OPRACOWANIE WYDAJNYCH PROCEDUR IZOLACJI DNA CRYPTOSPORIDIUM SP. I TRICHINELLA SPIRALIS Z PRÓBEK KAŁU

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 259-265 Aleksander Masny, Wioletta Rożej, Elżbieta Gołąb 1 OPRACOWANIE WYDAJNYCH PROCEDUR IZOLACJI DNA CRYPTOSPORIDIUM SP. I TRICHINELLA SPIRALIS Z PRÓBEK KAŁU Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego Państwowy Zakład Higieny Zakład Parazytologii Lekarskiej Kierownik: prof. dr hab. T.H. Dzbeński Celem przeprowadzonych badań było opracowanie procedury izolacji DNA Cryptosporidum sp. i Trichinella spiralis z próbek kału. DNA izolowano z kału zawierającego eksperymentalnie dodane larwy włośnia krętego lub oocysty Cryptosporidium sp., oraz z odchodów myszy zarażonych T. spiralis w warunkach laboratoryjnych i materiału klinicznego od 11 pacjentów cierpiących na kryptosporydiozę. Stwierdzono znaczny wpływ zastosowanej procedury na ilość DNA pasożyta uzyskaną z próbek kału i wykazano wyraźną przewagę lizy chemicznej z jednoczesną homogenizacją nad lizą enzymatyczną poprzedzoną homogenizacją materiału badanego. Różnice w efektywności obu procedur były szczególnie widoczne w wypadku próbek materiału klinicznego. Wykrywanie genetycznego materiału pasożytów obecnych w kale przy użyciu techniki PCR może być metodą diagnostyczną parazytoz jelitowych alternatywną, do rutynowo wykonywanych badań mikroskopowych lub serologicznych. Chorobotwórczy pierwotniak Cryptosporidium parvum przebywa w jelicie cienkim człowieka, a jego formy dyspersyjne, oocysty, wraz z kałem wydalane są do środowiska. Nicień Trichinella spiralis, należy wprawdzie do grupy pasożytów tkankowych, jednak jego rozwój w początkowym etapie inwazji następuje w kryptach jelita cienkiego. Można zatem przypuszczać, że w tym okresie włośnicy materiał genetyczny pasożyta będzie wydalany wraz z kałem osoby zarażonej. Próbki kału są materiałem najczęściej wykorzystywanym przy rozpoznawaniu kryptosporydiozy, natomiast ich przydatność w rozpoznawaniu wczesnej fazy włośnicy jest obecnie badana. Izolacja DNA z próbki jest pierwszym etapem procedury badań molekularnych i ma istotny wpływ na końcowy wynik. Niska wydajność izolacji przy małej ilości matrycowego DNA oraz pozostałości inhibitorów w próbce, mogą być przyczyną fałszywie ujemnego wyniku PCR. 1 Badania sfinansowano ze środków 6 PR UEE, WP27 i WP22

