MODYFIKACJA I OPTYMALIZACJA METOD PCR DO WYKRYWANIA REGIONU MIE LUDZKIEGO HERPESWIRUSA TYPU 5

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: Łukasz Chabros 1, Maciej Przybylski 2, Tomasz Dzieciątkowski 2, Mirosław Łuczak 2 MODYFIKACJA I OPTYMALIZACJA METOD PCR DO WYKRYWANIA REGIONU MIE LUDZKIEGO HERPESWIRUSA TYPU 5 1 Międzywydziałowe Studium Biotechnologii, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie Kierownik: dr W. Pląder 2 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Akademia Medyczna w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M. Łuczak Celem pracy była modyfikacja i optymalizacja wariantów real-time PCR do wykrywania DNA ludzkiego herpeswirusa typu 5 oraz porównanie ich czułości analitycznej z konwencjonalną metodą PCR i komercyjnym zestawem diagnostycznym jako testem odniesienia. Ludzki herpeswirus typu 5 (Human Herpesvirus 5; HHV-5 znany powszechnie jako CMV) jest przedstawicielem podrodziny β-herpesvirinae o niezwykle szerokim rozpowszechnieniu w populacji (1). Stwierdzono, że u ponad 60% osób w krajach rozwiniętych wykrywa się przeciwciała anty-hhv-5 w klasie IgG, zaś w krajach Trzeciego Świata odsetek ten wzrasta do prawie 95% (7). Po często bezobjawowym zakażeniu pierwotnym wirus ustala stan latencji w makrofagach oraz prawdopodobnie w subpopulacji CD8 + limfocytów T i w komórkach gruczołów wydzielania wewnętrznego (12). U osób o sprawnym układzie immunologicznym objawy chorobowe są słabo wyrażone i przebiegają głównie pod postacią zespołu mononukleozopodobnego połączonego z gorączką oraz bardzo rzadko pod postacią powikłań neurologicznych (7). W przypadkach zaburzeń odporności wynikających z: dodatkowego zakażenia (HIV), niedojrzałości układu immunologicznego (zakażenia wrodzone i u noworodków) czy immunosupresji (pacjenci po przeszczepach lub chemioterapii), zakażenia HHV-5 są częstsze i o zdecydowanie groźniejszym przebiegu (13). Wystąpienie objawów klinicznych uzależnione jest od wielu czynników - stanu ogólnego chorego, wydolności układu odpornościowego oraz wieku, w którym pacjent przebył zakażenie pierwotne (8). Do najczęściej obserwowanych wówczas schorzeń zaliczane jest wirusowe zapalenie płuc, zaburzenia funkcjonowania wątroby (14), a także zwiększona podatność na wtórne zakażenia bakteryjne i grzybicze (5). U pacjentów po zabiegach transplantacyjnych obserwuje się dodatkowo: zespół mielosupresyjny (14) oraz nasilenie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD) (6). Ze względu na upośledzenie funkcjonowania układu odpornościowego w grupach pacjentów opisanych powyżej, tradycyjne badania serologiczne wyrażają się często zbyt

2 80 Ł. Chabros i inni Nr 1 małą czułością i zostały zastąpione przez metody biologii molekularnej, zwłaszcza testy PCR (4). Celem pracy była modyfikacja i optymalizacja konwencjonalnej metody PCR do wykrywania DNA ludzkiego herpeswirusa typu 5 do wariantu detekcji w czasie rzeczywistym (real-time PCR) oraz określenie jej czułości analitycznej. MATERIAŁ I METODY Do badań używano DNA HHV-5, wyizolowanego z 30 próbek surowicy krwi, pochodzących od pacjentów z Kliniki Hematologii i Onkologii Akademii Medycznej w Warszawie. We