Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych - ćwiczenie nr 4

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych - ćwiczenie nr 4 przedmiot: Techniki Rozdzielania Mieszanin kierunek studiów: Biotechnologia, 3-ci rok Opracował: Zatwierdził : mgr inż. Grzegorz Boczkaj mgr inż. Mariusz Jaszczołt prof. dr hab. inż. Marian Kamiński prof. dr hab. inż. Marian Kamiński Gdańsk, 2011

Spis treści 1. Wstęp... 3 2. Wprowadzenie... 3 3. Podstawowe informacje i zależności... 4 3.1. Efektywność ekonomiczna (produktywność) rozdzielania preparatywnego i procesowego... 4 3.2. Warunki przenoszenia skali rozdzielania oraz przeładowania kolumny... 5 3.3. Techniki wzbogacania frakcji oraz izolacji składników frakcji... 9 3.4. Kontrola jakości zebranych frakcji. Metody badań czystości frakcji i produktów... 13 3.5. Zagadnienia ekonomicznego postępowania w skali preparatywnej i procesowej - Regeneracja aktywności sorpcyjnej kolumny i recyrkulacja eluentu... 14 4. Wykonanie ćwiczenia... 16 5. Wymagania do sprawdzianu... 16 6. Literatura... 17 7. Sprawozdanie... 19 2

1. Wstęp Część 4-ta ćwiczenia laboratoryjnego z technik rozdzielania mieszanin dla kierunku Biotechnologia polega na wykonaniu rozdzielania w skali preparatywnej składników serwatki uzyskanej z mleka krowiego, w celu otrzymania frakcji zawierających α-laktoalbuminę i/albo laktozę. Uzyskana frakcja zostanie poddana kontroli jakości (określeniu czystości) z wykorzystaniem kolumnowej chromatografii cieczowej w zastosowaniu analitycznym. Istotą ćwiczenia jest poznanie zasad przenoszenia skali rozdzielania ze skali modelowej do preparatywnej, zasad optymalizacji warunków rozdzielania w skali preparatywnej oraz maksymalizacji produktywności / opłacalności rozdzielania poprzez prowadzenie procesu w warunkach przeładowania stężeniowego i/lub objętościowego. Na zajęciach zostaną również omówione i wykorzystane w praktyce techniki wzbogacania i/lub izolacji składników frakcji. 2. Wprowadzenie W wielu zadaniach rozdzielczych techniki chromatograficzne stanowią jedyne uzasadnione ekonomicznie podejście do otrzymywania substancji w ilościach pozwalających na ich wykorzystanie w (mikro)syntezie lub jako produkty do wykorzystania komercyjnego. W zależności od celu w jakim stosuje się chromatografię jako technikę wydzielania składników lub frakcji można wyróżnić jej dwa typy [*] : chromatografia preparatywna - ilości otrzymanych substancji są niewielkie, lub otrzymywane okresowo/sporadycznie; chromatografia procesowa (PLC) (produkcyjna) - proces prowadzony jest systematycznie, w sposób cykliczny lub ciągły, ilość produktu jest znacznie większa (np. otrzymywanie produktu handlowego - składników leku, enzymów itp.) 3

3. Podstawowe informacje i zależności 3.1. Efektywność ekonomiczna (produktywność) rozdzielania preparatywnego i procesowego Efektem jednego rozdzielania jest określona objętość eluatu zebrana jako konkretna frakcja zawierająca pożądany składnik lub składniki. Iloczyn objętości zebranego eluatu i stężenia konkretnego składnika pozwala na obliczenie efektu rozdzielania wyrażonego jako mole lub (częściej) masa tego składnika. Uwzględnienie czasu potrzebnego na wykonanie jednego rozdzielania a następnie na ustabilizowanie warunków pozwalających na wykonanie kolejnego rozdzielania, pozwala na określenie czasu trwania jednego cyklu rozdzielczego, a tym samym wyznaczenie masy składnika uzyskiwanego preparatywnie/procesowo w jednostce czasu. Możliwe jest również uwzględnienie innych aspektów ekonomicznych procesu, tj. wykorzystywanej masy sorbentu, zużywanej ilości eluentu (zależności poniżej) [**]. Pierwszą zastosowaną do określania wydajności kolumny preparatywnej wielkością jest tzw. przerób R h lub Th (ang. throughput), czyli masa substancji i otrzymywana w jednostce czasu przy użyciu konkretnej kolumny i konkretnego układu chromatograficznego. m i R h = (1) tc m i masa izolowanej substancji i, t c - czas cyklu rozdzielczego Th m m i = (2) w w V c m w masa wypełnienia, w- objętościowe natężenie przepływu eluentu, V c objętość eluentu zużywana podczas jednego cyklu rozdzielczego Przydatnym parametrem uniwersalnym pozwalającym na porównywanie różnych układów chromatograficznych oraz z zastosowaniem kolumn o różnych wymiarach jest tzw. produktywność jednostkowa kolumny (Pt): m t F i Pt = (3) i c c m V F i Pt = (3 ) c c F c pole przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny 4