260 A. Masny, W. Rożej, E. Gołąb Nr 3 Celem pracy było opracowanie wydajnych procedur izolacji DNA Cryptosporidum i Trichinella z próbek kału. MATERIAŁ I METODY Przedmiot badań. Trichinella spiralis. Zbadano próbki kontrolne utworzone poprzez dodanie mięśniowych larw pasożyta w liczbie: 1, 5, 10, 20 i 50 sztuk do 300 mg kału zdrowych myszy lub do 1000 mg kału zdrowej świni, a każda próbka kontrolna była zduplikowana. Ponadto, zbadano 10 próbek kału myszy zarażonych dawką 500 larw T. spiralis. Myszy szczepu Swiss zarażano larwami mięśniowymi pasożyta per os, do badań przeznaczono próbki zebrane od 8 do 12 dnia po zarażeniu (1). Cryptosporidium sp. Zbadano próbki kontrolne utworzone poprzez dodanie 10, 100 i 500 oocyst C. parvum do 200 mg kału ludzkiego pobranego od osób zdrowych. Badaniom poddano także próbki kliniczne uzyskane od 11 dzieci z biegunką, w wieku od 1 miesiąca do 9 roku życia (średnia wieku 3 lata), hospitalizowanych w dwóch warszawskich szpitalach pediatrycznych. W tych próbkach stwierdzono uprzednio obecność oocyt Cryptosporidium wykonując badania mikroskopowe (2). I z o l a c j a D N A. Użyto dwóch komercyjnych zestawów przeznaczonych do izolacji DNA z kału: NucliSENS minimag (Biomerieux) i QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen). Zestaw QIAamp DNA Stool Mini Kit Qiagen. Próbki przeznaczone do izolacji poddano trzykrotnie gwałtownemu zamrażaniu i rozmrażaniu a następnie homogenizowano, do izolacji pobierano 1 g kału. Zastosowano procedurę podaną przez producenta dla próbek o dużej objętości. Do próbki dodawano 10 ml buforu ASL i homogenizowano do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Następnie 2 ml zawiesiny przenoszono do nowej probówki i inkubowano w 95 C przez 5 min, następnie ponownie homogenizowano przez 15 s, krótko wirowano przy maksymalnych obrotach i przenoszono 1,2 ml supernatantu do nowej probówki. Dodawano 1 tabletkę Inhibitex i homogenizowano próbkę przez co najmniej minutę, do uzyskania jednorodnej zawiesiny którą inkubowano 1 min w temperaturze pokojowej. Następnie próbkę wirowano przez 3 min przy 12000 x g, płyn z nad osadu przenoszono do nowej probówki, ponownie wirowano w warunkach jak wyżej, 200 μl supernatantu przenoszono do probówki zawierającej 15 μl roztworu proteinazy K, dodawano 200 μl buforu ASL i homogenizowano przez 15 s, po czym inkubowano 10 min w 70 C. W dalszych etapach procedury według zaleceń producenta następowało płukanie roztworami etanolu, buforem AW1 zawierającym chlorowodorek guanidyny i buforem AW2, oraz elucja DNA. Uzyskany roztwór przechowywano w -20 C. Zestaw NucliSENS minimag (Biomerieux). Procedurę podaną przez producenta zmodyfikowano, dodając etap wstępny obejmujący wytrząsanie z kulkami szklanymi. Do 300 mg kału myszy lub 1000 mg kału świń dodawano 500 μl kulek szklanych o średnicy 0,5 mm i 3 ml Lysis Buffer a następnie wytrząsano w 37 C przy 750 obrotach na minutę przez 2 godziny. Do 200 mg kału ludzkiego dodawano 500 μl Lysis Buffer i 500 μl kulek szklanych i wytrząsano w aparacie Mini-Beadbeater-16 przez 1 minutę, następnie inkubowano w wytrząsarce z termostatem w 37 C przy 750 obrotach na minutę przez 1 godzinę.