wszystkich doświadczeniach jako kontroli dodatniej używano laboratoryjnego szczepu ludzkiego herpeswirusa typu 5 AD 169 (ATCC: VR-538) namnożonego w linii komórkowej HFFF-2. Miano namnożonego wirusa określono metodą wg Reeda i Müncha (10) na poziomie TCID 50 = 4,18x10 5. Izolację DNA przeprowadzono z 200 µl surowicy krwi przy użyciu zestawu High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Diagnostics), zgodnie z procedurą dostarczoną przez producenta, zawieszając wyizolowane DNA w końcowej objętości 50 µl buforu elucyjnego. Pierwszy etap badań stanowiło wykrycie DNA HHV-5 w próbkach klinicznych. Przy użyciu metody PCR amplifikowano fragment genu natychmiastowego wczesnego (MIE) wirusa cytomegalii (2). Reakcję przeprowadzano w końcowej objętości 50 µl, zawierającej 5 µl DNA wyekstrahowanego z próbki klinicznej. Mieszanina reakcyjna zawierała 0,3 µm starterów MIE-4 i MIE-5, 3 mm MgCl 2, po 0,2 mm każdego dntp oraz 1,25 U polimerazy Taq (Invitrogen). PCR obejmował 40 cykli składających się z: denaturacji - 2 min, przyłączania starterów w temp. 65 o C - 1,5 min i wydłużania łańcuchów - 1 min. Amplifikacja kończyła się elongacją nici DNA przez 10 min (2). Rozdziału produktów dokonywano poprzez elektroforezę w 1% żelu agarozowym zabarwionym bromkiem etydyny. Wizualizację przeprowadzano w świetle ultrafioletowym za pomocą transiluminatora UV. Kolejny etap badań stanowiła optymalizacja jakościowego PCR w czasie rzeczywistym z użyciem starterów opisanych powyżej oraz nieswoistego fluorochromu SYBR Green I. W tym celu użyto mieszaniny amplifikacyjnej FastStart DNA Master SYBR Green Kit (Roche Diagnostics ) w objętości końcowej 20 µl, z dodatkiem obu starterów w stężeniu 0,75 nm, 3 mm MgCl 2 oraz 5 µl badanego DNA. PCR rozpoczynał się aktywacją polimerazy DNA przez 10 min w 95 o C, po której następowało 45 cykli obejmujących: denaturację w temperaturze 95 o C przez 10 s, przyłączanie starterów: 60 o C - 10 s i wydłużanie nici DNA: 72 o C - 20 s. W trakcie trwania reakcji stale analizowany był poziom fluorescencji przy długości fali 530 nm, charakterystyczny dla wiązania się fluorochromu SYBR Green I z amplifikowanym dwuniciowym DNA. Następnie przeprowadzono analizę krzywych topnienia produktów w zakresie temperatur od 65 C do 95 C. Rozpoznanie pojedynczej temperatury topnienia produktu PCR (z wahaniami w granicach dziesiętnych stopnia Celsjusza) świadczyło o zajściu swoistej amplifikacji. W celu podwyższenia czułości i swoistości metody, wprowadzono modyfikację polegającą na zastosowaniu real-time PCR z sondą fluorescencyjną typu TaqMan. Porównawcza analiza sekwencji produktu oraz sekwencji sondy podanej w pracy Demmlera (2), wykazała, że sonda hybrydyzuje do regionu o dużej zmienności genetycznej. Wybrano więc inny re-