Ze względu na wysoki koszt, zarówno fazy stacjonarnej, jak również, organicznych składników eluentu, korzystne jest stosowanie łącznie wzorów (2) i (3 ) do określania efektywności ekonomicznej danego procesu rozdzielczego. Masa sorbentu stosowana dla potrzeb analitycznych, gdzie masa rozdzielanych substancji jest nieznaczna (z reguły kilka do kilkudziesięciu µg, a w najnowocześniejszych rozwiązaniach nawet dwa-trzy rzędy wielkości mniej), jest niewielka. Po dobraniu optymalnych warunków rozdzielania w skali modelowej, z kolumną o tym samym wypełnieniu, jak preparatywna, o tej samej długości Lc i w tym samym układzie chromatograficznym oraz dla takiej samej liniowej prędkości przepływu eluentu (u), jednak, o niewielkiej średnicy kolumny (dc) - co zmniejsza koszty badań - określa się stopień trudności problemu rozdzielczego, charakteryzowanego parametrem α. Przyjmuje się że dla α >1,15 problem rozdzielczy jest łatwy, natomiast dla α <1,15 trudny. 3.2. Warunki przenoszenia skali rozdzielania oraz przeładowania kolumny Zwiększenie masy substancji jednorazowo dozowanej do kolumny oznacza zwiększenie stopnia przeładowania sorbentu (kolumny). Celowa jest maksymalizacja produktywności kolumny, co uzyskuje się poprzez prowadzenie rozdzielania w warunkach przeładowania sorbentu masą rozdzielanych substancji. Przekroczenie określonej masy mieszaniny wprowadzonej do kolumny dla danej masy sorbentu, powoduje, że charakterystyka oddziaływań substancje rozdzielane-faza stacjonarna nie znajduje się w obszarze liniowego zakresu izotermy sorpcji, a w efekcie następuje poszerzenie pasm (pików) chromatograficznych zaczynają przyjmować kształt trójkąta prostokątnego zniekształconego o dyspersję. Wyróżnia się dwa typy przeładowań [*] : przeładowanie stężeniowe bardziej korzystne ekonomicznie dozowana mieszanina charakteryzuje się wysokim stężeniem substancji rozdzielanych 5*10-2 g mieszaniny rozdzielanych substancji / g sorbentu typu żel krzemionkowy lub chemicznie modyfikowany żel krzemionkowy; przeładowanie objętościowe mniej korzystne ekonomicznie stosowane w przypadkach gdy substancje rozdzielane słabo rozpuszczają się w eluencie, typowe stężenia stosowane w praktyce oscylują w granicach 5*10-4 g mieszaniny 5