Nr 3 Izolacja DNA Cryptosporidium sp. i Trichinella spiralis 261 Pozostała część procedury była zgodna z instrukcją dołączoną do zestawu NucliSENS minimag; próbkę wirowano 10 min przy 1500 g, pobierano supernatant i inkubowano z krzemionkowymi kulkami magnetycznymi (czas inkubacji wydłużono z 10 do 20 minut), wirowano 2 min przy 1500 x g, jednokrotnie płukano Wash Buffer 1, dwukrotnie płukano Wash Buffer 2 i jednokrotnie Wash Buffer 3, a następnie kulki suszono i eluowano DNA za pomcą Elution Buffer. Wszystkie płukania wykonywano w aparacie minimag. Lysis Buffer i Wash Buffer 1 wykorzytywane w badaniach były częścią zestawu NucliSENS lub przygotowano je zgodnie z procedurą opisaną przez Boom i wsp. (3). Wykrywanie DNA.Obecność DNA T. spiralis w preparatach wykrywano w reakcji PCR (1) z parą starterów ATP6-F01 (5 -CACACTAACCAAAGCCAAACCATC- 3 ), ATP6-R (5 -GGAGTATGTTAGATGTTATTGTGTAGGAG-3 ) powielających fragment genomu mitochondrialnego znajdujący się w obrębie podjednostki F0 genu ATP6 (Gene- ID: 802674). Reakcję prowadzono w 25 μl 1x stężonego buforu PCR (Qiagen), 0,2 mm mieszaninie dntp (Promega), 0,25 μm stężeniu każdego ze starterów i dodawano 1 U Hot Start Taq DNA polimerazy (Qiagen). Po aktywacji polimerazy w temp. 95 C przez 15 min, stosowano następujący profil temperatur w 42 cyklach reakcji: 94 C przez 0,5 min, 60 C przez 0,5 min i 72 C przez 1 minutę. Na zakończenie mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 4 min w 72 C. Wielkość produktu PCR wynosiła 251 pz. Produkty PCR rozdzielano w 1% żelu agarozowym z bromkiem etydyny i wizualizowano w świetle UV. W reakcji nested PCR (npcr) amplifikacji poddawano fragmenty genu COWP kodującego białko otoczki Cryptosporidium sp. wykorzystując startery zewnętrzne BCOWP-F (5 -ACCGCTTCTCAACAACCATCTTGTCCTC-3 ) oraz BCOWP-R (5 -CGCACCT- GTTCCCACTCAATGTAAACCC-3 ) i startery wewnętrzne Cry 15 (5 -GTAGATAATG- GAAGAGATTGTG-3 ) oraz Cry 9 (5 -GGACTGAAATACAGGCATTATCTTG-3 ) opisane w literaturze (4). Reakcja PCR przebiegała według schematu: 95 C przez 15 min, 40 cykli z temperaturą przyłączania starterów 55 C przez 0,5 min, przy zachowanych temperaturach denaturacji: 95 C przez 0.5 min i wydłużania łańcucha 72 C przez 1 min, oraz etap końcowy 72 C przez 10 minut. W npcr zastosowano warunki: 95 C przez 15 min, 35 cykli: 95 C przez 0,5 min, 65 C przez 0,5 min, 72 C przez 1 min, etap końcowy: 72 C przez 10 minut. Wielkość produktów reakcji wynosiła 769 pz oraz 553 pz odpowiednio dla PCR i npcr. Odczytu wyników PCR dokonywano w świetle UV, po przeprowadzeniu rozdziału elektroforetycznego w 1,5% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. WYNIKI Procedury QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen) i NucliSENS minimag (Biomerieux) pozwalały na izolację 80-130 μg DNA całkowitego z 1 grama kału myszy. Od 40 do70 μg całkowitego DNA izolowano z 1 grama kału świń. Po zastosowaniu zmodyfikowanej procedury NucliSENS minimag (Biomerieux) pozytywne wyniki amplifikacji fragmentów genu T. spiralis otrzymano dla próbek kału myszy i świni zawierających: 1, 5, 10, 20 i 50 larw mięśniowych. Limit detekcji wynosił 10 larw na 1 gram kału, gdy amplifikowano próbkę DNA wyizolowanego przy użyciu zestawu QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen). W kale myszy zarażonych 500 larwami T. spiralis DNA pasożyta wykryto w 9 z 10 zbadanych próbek

