkach progenitorowych szpiku (12). Zakażenia herpeswirusem typu 6 zostały powiązane z wieloma jednostkami chorobowymi (19), począwszy od stanów gorączkowych (4), poprzez neuroinfekcje (16) do chorób limfoproliferacyjnych włącznie (13). Reaktywacja latentengo wirusa połącznona z pełną manifestacją kliniczną zdarza się rzadko u osób ze sprawnym układem odpornościowym (14), lecz może mieć śmiertelny przebieg u osób poddanych immunosupresji (19). Wykorzystując techniki biologii molekularnej obecność HHV-6 w osoczu stwierdzano u średnio 32% biorców przeszczepów narządowych oraz 30-48% biorców komórek krwiotwórczych (18). W tej ostatniej grupie chorych szczyt wiremii występuje zazwyczaj w ciągu pierwszych 4 tygodni po zabiegu przeszczepienia (5, 17), a czynnikami zwiększającymi ryzyko zakażenia jest przeszczep allogeniczny, zaawansowana choroba podstawowa oraz leczenie immunosupresyjne z użyciem wysokich dawek kortykosterydów (17).
260 T. Dzieciątkowski i inni Nr 3 Ze względu na upośledzenie funkcjonowania układu odpornościowego w grupach pacjentów opisanych powyżej, tradycyjne badania serologiczne wyrażają się często zbyt małą czułością i są zastępowane przez metody biologii molekularnej, zwłaszcza testy PCR (5). Celem pracy było opracowanie i optymalizacja metody PCR z detekcją w czasie rzeczywistym do wykrywania DNA ludzkiego herpeswirusa typu 6, określenie jej czułości analitycznej oraz porównanie z testem komercyjnym, jako metodą odniesienia. MATERIAŁ I METODY Do jakościowych badań techniką real-time PCR (określenie swoistości reakcji) użyto całogenomowego DNA wyizolowanego ze standardowego szczepu SF ludzkiego herpeswirusa typu 6 (Vircell ). Jako kontrolę ujemną wykorzystano DNA wyekstrahowane z niezakażonej linii HFFF-2, zaś za kontrole specyficzności reakcji posłużył DNA izolowany z: wirusa opryszczki typu 1 (HSV-1), wirusa cytomegalii (CMV) oraz wirusa Epsteina-Barr (EBV). Do określenia czułości metody wykonano seryjne 10-krotne rozcieńczenia wzorcowego DNA HHV-6 w jałowej, redestylowanej wodzie w zakresie od 10 0 do 10-6 (50-0,00005 ng/µl). W celu opracowania starterów i sondy do metody real-time PCR wykorzystano sekwencję DNA dostępną w internetowej bazie danych GenBank (NC 001664), kodującego specyficzną wirusową DNA polimerazę. Zaprojektowane do niej startery amplifikują fragment genomu o długości 74 par zasad (Tabela I). Dodatkowo celem zwiększenia specyficzności reakcji zastosowano zaprojektowaną sondę fluorescencyjną typu TaqMan wyznakowaną na końcu 5 fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym JOE oraz wygaszaczem Dabcyl na końcu 3 (Oligo ). Badania techniką real-time PCR wykonywano na aparacie LightCycler 2.0 z użyciem zestawu amplifikacyjnego LightCycler TaqMan Master (Roche Diagnostics ). Mieszanina reakcyjna zawierała 6 µl DNA; 2,25 µm startera HHV-6-1; 6,75 µm startera HHV-6-2 oraz 1,5 µm sondy HHV-6-JOE w końcowej objętości 20 µl. PCR rozpoczynał się etapem aktywacji (hot-start) termostabilnej DNA polimerazy przez 10 min w 95 o C, po którym następowało 45 cykli składających się z denaturacji 15 s w 95 o C, przyłączania starterów przez 20 s w 60 o C oraz wydłużania nici w temperaturze 72 o C przez 15 s. Reakcję kończyło schłodzenie próbek do 40 o C na 30 sekund. Odczyt fluorescencji odbywał się przy długości fali 560 nm, typowej dla fluoroforu JOE. Wzrost poziomu fluorescencji był proporcjonalny do ilości produktu w mieszaninie. Materiał do badań stanowiło 30 próbek surowicy krwi, pochodzących od pacjentów z Kliniki Hematologii i Onkologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego z lat 2006-2007. Izolację DNA przeprowadzono przy użyciu zestawu High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Diagnostics ), zgodnie z procedurą dostarczoną przez producenta, zawieszając wyizolowane DNA w końcowej objętości 50 µl buforu elucyjnego. Użyte do doświadczeń Tabela I. Sekwencje użytych starterów i sondy Nazwa Sekwencja (5 3 ) HHV6-1 GAA GCA GCA ATC GCA ACA CA HHV6-2 ACA ACA TGT AAC TCG GTG TAC GGT HHV6-JOE JOE - AAC CCG TGC GCC GCT CCC - Dabcyl