rozdzielanych substancji / g sorbentu typu żel krzemionkowy lub chemicznie modyfikowany żel krzemionkowy. Objętość dozowanego roztworu (V i ) przekracza: V i VR > (4do6) (4) N 0 N 0 liczba półek teoretycznych warunkach braku przeładowania, V R objętość retencji W zależności od zastosowanego typu przeładowania obserwowany jest inny kształt pików chromatograficznych (rys. 1-2) [**]. Dla otrzymania odpowiednio dużej masy substancji z każdego rozdzielania, przy zachowaniu odpowiedniej rozdzielczości, niezbędne jest zwiększenie skali rozdzielania, tzn., przede wszystkim zwiększenie średnicy kolumny, w stosunku do kolumny modelowej. Po dobraniu warunków rozdzielania preparatywnego w skali modelowej w warunkach przeładowania kolumny, stosuje się określone zasady przenoszenia warunków do skali preparatywnej lub procesowej. W zależności od stopnia trudności problemu rozdzielczego oraz od celu rozdzielania, przyjmuje się różne strategie postępowania dla przenoszenia skali rozdzielania [**]: Zwiększenie wyłącznie średnicy kolumny (dc), bez zwiększania długości warstwy wypełnienia (Lc) oraz z zachowaniem takiego samego wypełnienia oraz składu eluentu / programu elucji, jak w skali modelowej warunki prostego przenoszenia skali rozdzielania; Jednoczesne zwiększenie wszystkich geometrycznych wymiarów kolumny, czyli, tak średnicy (dc), jak i długości warstwy wypełnienia (Lc) oraz często, z jednoczesnym zwiększeniem wielkości ziaren wypełnienia kolumny warunki złożonego powiększanie skali rozdzielania celowe zachowanie takiej samej liczby półek teoretycznych, wyznaczonych w warunkach braku przeładowania kolumny w skali technicznej i modelowej!!! Ze znacznym zwiększeniem wymiarów geometrycznych kolumny, wiąże się konieczność zwiększenie skali całej aparatury, a więc przenoszenie skali od modelu do skali technicznej. Na rysunkach 1 i 2 przedstawiono zmiany kształtu piku oraz charakterystyczne zjawiska zachodzące podczas przeładowania odpowiednio objętościowego i stężeniowego, w przypadku izotermy sorpcji typu langmuirowskiego. W praktyce dla niektórych układów 6

chromatograficznych stwierdzono wykładniczy (ze względu na kształt zwany także typem S lub anty-langmuir ) charakter izoterm sorpcji. Implikuje to dodatkowe zjawiska występujące w kolumnie przede wszystkim tzw. sorpcję wielowarstwową, wynikająca z oddziaływań zaadsorbowanych cząsteczek substancji rozdzielanej z cząsteczkami tej samej i innych substancji obecnymi w fazie ruchomej. Uwaga, w przypadku stosowania zbyt wysokich stężeń mieszaniny wprowadzonej do kolumny, istnieje wówczas możliwość kondensacji kapilarnej w porach wypełnienia kolumny i otrzymywanie niskich stopni odzysku, rozdzielnych składników!!! 7

Rys. 1 Przykład efektu zmiany kształtu pików podczas przeładowania objętościowego. W części I przedstawiono nałożenie pików chromatograficznych uzyskiwanych w warunkach bez przeładowania (1), dolnej granicy przeładowania objętościowego (2) oraz przykład typowego przebiegu chromatograficznego w warunkach przeładowania objętościowego (3). Jak przedstawiono w części II, stężenie analizowanej substancji znajduje się w zakresie liniowości izotermy sorpcji (typu Langmuir). Uzyskiwane w przypadku przeładowania objętościowego piki chromatograficzne mają kształt zbliżony do prostokąta, którego wysokość (plateau) odpowiada stężeniu w dozowanej próbce. Strzałkami zaznaczono umiejscowienie maksimum piku w warunkach (1) w piku w warunkach (3), tj. mniej więcej na początku plateau. W części III przedstawiono również efekt nakładania się pików w przypadku zmniejszenia R s poniżej wartości 1. Rys. 2 Przykład efektu zmiany kształtu pików podczas przeładowania stężeniowego. W części I przedstawiono nałożenie pików chromatograficznych uzyskiwanych w warunkach bez przeładowania (1), dolnej granicy przeładowania stężeniowego (2) oraz przykład typowego przebiegu chromatograficznego w warunkach przeładowania stężeniowego (3). Jak przedstawiono w części II, stężenie analizowanej substancji znajduje się poza zakresem liniowości izotermy (typu Langmuir) sorpcji. Uzyskiwane w przypadku przeładowania stężeniowego piki chromatograficzne mają kształt zbliżony do trójkąta prostokątnego. Strzałkami zaznaczono umiejscowienie maksimum piku w warunkach (1) w piku w warunkach (3), tj. mniej więcej na końcu zbocza piku po stronie zstępującej (zmniejszenie wartości retencji maksimum piku w warunkach przeładowania). W części III przedstawiono również efekt nakładania się pików w przypadku zmniejszenia R s poniżej wartości 1.. 8