262 A. Masny, W. Rożej, E. Gołąb Nr 3 zebranych od 8 do 12 dnia inwazji, po zastosowaniu procedury izolacji DNA NucliSENS minimag (Biomerieux). Gdy DNA izolowano zgodnie z procedurą QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen) w żadnej ze zbadanych próbek uzyskanych od 8 do 12 dnia inwazji od myszy zarażonych T. spiralis nie uzyskano pozytywnego wyniku amplifikacji. Po izolacji DNA przy zastosowaniu zmodyfikowanej procedury NucliSENS minimag, pozytywne wyniki npcr otrzymano dla próbek zawierających 100 i 500 oocyst Cryptosporidium. Limit detekcji npcr wynosił 500 oocyst na próbkę gdy powielano DNA wyizolowane przy użyciu zestawu QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen). Cryptosporidium wykryto w 11 próbkach kału ludzkiego, gdy w procesie izolacji DNA zastosowano procedurę NucliSENS minimag (Biomerieux). Wynik PCR na matrycy DNA uzyskanej z tych próbek procedurą QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen) był ujemny. DYSKUSJA Metody molekularne są coraz częściej stosowane w parazytologii nie tylko do celów badawczych ale też diagnostycznych. Jednak użyteczność tych bardzo czułych metod bywa ograniczona, gdy liczba pasożytów jest zbyt mała w stosunku do objętości badanej próbki. Dodatkową przeszkodę stanowi też wysoka odporność pasożytów na wiele czynników biologicznych i fizykochemicznych, która jest podstawą ich przetrwania i szerzenia się. Pierwszym etapem badań prowadzonych z wykorzystaniem technik biologii molekularnej jest izolacja materiału genetycznego z próbki. Obecnie na rynku dostępnych jest wiele zestawów komercyjnych umożliwiających izolację DNA z różnego rodzaju materiału biologicznego. W przeprowadzonych badaniach posłużono się zestawami QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen) oraz NucliSENS minimag (Biomerieux), modyfikując dołączone do nich procedury. W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że zastosowanie zmodyfikowanej procedury NucliSENS minimag do oczyszczania próbki kału istotnie podnosi wydajność amplifikacji DNA T. spiralis i C. parvum. Pomiędzy procedurą NucliSENS minimag i QIAamp DNA Stool Mini Kit występuje szereg różnic, z których najbardziej istotną wydaje się być sposób lizy. W procedurze QIAamp DNA Stool Mini Kit w etapie wstępnym do lizy komórek wykorzystywany jest enzym, proteinaza K, po czym próbka jest płukana w posiadającym właściwości lityczne chlorowodorku guanidyny. Natomiast w procedurze NucliSENS minimag liza komórek następuje wyłącznie na drodze chemicznej; próbka poddawana jest działaniu roztworu rodanku guanidyny i detergentu Triton X-100. Proces lizy enzymatycznej może nie działać skutecznie na endopasożyty, które wykształciły wiele mechanizmów obronnych przeciwko szerokiej gamie enzymów litycznych obecnych w organizmach ich żywicieli. Z kolei liza chemiczna zawodzić może przy oddziaływaniu na formy dyspersyjne pasożytów, które wykazują dużą oporność na warunki fizykochemiczne środowiska zewnętrznego, a także jak w przypadku Cryptosporidum, oporne są na większość stosowanych powszechnie środków dezynfekujących (5). Skutecznym rozwiązaniem problemu wydaje się więc mechaniczne rozbijanie próbek zawierających pasożyty. W przeprowadzonej pracy zastosowano dodatkowe etapy mające na celu mechaniczne uszkodzenie struktury pasożyta. Przed procesem izolacji według procedury QIAamp DNA Stool Mini Kit próbki trzykrotnie rozmrażano/zamrażano a później mielono natomiast do izolacji metodą NucliSENS minimag przeznaczono próbki uprzednio wytrząsane ze szklanymi kulkami.