Nr 3 Real-time PCR w wykrywaniu DNA wirusa herpes typu 6 261 próbki zostały uprzednio zbadane przy zastosowaniu komercyjnego, ilościowego testu MutaREAL HHV-6 Kit (ALPCO ). Wszystkie opisane powyżej badania prowadzono w trzykrotnych, niezależnych powtórzeniach. WYNIKI W metodzie real-time PCR wynik dodatni, wyrażony wykładniczym przyrostem fluorescencji mieszaniny reakcyjnej, osiągnięto we wszystkich próbkach zawierających materiał genetyczny ludzkiego herpeswiursa typu 6. W pozostałych próbkach, zawierających kontrolne DNA niezakażonej linii HFFF-2, wirusa opryszczki typu 1, wirusa cytomegalii oraz wirusa Epsteina-Barr, nie zaobserwowano fluorescencji przy badanej długości fali świetlnej 560 nm, co wskazuje na brak w nich swoistej amplifikacji kwasu nukleinowego. Obserwacja taka poczyniona dla próbek zawierających materiał genetyczny innych wirusów świadczy o wysokiej specyficzności reakcji (Ryc.1). Podczas określania zakresu czułości metody technika real-time PCR umożliwiała Ryc.1 Wynik reakcji real-time PCR w kierunku wykrywania ludzkiego herpeswirusa typu 6. Krzywa oznaczona HHV-6 oznacza amplifikację DNA herpeswirusa typu 6. Wykres K (-) to kontrola ujemna (DNA izolowane z niezakażonej linii HFFF-2), zaś wykresy: HSV-1, CMV oraz EBV oznaczają kontrole specyficzności reakcji. wykrycie wszystkich użytych rozcieńczeń DNA ludzkiego herpeswirusa typu 6. Wynik dodatni w postaci obserwowanego wzrostu fluorescencji wystąpił we wszystkich próbkach
262 T. Dzieciątkowski i inni Nr 3 Ryc.2 Badanie czułości metody real-time PCR w kierunku wykrywania ludzkiego herpeswirusa typu 6. Poszczególne krzywe oznaczają amplifikację DNA seryjnych rozcieńczeń HHV-6 w zakresie od 10 0 do 10-6. K (-) to kontrola ujemna reakcji: DNA izolowane z niezakażonej linii HFFF-2. Ryc.3 Krzywa kalibracyjna fluorescencji metody real-time PCR do wykrywania ludzkiego herpeswirusa typu 6. Poszczególne punkty na krzywej oznaczają fluorescencję seryjnych rozcieńczeń HHV-6 w zakresie od 10 0 do 10-6. zawierających rozcieńczenia DNA HHV-6 w zakresie od 10 0 do 10-6 (Ryc.2). Podobnie krzywa kalibracyjna fluorescencji wykazywała wysoki współczynnik liniowości, co świadczy o dobrej powtarzalności zaprojektowanej metody (Ryc.3). Opisane powyżej próbki kliniczne poddano opracowanej reakcji real-time PCR z użyciem sond fluoroscencyjnych TaqMan. W 17 próbkach materiału klinicznego odnotowano wzrost poziomu fluorescencji barwnika reporterowego JOE, co jest następstwem wzrostu ilości produktu w mieszaninie oraz degradacji odpowiednio modyfikowanej sondy TaqMan. Pozostałe 13 próbek nie zawierało sekwencji DNA typowej dla ludzkiego herpeswirusa typu 6, o czym świadczy brak wzrostu poziomu fluorescencji. Dodatnie wyniki badań
Nr 3 Real-time PCR w wykrywaniu DNA wirusa herpes typu 6 263 Tabela II. Porównanie wyników uzyskanych za pomocą opracowanej metody i komercyjnego testu odniesienia Nr Próbka Wynik uzyskany za pomocą opracowanej metody real-time PCR testu komercyjnego (ALPCO) 1. surowica 1 (-) (-) 2. surowica 2 (-) (-) 3. surowica 3 (-) (-) 4. surowica 4 (+) (+) 800 kopii/ml 5. surowica 5 (-) (-) 6. surowica 6 (-) (-) 7. surowica 7 (+) (+) 1400 kopii/ml 8. surowica 8 (+) (+) 900 kopii/ml 9. surowica 9 (-) (-) 10. surowica 10 (+) (+) 1200 kopii/ml 11. surowica 11 (+) (+) 800 kopii/ml 12. surowica 12 (+) (+) 1800 kopii/ml 13. surowica 13 (-) (-) 14. surowica 14 (-) (-) 15. surowica 15 (+) (+) 1700 kopii/ml 16. surowica 16 (-) (-) 17. surowica 17 (+) (+) 1100 kopii/ml 18. surowica 18 (+) (+) 2600 kopii/ml 19. surowica 19 (-) (-) 20. surowica 20 (-) (-) 21. surowica 21 (+) (+) 1800 kopii/ml 22. surowica 22 (+) (+) 1500 kopii/ml 23. surowica 23 (-) (-) 24. surowica 24 (-) (-) 25. surowica 25 (-) (-) 26. surowica 26 (-) (-) 27. surowica 27 (-) (-) 28. surowica 28 (-) (-) 29. surowica 29 (-) (-) 30. surowica 30 (+) (+) 2800 kopii/ml stwierdzono więc w 13 z 30 (43,3%) badanych próbek. Identyczny wynik osiągnięto za pomocą komercyjnego testu MutaREAL HHV-6 Kit, co świadczy o wysokiej wartości diagnostycznej nowo opracowanej metody (Tabela II). DYSKUSJA Wynik uzyskany za pomocą Ze względu na coraz większe rozpowszechnienie we współczesnej medycynie zabiegów przeszczepiania zarówno komórek krwiotwórczych, jak i narządów unaczynionych, coraz większą rolę zaczęła odgrywać diagnostyka wirusowych zakażeń potransplantacyjnych.