Rys. 3 Przykład efektu zmiany kształtu pików podczas przeładowania stężeniowego dla układu charakteryzowanego izotermą sorpcji typu S. W części I przedstawiono nałożenie pików chromatograficznych uzyskiwanych w warunkach bez przeładowania (1), dolnej granicy przeładowania stężeniowego (2) oraz przykład typowego przebiegu chromatograficznego w warunkach przeładowania stężeniowego (3). Jak przedstawiono w części II, stężenie analizowanej substancji znajduje się poza zakresem liniowości izotermy (typu S ) sorpcji. Uzyskiwane w przypadku przeładowania stężeniowego piki chromatograficzne mają kształt zbliżony do trójkąta prostokątnego, ale w porównaniu z Rys. 2 są odwrócone, tzn. asymetria piku występuje po stronie wstępującej. Umiejscowienie maksimum piku w warunkach (1) w piku w warunkach (3), znajduje się podobnie jak w przypadku opisanym na rys. 2, mniej więcej na końcu zbocza piku po stronie zstępującej. Obszerne opracowanie poświęcone przykładom zastosowań procesowej LC wdrożonych w przemyśle wymagane do zapoznania przez Studentów przed przystąpieniem do zajęć zawiera pozycja [****] literatury. 3.3. Techniki wzbogacania frakcji oraz izolacji składników frakcji Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) SPE RP W przypadku ekstrakcji do fazy stałej w odwróconym układzie faz podobnie, jak w przypadku RP HPLC, sorbent jest znacznie mniej polarny, niż faza ruchoma. Mechanizm rozdzielania składników mieszaniny opiera się na interakcjach miedzy hydrofobowymi fragmentami strukturalnymi substancji rozdzielanych oraz hydrofobowymi miejscami aktywnymi występującymi na powierzchni sorbentu. Owe interakcje głównie opierają się na występowaniu oddziaływań van der Waalsa na powierzchni hydrofobowej fazy stacjonarnej oraz oddziaływań solwatacyjnych i solwo-fobowych w fazie ruchomej eluentu. Elucja 9

zaadsorbowanych hydrofobowych składników mieszaniny dokonywana jest poprzez zastosowanie eluentu o silnym powinowactwie do fazy stacjonarnej, w celu dezaktywacji oddziaływań sorbent analit (np. AcCN, czy dioksan itp.). Modyfikacja powierzchni żelu krzemionkowego często nie zachodzi w 100 % - ach, dlatego na powierzchni sorbentu pozostają niezmodyfikowane grupy silanolowe (Si-OH). Te niedezaktywowane grupy funkcyjne odpowiadają za występowanie oddziaływań drugorzędowych (polarnych), szczególnie w stosunku do zasadowych składników frakcji. W takim przypadku eluent wzbogacany jest dodatkiem lotnego składnika wysoce polarnego o charakterze zasadowym (np. dietyloaminą), aby dezaktywować oddziaływania polarne. Sposobem uniknięcia tego rodzaju niedogodności jest użycie faz stacjonarnych z tzw. endcappingiem, czyli metylosililowanie wolnych grup silanolowych (Si-OH), obecnych na powierzchni sorbentu. SPE IE Jonowymienna ekstrakcja do fazy stałej wykorzystywana jest, kiedy przedmiotem zainteresowania jest składnik frakcji ulegający dysocjacji w roztworze wodnym (czasami rozpuszczalnikiem jest substancja organiczna). Mechanizm retencji, podobnie, jak w przypadku chromatografii jonowymiennej (IEC LC) opiera się na zjawisku konkurencyjności oddziaływań obdarzonych ładunkiem grup funkcyjnych substancji rozdzielanej i przeciwjonów centrów aktywnych sorbentu oraz grup funkcyjnych centrów aktywnych fazy stacjonarnej. CE SPE (kationowymienne SPE) Podobnie jak w przypadku kationowymiennej chromatografii cieczowej sorbent stanowi porowaty materiał żelu krzemionkowego zmodyfikowany grupami chemicznymi zdolnymi do jonizacji i tworzenia anionów. Identycznie jak, w przypadku IEC LC kationity podzielić można na mocne (SCX), z modyfikacjami w postaci grup sulfonowych oraz średnio mocne i słabe (WCX), np. grupy karboksylowe i fenolowe. Dodatkowo żel krzemionkowy modyfikowany grupami propylonitrylowymi oraz grupami di-hydroksylowymi (diol) są również wykorzystywane, jako wymieniacze kationów. AE SPE (anionowymienne SPE) SAX, czyli silne anionity, to zazwyczaj czwartorzędowe sole amoniowe, natomiast WAX (średnio mocne i słabe) anionity, to sprotonowane trzecio- i drugorzędowe aminy. Dodatkowo krzemionka modyfikowana grupami aminopropylowymi jest wykorzystywana, jako słaby wymieniacz anionów. 10