Nr 3 Izolacja DNA Cryptosporidium sp. i Trichinella spiralis 263 W wyniku obserwacji mikroskopowej stwierdzono, że larwy włośnia krętego poddane dwugodzinnemu wytrząsaniu z kulkami szklanymi ulegały fragmentacji, po której następował wyciek ich zawartości. Uszkodzenia mechaniczne umożliwiały kontakt wrażliwych komórek wewnętrznych pasożyta z odczynnikiem lizującym, czego rezultatem mogła być wyższa skuteczność izolacji DNA zmodyfikowanej procedury NucliSENS minimag w porównaniu do skuteczności procedury QIAamp DNA Stool Mini Kit. Harmon i wsp. (6) stwierdzili, że mechaniczne rozbijanie materiału jest sposobem zwiększania wydajności izolacji DNA z jaj nicieni pasożytniczych. Natomiast Lindergard i wsp. (7) zauważyli, że rozbijanie materiału zawierającego oocysty może mieć wpływ na zwiększenie wydajności izolacji DNA Cryptosporidium. Istotny wpływ mechanicznego rozbijania materiału i jego kombinacji z lizą enzymatyczną lub chemiczną na zwiększenie wydajności izolacji DNA niektórych bakterii obecnych w kale opisali wcześniej Ridlon i wsp. (8). Autorzy Ci stwierdzili ponadto, że wykorzystywany w badaniach zestaw QIAamp DNA Stool Mini Kit nie sprawdzał się przy izolacji DNA bakterii takich jak: Desulfovibrio vulgaris, Methanobrevibacter smithii i Lactobacillus plantarum, choć pozwalał na wydajną izolację DNA innych bakterii. Jiang i wsp. (9) wykazali, że DNA Cryptosporidium sp. wyizolowane ze ścieków komunalnych przy użyciu zestawu QIAamp DNA Stool Mini Kit było amplifikowane za pomocą PCR z niską wydajnością, w porównaniu z wydajnością amplifikacji przeprowadzonej z wykorzystaniem matryc otrzymanych przy użyciu zestawów do izolacji DNA z ziemi, opartych na kombinacji lizy chemicznej i fizycznej. W przeprowadzonych badaniach stwierdzono, że poziom wydajności izolacji z wykorzystaniem zestawu QIAamp DNA Stool Mini Kit był porównywalny do osiąganego za pomocą NucliSENS minimag tylko w przypadku izolacji całkowitego DNA próbki i wynosił pomiędzy 40 i 130 μg w zależności od pochodzenia badanego kału. Natomiast poziom detekcji DNA pasożytów Crytosporidium sp. i Trichinella spiralis po zastosowaniu QIAamp DNA Stool Mini Kit był znacznie niższy aniżeli po zastosowaniu NucliSens MiniMag. Zatem, ilość wyizolowanego całkowitego DNA nie powinna być traktowana jako podstawa do oceny wydajności detekcji pasożytów, co w wyniku swoich badań stwierdzili również Jiang i wsp. (9). W przeprowadzonej przez nas pracy różnica czułości PCR w zależności od rodzaju zastosowanej procedury izolacji była co najmniej pięciokrotna przy oczyszczaniu DNA Cryptosporidium i dziesięciokrotna w wypadku izolacji DNA Trichinella spiralis. Eksperymenty z materiałem klinicznym pokazały, że te różnice mogą mieć ogromny wpływ na uzyskiwane wyniki diagnostyczne wszystkie z 11 próbek, w których wykryto obecność Cryptosporidium po PCR na matrycy DNA izolowanego NucliSens MiniMag uznano za negatywne gdy DNA otrzymano za pomocą QIAamp DNA Stool Mini Kit. Nie uzyskano też pozytywnych wyników przy amplifikacji próbek pochodzących od zarażonych myszy. W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że procedura izolacji DNA zawierająca etapy mechanicznego rozbijania materiału i chemicznej lizy komórek może być użyteczna w diagnostycznych badaniach koprologicznych w kierunku kryptosporydiozy. Stwierdzono także jej użyteczność w monitorowaniu obecności DNA Trichinella w pierwszym etapie doświadczalnej włośnicy u myszy, ale nie można wyciągać wniosku o przydatności tej procedury, w jej obecnej formie, do diagnostyki trichinelozy u ludzi. Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że z dwóch badanych procedur NucliSens MiniMag z mechanicznym rozbijaniem materiału dawała lepsze wyniki w izolacji DNA z dwóch filogenetycznie odległych pasożytów.