3 Nr 1 Metoda PCR w wykrywaniu herpeswirusa typu 5 81 gion, wysoce konserwatywny, do którego zaprojektowano sondę, wyznakowaną reporterem fluoroforowym JOE na końcu 5 oraz wygaszaczem TAMRA na końcu 3 (Oligo). Badania wykonywano z użyciem mieszaniny amplifikacyjnej TaqMan Master Kit (Roche Diagnostics). Oprócz odczynników dostarczonych przez producenta zestawu, mieszanina reakcyjna zawierała 5 µl DNA wyizolowanego z próbki klinicznej, startery w stężeniu 1,75 µm oraz sondę w stężeniu 150 nm w końcowej objętości 20 µl. Tabela I. Sekwencje zastosowanych starterów i sondy Nazwa Sekwencja (5 3 ) MIE-4 CCA AGC GGC CTC TGA TAA CCA AGC C MIE-5 CAG CAC CAT CCT CTT CTT CTT CTG G MIE-JOE JOE - GAG AAC AGT GAT CAG GAA GAA AGT G - TAMRA PCR rozpoczynał się etapem aktywacji (hot-start) termostabilnej polimerazy DNA przez 10 min w 95 C, po którym następowało 45 cykli składających się z: denaturacji 10 s - 95 C, przyłączania starterów przez 15 s - 60 C oraz wydłużania nici w temperaturze 72 C - 30 s. Reakcję kończyło schłodzenie próbek do 40 C na 30 sekund. Odczyt fluorescencji odbywał się przy długości fali 560 nm, typowej dla fluoroforu JOE. W celu określenia i porównania czułości prezentowanych metod PCR przeprowadzono reakcje z wykorzystaniem DNA wyekstrahowanego z seryjnych 10-krotnych rozcieńczeń wzorcowego szczepu HHV-5 AD169 w podłożu Eagle a w zakresie od 10 0 do Wszystkie opisane powyżej badania prowadzono w dwukrotnych, niezależnych powtórzeniach. WYNIKI We wszystkich wariantach metody PCR wynik dodatni, wyrażony obecnością na żelu specyficznego produktu amplifikacji lub wykładniczym przyrostem fluorescencji mieszaniny reakcyjnej, osiągnięto w próbkach zawierających materiał genetyczny wzorcowego szczepu AD169 ludzkiego herpeswirusa typu 5. W próbkach zawierających kontrolne DNA niezakażonej linii HFFF-2 nie zaobserwowano żadnych produktów reakcji ani też wzrostu fluorescencji, co wskazuje na brak w nich swoistej amplifikacji kwasu nukleinowego. Podczas określania zakresu czułości za pomocą PCR połączonego z rozdziałem elektroforetycznym produktów (2) uzyskano specyficzną amplifikację sekwencji docelowych HHV-5, przy rozcieńczeniach wirusowego DNA wyłącznie w zakresie od 10 0 do 10-3 (Ryc. 1). Przy zastosowaniu obu wariantów techniki real-time PCR wykrywano natomiast rozcieńczenia DNA HHV-5 w przedziale od 10 0 do 10-5 (Ryc. 2 i 3), co daje wynik około stukrotnie wyższy od uprzednio stosowanej metody. W badaniu próbek materiału klinicznego testami real-time PCR wykryto obecność specyficznych dla HHV-5 sekwencji w trzech próbkach, z którymi uzyskano wynik ujemny w konwencjonalnej reakcji łańcuchowej polimeryzacji. Dwa inne preparaty badane z użyciem fluorochromu SYBR Green I wykazywały także dodatni poziom fluorescencji w aparacie LightCycler 2.0, lecz analiza krzywych topnienia produktów sugerowała zajście niespecyficznej amplifikacji. Sytuację tą potwierdził dodatkowo brak wzrostu poziomu fluorescencji dla tych próbek badanych z użyciem specyficznych, znakowanych sond typu TaqMan.

4 82 Ł. Chabros i inni Nr 1 Ryc.1 Badanie czułości PCR w kierunku wykrywania DNA HHV-5. Poszczególne ścieżki elektroforetogramu oznaczają DNA pochodzące z seryjnych rozcieńczeń HHV-5 w zakiesie od 10 0 do 10-6 ; K (-) - kontrola ujemna reakcji; marker - wzorzec masowy DNA 100 bp (Invitrogen). Ryc.2 Badanie czułości metody real-time PCR w kierunku wykrywania DNA HHV-5 z zastosowaniem fluorochormu SYBR Green I. Poszczególne krzywe oznaczają seryjne rozcieńczenia wirusowego DNA (szczepu AD169) w zakresie od 10 0 do K (-) - kontrola ujemna reakcji.