W tabeli nr 1 zestawiono fazy stacjonarne produkowane przez firmę Sigma Aldrich Tab. 1 Zestawienie sorbentów wraz z ich zastosowaniem produkowanych przez firmę Sigma Aldrich. Jeżeli nie napisano inaczej, to średnica ziarna wynosi 40 µm, natomiast średnica porów 60Å Nazwa handlowa Modyfikator krzemionki Zastosowanie LC-18 oktadecyl Antybiotyki, barbiturany, benzodiazepiny, kofeina, herbicydy, pestycydy, parabeny, witaminy, steroidy ENVI TW 18 oktadecyl Antybiotyki, witaminy, PNA, ftalany, surfaktanty kapowanie sorbentu LC-8 oktyl Ftalany, PNA, węglowodany ENVI TW 8 oktyl Fungicydy, herbicydy, pestycydy, węglowodany, kapowanie sorbentu fenole LC-4 Butylo-dimetyl Peptydy i białka kapowanie sorbentu (500Å) LC-Ph Fenyl Związki aromatyczne Hisep TW C18 związana z Proteiny i peptydy hydrofilowym polimerem LC-CN Cyjanopropyl Aflatoksyny, antybiotyki, fenole i steroidy kapowanie sorbentu LC-NH 2 aminopropyl Węglowodany, kwasy organiczne SAX NR + 4 Cl - Kwasy nukleinowe, organiczne, nukleotydy SCX SO - 3 Na + Antybiotyki, katecholaminy, aminokwasy WCX COO - Na + Aminy organiczne, aminokwasy, leki, WAX NHR + 2 Cl - Aminokwasy, leki, kwasy organiczne RP IE Etapy wykonania SPE 1. Wybór odpowiedniej kolumienki SPE Rodzaj stosowanego sorbentu w znacznej mierze jest uzależniony od charakteru chemicznego składnika frakcji poddawanej obróbce, będącego obiektem zainteresowania. Cechy analitu wpływające na wybór sorbentu: Objętość frakcji Masa składnika Hydrofobowość oraz zdolność do polaryzacji substancji rozdzielanej 2. Kondycjonowanie złoża Etap służący aktywowaniu powierzchni sorpcyjnej. Polega na przemyciu określona ilością (zależna od rodzaju wypełnienia) rozpuszczalnika powierzchni sorbentu. Zwinięte (poskręcane) łańcuchy fazy stacjonarnej ulegają rozwinięciu, tym samym zwiększając powierzchnię sorpcyjną. 3. Naniesienie próbki / wsadu 11