264 A. Masny, W. Rożej, E. Gołąb Nr 3 A. Masny, W. Rożej, E. Gołąb DEVELOPMENT OF EFFICIENT DNA ISOLATION PROCEDURES FOR CRYPTOSPORIDUM AND TRICHINELLA PCR DETECTION IN FECAL SAMPLES SUMMARY PCR detection of genetic material of the parasites present in faeces may be an alternative for microscopic and serological tests routinely used for diagnosing parasitic enteral infections. However, small amount of target DNA combined with low efficiency of total DNA extraction, and presence of PCR inhibitors in the samples to be amplified, may cause false negative detection results. The aim of this work was to evaluate the impact of DNA isolation procedure used on the amplification of DNA fragments from the genomes of protozoan Cryptosporidium parvum and the nematode Trichinella spiralis. Two methods based on different principles of biological material lysis were evaluated; NucliSENS minimag employing simultaneously applied chemical lysis and mechanical disruption or mechanical disruption followed by enzymatic lysis in case of QIAamp DNA Stool Mini Kit. Both of the analyzed systems for nucleic acids purification allowed isolation of DNA from purified Cryptosporidium parvum oocysts and Trichinella spiralis muscle larva mixed with mouse or pig faeces. However, sensitivity of PCR detection of DNA obtained by enzymatic lysis based method was lower compared to the one achieved with DNA isolated by chemical lysis. When QIAamp DNA Stool Mini Kit procedure was used detection limit was 5 and 10 fold higher for Cryptosporidium parvum and Trichinella spiralis, respectively. Only NucliSENS minimag procedure combined with mechanical disruption of the faecal material allowed detection of Cryptosporidium sp. in human fecal samples collected from children with diahorrea, and detection of Trichinella spiralis in stool samples obtained, on days 8 to 12 post infection, from mice experimentally infected with 500 muscle larvae per mouse. Thorough mechanical disruption with simultaneous chemical lysis allows efficient isolation of DNA of the investigated intestinal parasites present in stool and the subsequent PCR detection. PIŚMIENNICTWO 1. Golab E, Rozej W, Wnukowska N i inni. Detection of Trichinella spiralis DNA in mouse faeces during the early stage of infection. J Microbiol Methods 2009 doi:10.1016/j.mimet.2009.05.019 artykuł w druku. 2. Gołąb E, Waloch M, Rozej W i inni. Evaluation of prevalence of Cryptosporidium spp. in children with diarrhoea. Wiad Parazytol 2007; 53 (suppl): 103 3. Boom R, Sol C, Beld M i inni. Improved silica-guanidinium thiocyanate DNA isolation procedure based on selective binding of bovine alpha-casein to silica particles. J Clin Microbiol 1999; 37: 615-9. 4. Bajer A, Cacciò S, Bednarska M. i inni. Preliminary molecular characterization of Cryptosporidium parvum isolates of wildlife rodents from Poland. J Parasitol 2003; 89: 1053-5. 5. McDonnell G, and Russell AD. Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance Clin Microbiol Rev 1999; 12: 147-79. 6. Harmon AF, Zarlenga DS, Hildreth MB. Improved methods for isolating DNA from Ostertagia ostertagi eggs in cattle feces. Vet. Parasitol 2006; 135: 297-302. 7. Lindergard G, Nydam DV, Wade SE i inni. The sensitivity of PCR detection of Cryptosporidium oocysts in fecal samples using two DNA extraction methods. Mol Diagn 2003; 7: 147-53. 8. Ridlon JM, McGarr SE, Hylemon PB. Development of methods for the detection and quantification of 7alpha-dehydroxylating clostridia, Desulfovibrio vulgaris, Methanobrevibacter smithii, and Lactobacillus plantarum in human feces. Clin Chim Acta. 2005; 357: 55-64

Nr 3 Izolacja DNA Cryptosporidium sp. i Trichinella spiralis 265 9. Jiang J, Alderisio KA, Singh A, i inni. Development of procedures for direct extraction of Cryptosporidium DNA from water concentrates and for relief of PCR inhibitors. Appl Environ Microbiol. 2005; 71: 1135-41. Otrzymano: 24 VI 2009 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Parazytologii Lekarskiej NIZP-PZH