5 Nr 1 Metoda PCR w wykrywaniu herpeswirusa typu 5 83 Ryc.3 Badanie czułości metody real-time PCR w kierunku wykrywania DNA HHV-5 z zastosowaniem sond TaqMan. Poszczególne krzywe oznaczają seryjne rozcieńczenia wirusowego DNA (szczepu AD169) w zakresie od 10 0 do K (-) - kontrola ujemna reakcji. Tabela II. Wyniki uzyskane dla próbek klinicznych surowicy krwi Nr próbki PCR SYBR Green I real-time PCR TaqMan real-time PCR / /

6 84 Ł. Chabros i inni Nr 1 DYSKUSJA Ze względu na coraz większe znaczenie transplantacji we współczesnej medycynie, istotną rolę zaczęła odgrywać diagnostyka zakażeń tak rozpowszechnionymi w populacji patogenami jakimi są herpeswirusy. Częstość reaktywacji latentnych przedstawicieli podrodziny β-herpesvirinae u osób poddanych immunosupresji spowodowała, że zakażenia nimi stały się jedną z głównych przyczyn zgonów u pacjentów z tej grupy (9). Ograniczona czułość rutynowo stosowanych testów serologiczych powiązana z koniecznością wczesnego zastosowania leczenia przeciwwirusowego zmusiła do rozpowszechnienia w diagnostyce metod biologii molekularnej (4). Konwencjonalne testy PCR mają zbyt niską czułość, która uniemożliwia wdrożenie leczenia wyprzedzającego (pre-emptive strategy). Z tego powodu wskazane jest użycie metod real-time PCR w monitorowaniu poziomu DNA HHV-5 u pacjentów z immunosupresją, gdzie ich czułość gwarantuje wykrycie zakażeń lub reaktywacji wirusa przy niskim poziomie wiremii (3). Dodatkowo w opisywanej metodzie szybkiemu wykryciu specyficznych sekwencji DNA sprzyja dobór starterów komplementarnych do regionu natychmiastowego wczesnego (MIE) genomu ludzkiego cytomegalowirusa, który jest pierwszym transkrypcyjnie aktywnym po wejściu HHV-5 w cykl zakażenia produktywnego (12). Opisywana w literaturze skuteczność leczenia przeciwherpeswirusowego zależy w dużej mierze od momentu wykrycia genomu HHV-5 w płynach ustrojowych (4). Stosowana rutynowo terapia z użyciem gancyklowiru, prócz swego działania mielotoksycznego, coraz częściej nie przynosi pożądanych rezultatów ze względu na rosnący odsetek izolatów klinicznych opornych na ten lek (11). Lekiem równoważnym w leczeniu wyprzedzającym u pacjentów z reaktywacją zakażenia HHV-5 po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych jest foskarnet, który choć powoduje wolniejsze narastanie oporności i ma mniejszą mielotoksyczność niesie za sobą zwiększone ryzyko nefrotoksyczności (11) - istotne jest więc jak najszybsze ograniczenie podawanych dawek w miarę spadku liczby wykrywanych kopii wirusa. WNIOSKI Oba użyte w doświadczeniu opracowane warianty metody real-time PCR pozwalają na specyficzne wykrywanie sekwencji DNA ludzkiego herpeswirusa typu 5. Ze względu na potencjalne ryzyko wyników fałszywie dodatnich, wariant real-time PCR z zastosowaniem fluorochromu SYBR Green I nie powinien być stosowany jako test diagnostyczny. Czułość analityczna przedstawionych metod real-time PCR jest około 100 razy wyższa, niż stosowanego uprzednio konwencjonalnego testu PCR.