Objętość wsadu mieści się w przedziale od kilku µl do kilku litrów. Może być tym większa, im słabszym eluentem jest rozpuszczalnik wsadu względem fazy stacjonarnej spełniającej funkcję sorbentu. Natężenie przepływu eluentu jest dostosowane do konkretnej metodyki oraz zależy od średnicy kolumienki sorpcyjnej. Z reguły nie przekracza 5ml/min, a przepływ jest wymuszony zmniejszeniem ciśnienia na wylocie z kolumienki. 4. Przemycie i suszenie złoża Można wyróżnić dwa przypadki: interesujący składnik mieszaniny silnie oddziałuje z sorbentem lub oddziaływania sorbent analit są stosunkowo słabe. W pierwszym przypadku sorbent jest przemywany rozpuszczalnikiem, który nie będzie eluował składnika mieszaniny z kolumienki. Po przemyciu sorbentu kilkoma objętościami kolumienki, jeśli ze złożem związały się zanieczyszczenia, należy użyć rozpuszczalnika i średniej sile elucyjnej w celu ich usunięcia. Natomiast, kiedy interesujący składnik mieszaniny wykazuje dość słabe oddziaływania z sorbentem, złoże jest przemywane minimalną małą porcją rozpuszczalnika wsadu, aby nie dopuścić do elucji składnika / składników zaadsorbowanych na warstwie porowatej złoża. 5. Elucja Elucja, czyli wymycie interesującego składnika mieszaniny jest wykonywane mocnym eluentem, aby uzyskać jak najwyższy stopień wzbogacenia frakcji eluatu w interesujący nas składnik. 12

Rys. 4 Schemat procesu ekstrakcji do fazy stałej. Inne techniki wzbogacania frakcji: Odparowanie próżniowe Liofilizacja Krystalizacja Ekstrakcja ciecz ciecz Niezbędne informacje dotyczące powyższych technik przygotowywania frakcji są dostępne w zalecanej literaturze *** 3.4. Kontrola jakości zebranych frakcji. Metody badań czystości frakcji i produktów HILIC - HPLC/RID RP - HPLC / UV VIS-DAD Spektrofotometria UV-VIS, MIR-FTIR, FLD, itp. 13

Metody oznaczenia ilościowego w HPLC Metoda wzorca wewnętrznego ma zastosowanie w przypadku metody analitycznej wymagającej kilku etapowej procedury przygotowania próbek. Dodatkowo, metoda jest niewrażliwa na zmianę ilości dozowanej próbki. Zaletą metody dodatku wzorca jest wykonanie kalibracji w takich warunkach, że anality znajdują się w rzeczywistej matrycy. Szczególnie, kiedy jest bardzo trudne bądź niemożliwe otrzymanie matrycy (placebo), w której nie znajdowałaby się substancja oznaczana, np. w przypadku próbek klinicznych i środowiskowych. Szczególną cecha tej metody jest jej wysoka "odporność" na sytuację niepełnego rozdzielenia analitu oraz gdy pik substancji oznaczanej nie jest rozdzielony do linii podstawowej od innych substancji, których piki są jednak znacznie mniejsze w stosunku do substancji oznaczanej Z kolei metodę prostej normalizacji, stosuje się, gdy wykorzystywany jest detektor refraktometryczny lub detektor światła rozproszonego. Detektory te wykazują zbliżoną odpowiedź dla różnych substancji o zbliżonej strukturze i masie cząsteczkowej. Obszerny opis metod ilościowych przedstawiono w [*] do obligatoryjnego zapoznania się przed przystąpieniem do ćwiczeń laboratoryjnych. 3.5. Zagadnienia ekonomicznego postępowania w skali preparatywnej i procesowej - Regeneracja aktywności sorpcyjnej kolumny i recyrkulacja eluentu W preparatywnej chromatografii cieczowej, z uwagi na rozdzielanie mieszanin rzeczywistych o bardzo różnym składzie, gdy często występują substancje które trwale dezaktywują powierzchnię sorpcyjną fazy stacjonarnej, po kilku, a nawet w kolejnej operacji rozdzielania, zaczyna obserwować się spadek rozdzielczości kolumny. Wówczas, w zależności od konkretnego zadania rozdzielczego przyjmuje się dotychczas dwa główne podejścia: a. przywrócenie zadowalającej aktywności sorpcyjnej wypełnienia poprzez zastosowanie podczas każdej operacji rozdzielania eluentu o wyższej sile elucyjnej (wymycie zanieczyszczeń mocnym eluentem) i dokonanie ponownej reaktywacji aktywności sorpcyjnej powierzchni wypełnienia za pomocą eluentu o niskiej sile elucyjnej, b. cykliczna wymiana sorbentu, co określoną liczbę rozdzielań stosowana, gdy następuje trwała dezaktywacja powierzchni sorpcyjnej, lub gdy rozwiązanie a) okazuje się być rozwiązaniem mniej uzasadnionym ekonomicznie 14