264 T. Dzieciątkowski i inni Nr 3 Zwiększona częstotliwość reaktywacji ze stanu latencji przedstawicieli podrodziny β-herpesvirinae u osób poddanych immunosupresji spowodowała, że zakażenia nimi stały się jedną z głównych przyczyn zgonów u pacjentów z tej grupy (7). Zakażenia HHV-6 zostały powiązane z ostrym odrzucaniem przeszczepu (3, 11), zapaleniami płuc (19), wysypką oraz gorączką (3, 14). Pomimo trudności w bezpośrednim powiązaniu herpeswirusa typu 6 z wymienionymi objawami klinicznymi, zakażenia HHV-6 powinny być brane pod uwagę u osób z niedoborami immunologicznymi, zwłaszcza gdy rutynowe badania w kierunku innych herpeswirusów, takich jak CMV i EBV dają wyniki negatywne. Ograniczona czułość stosowanych testów serologicznych, powiązana z koniecznością wczesnego zastosowania leczenia przeciwwirusowego zmusiła do rozpowszechnienia w diagnostyce poprzeszczepowej metod biologii molekularnej (5, 8). Konwencjonalne testy PCR mają zbyt niską czułość, co wskazuje na konieczność używania metod real-time PCR w monitorowaniu poziomu DNA β-herpeswirusów u pacjentów z immunosupresją. Ich wielokrotnie opisywana i podkreślana czułość gwarantuje wykrycie zakażeń pierwotnych lub reaktywacji wirusa przy niskim poziomie wiremii (8). Zalecana przy zakażeniach herpeswirusem typu 6 terapia z użyciem cidofowiru, niesie za sobą poważne ryzyko nefrotoksyczności (2) - istotne jest więc jak najszybsze ograniczenie podawanych dawek w miarę spadku liczby wykrywanych kopii wirusa. Dostępność półilościowych lub ilościowych metod monitorowania wiremii HHV-6 może znacząco ułatwić szybką diagnostykę zakażenia, a w konsekwencji prawidłowe postępowanie terapeutyczne. Ze względu na opisywaną w Polsce wysoką częstość występowania herpeswirusa typu 6 u biorców komórek krwiotwórczych (5), wskazane są dalsze badania dotyczące zakażeń o etiologii HHV-6 u pacjentów poddanych immunosupresji. T. Dzieciątkowski, M. Przybylski, M. Gieryńska, M. Łuczak REAL-TIME PCR AS AN EFFICIENT TOOL FOR INVESTIGATING THE PRESENCE OF HUMAN HERPESVIRUS 6 DNA SUMMARY Human herpesvirus 6 (HHV-6) is a β-herpesvirus widely spread within a population and has been recognized as a potential significant pathogen in immunocompromised patients. Different clinical manifestations have been described including fever, skin rash, pneumonia, graft rejection and encephalitis. The goal of the study was development of real-time PCR assay for detection of human herpesvirus type 6 DNA in clinical samples, using primers targeting a conserved region of the viral DNA polymerase gene and a specific TaqMan hydrolyzing probe. The analytical sensitivity of assay was tested using serial dilutions of HHV-6 DNA in range between 10 0 and 10-6. Thirty plasma samples taken from a group of adult recipients of allogeneic HSCT were tested for the presence of HHV-6 DNA in the LightCycler system. For comparison commercial quantitative MutaREAL HHV-6 kit (ALPCO) was used, according to the manufacturer s instructions. Both LightCycler assays, including in-house real-time PCR, detected HHV-6 DNA in 13 specimens. The conclusion is that developed Taq- Man-based probes real-time PCR test is very reliable and valuable for detection of low-copy viremia in plasma samples. The high level of sensitivity and accuracy provided by the LightCycler instrument is favorable for the use of this method in the detection of HHV-6 DNA in clinical specimens.