7 Nr 1 Metoda PCR w wykrywaniu herpeswirusa typu 5 85 Ł. Chabros, M. Przybylski, T. Dzieciątkowski, M. Łuczak MODIFICATION AND OPTIMIZATION OF PCR METHODS FOR DETECTION OF MIE REGION FROM HUMAN HERPESVIRUS 5 SUMMARY Human herpesvirus 5 (HHV-5, formerly known as CMV) is a β-herpesvirus widely spread within a population. Thus, HHV-5 infections are a serious matter of concern in a group of immunocompromised patients. The goal of the study was modification and optimization of conventional PCR method developed for the detection of HHV-5 DNA to the real-time variant (RTmPCR) and determination of analytical resolution of the modified methods. Thirty plasma samples were tested for the presence of HHV-5 DNA using the LightCycler system with two different methods one with SYBR Green I fluorochrome method and second one using TaqMan fluorescent probes and a qualitative in-house gel-stained PCR assay using primers that amplify part of HHV-5 MIE gene. The analytical sensitivity of real-time PCR assay was tested using serial dilutions of HHV-5 DNA in range between 10 0 and For comparison typical end-point detected PCR for cytomegalovirus detection with the same DNA dilutions was made. The sensitivity of novel method was about 100-fold higher than older one. Both LightCycler assays detected HHV-5 DNA in 27 samples, also which were negative by the gel-stained PCR. Analysis of the available clinical and serological data associated with these samples suggested that the real-time results in all of these cases were true positive. The conclusion is that real-time PCR methods are more sensitive than the conventional PCR used in this study. The additional sensitivity was valuable for detection of patients with low-copy viremia. The high level of sensitivity, specificity, accuracy, and rapidity provided by the LightCycler instrument are favorable for the use of this system in the detection of HHV-5 DNA in clinical specimens. PIŚMIENNICTWO 1. Davison A, Eberle R, Hayward GS i inni: Herpesviruses. W: Virus taxonomy - classification and nomenclature of viruses. VIIIth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Red. C.M. Fauquet, M.A. Mayo, J. Maniloff i inni, Elsevier Academic Press, San Diego 2005, Demmler GJ, Buffone GJ, Schimbor CM i inni: Detection of cytomegalovirus in urine from newborns by using polymerase chain reaction DNA amplification. J Infect Dis; 1988; 185: Dzieciątkowski T, Przybylski M, Tomaszewska A i inni: Comparison of two methods used for monitoring low-copy cytomegalovirus infection in a patient with chronic myeloid leukemia after unrelated umbilical cord blood transplantation. Arch Immunol Ther Exp; 2007; 55: Emery VC: Investigation of CMV disease in immunocompromised patients. J Clin Pathol; 2001; 54: George MJ, Snydman DR, Werner BG i inni: The independent role of cytomegalovirus as a risk factor for invasive fungal disease in orthotopic liver transplant recipients. Am J Med; 1997; 103: Griffiths PD, Clark DA, Emery VC: Betaherpesviruses in transplant recipients. J Microb Chem; 2000; 45:

8 86 Ł. Chabros i inni Nr 1 7. Griffiths PD, Emery VC: Cytomegalovirus. W: Clinical virology. Red. D.D. Richman., R.J. Whitley., F.G. Hayden, ASM Press, Washington 2002, Griffiths PD, Walter S: Cytomegalovirus. Curr Opin Infect Dis; 2005; 18: Hebart H, Jahn G, Sinzger Ch i inni: CMV Infection in Bone Marrow and Solid Organ Transplant Patients in the Era of Antiviral Prophylaxis. Herpes; 2000; 7: Reed LJ, Muench MA: A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg; 1938; 27: Reusser P, Einsele H, Lee J i inni: Randomized multicenter trial of foscarnet versus ganciclovir for preemptive therapy of cytomegalovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. Blood; 2002; 99: Sinclair J, Sissons P: Latency and reactivation of human cytomegalovirus. J Gen Virol; 2006; 87: Steininger C, Puchhammer-Stockl E, Popow-Kraupp T: Cytomegalovirus disease in the era of highly active antiretroviral therapy (HAART). J Clin Virol; 2006; 37: Torok-Storb B, Boeckh M, Hoy C i inni: Association of specific cytomegalovirus genotypes with death from myelosuppression after marrow transplantation. Blood; 1997; 90: Otrzymano: 21 XII 2007 Adres Autora: Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Akademia Medyczna w Warszawie dzieciatkowski@wp.pl