Nr 3 Real-time PCR w wykrywaniu DNA wirusa herpes typu 6 265 PIŚMIENNICTWO 1. Davison A, Eberle R, Hayward GS i inni. Herpesviruses. W: Virus taxonomy - classification and nomenclature of viruses. VIIIth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Red. C.M. Fauquet, M.A. Mayo, J. Maniloff i inni, Elsevier Academic Press, San Diego 2005, 193-212. 2. De Bolle L, Naesens L, De Clercq E. Update on human herpesvirus 6 biology, clinical features, and therapy. Clin Microbiol Rev; 2005; 18: 217-45. 3. Dęborska-Materkowska D, Sadowska A, Matłosz B i inni. Zakażenie ludzkim wirusem herpes typu 6 u biorcy alloprzeszczepu nerki - opis przypadku. Przegl Epidemiol; 2006; 60: 141-6. 4. Dockrell DH: Human herpesvirus 6: molecular biology and clinical features. J Med Microbiol; 2003; 52: 5-18. 5. Dzieciątkowski T, Przybylski M, Torosian T i inni. Prevalence of human herpesvirus 6 antibodies and DNA in allogeneic stem cell transplant patients: two-year single centre experience. Arch Immunol Ther Exp; 2008; 56: 201-6. 6. Fox JD, Briggs M, Ward PA i inni. Human herpesvirus 6 in salivary glands. Lancet; 1990; 336: 590-3. 7. Griffiths PD, Clark DA, Emery VC. Betaherpesviruses in transplant recipients. J Microb Chem; 2000; 45: 29-34. 8. Ihira M, Yoshikawa T, Suzuki K i inni. Monitoring of active HHV-6 infection in bone marrow transplant recipients by real time PCR; comparison to detection of viral DNA in plasma by qualitative PCR. Microbiol Immunol; 2002; 46: 701-5. 9. Isegawa Y, Mukai T, Nakano K i inni. Comparison of the complete DNA sequences of human herpesvirus 6 variants A and B. J Virol; 1999; 73: 8053-63. 10. Kondo K, Kondo T, Okuno T i inni: Latent human herpesvirus 6 infection of human monocytes/ macrophages. J Gen Virol; 1991; 72: 1401-8. 11. Ljungman P, Wang F-Z, Clark DA i inni. High levels of human herpesvirus 6 DNA in peripheral blood leucocytes are correlated to platelet engraftment and disease in allogeneic stem cell transplant patients. Br J Haematol; 2000; 111: 774-81. 12. Luppi M, Barozzi P, Morris C i inni. Human herpesvirus 6 latently infects early bone marrow progenitors in vivo. J Virol; 1999; 73: 754-9. 13. Salahuddin SZ, Ablashi DV, Markham PD i inni. Isolation of a new virus, HBLV, in patients with lymphoproliferative disorders. Science; 1986; 234: 596-601. 14. Savolainen H, Lautenschlager I, Piiparinen H i inni. Human herpesvirus-6 and -7 in pediatric stem cell transplantation. Pediatr Blood Cancer; 2005; 45: 820-5. 15. Saxinger C, Polesky H, Eby N i inni. Antibody reactivity with HBLV (HHV-6) in U.S. populations. J Virol Methods; 1988; 21: 199-208. 16. Singh N, Paterson DL. Encephalitis caused by human herpesvirus-6 in transplant recipients: relevance of a novel neurotropic virus. Transplantation; 2000; 69: 2474-9. 17. Yoshikawa T, Asano Y, Ihira M i inni: Human herpesvirus 6 viremia in bone marrow transplant recipients: clinical features and risk factors. J Infect Dis; 2002; 185: 847-53. 18. Zerr DM, Corey L, Kim HW i inni. Clinical outcomes of human herpesvirus 6 reactivation after hematopoietic stem cell transplantation. Clin Infect Dis; 2005; 40: 932-40. 19. Zerr DM. Human herpesvirus 6: a clinical update. Herpes; 2006; 13: 20-4. Otrzymano: 14 VII 2008 r. Adres Autora: 02-004 Warszawa ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny e-mail: dzieciatkowski@wp.pl