Alternatywnie do powyższych, stosowanych w praktyce sposobów postępowania, istnieje również możliwość zastosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie (ang. backflush = BF). Postępowanie polega na wprowadzeniu do układu chromatograficznego dodatkowego zaworu dwu położeniowego w jednym położeniu eluent jest wprowadzany do kolumny od strony A a odbierany od strony B, a drugim położeniu na odwrót. Z termodynamicznego punktu widzenia, substancje wprowadzone do kolumny, po czasie eluowania t przebyły pewne drogi i w przypadku odwrócenia przepływu, po identycznym czasie t powinny opuścić kolumnę w postaci jednego piku. Wyjątek stanowi przypadek na tyle silnej sorpcji, a w szczególności chemisorpcji, gdy substancja jest trwale związana z fazą stacjonarną i nie ma możliwości jej usunięcia z zastosowaniem przypływu zwrotnego. Takie składniki powinny zostać usunięte z wsadu do rozdzielania przed wprowadzeniem go do kolumny rozdzielczej! Oprócz zalety, jaką jest możliwość usunięcia w przepływie zwrotnym substancji obecnych w kolumnie po elucji frakcji będącej celem preparatywnego otrzymywania, drugim niezmiernie ważnym aspektem jest ciągle stała aktywność sorpcyjna kolumny, taka sam, jaka miała miejsce na początku rozdzielania. Przepływ zwrotny spełnia powyższe zadania w przypadku elucji izokratycznej. Zapewnienie tej samej aktywności sorpcyjnej kolumny oraz zrównoważenie oddziaływań faza stacjonarna eluent pozwala na zachowanie jednakowej retencji substancji, co w przypadku zautomatyzowanych układów zbierania frakcji ma istotne znaczenie praktyczne. Zastosowanie przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie pozwala, więc, na zwiększenie żywotności kolumny w warunkach preparatywnych i procesowych, a przy tym ogranicza ilość eluentu zużywaną na przywrócenie aktywności sorpcyjnej kolumny do warunków początkowych przed kolejnym rozdzielaniem, gdy zanieczyszczenia pozostałe w kolumnie eluowane są z zastosowaniem tzw. elucji skokowej z zastosowaniem eluentu o bardzo wysokiej sile elucyjnej. Najważniejszym czynnikiem, decydującym o opłacalności stosowania PLC, jako techniki otrzymywania substancji, jest ilość (koszt) organicznych składników eluentu utraconych podczas wzbogacania oraz izolacji rozdzielanych i otrzymywanych substancji. Eluenty stosowane do rozdzielania, w skali preparatywnej są z reguły odzyskiwane praktycznie w 100 %-ach. W celu recyrkulacji zużytego eluentu w warunkach izokratycznych z reguły wystarcza przedestylowanie rozpuszczalnika, co pozwala na usunięcie nielotnych zanieczyszczeń. Dlatego celowe jest stosowanie elucji izokratycznej w PLC, tak dalece, jak to możliwe. 15

W przypadku konieczności stosowania elucji gradientowej, a jest to często niezbędne w przypadku rozdzielania i otrzymywania peptydów i białek z zastosowaniem PLC, istnieje konieczność zastosowania bardziej sprawnego układu rozdzielczego dla rozdzielania i odzysku składników eluentu w postaci czystej. Stosuje się wówczas rektyfikację okresową lub ciągłą W celu poznania zasad prowadzenia, odparowania próżniowego, krystalizacji, liofilizacji, ekstrakcji ciecz ciecz destylacji oraz rektyfikacji zaleca się Studentom zapoznanie z pozycjami [****]. 4. Wykonanie ćwiczenia - Wykonanie rozdzielania serwatki w skali preparatywnej w celu zebrania frakcji α- laktoalbuminy i/albo laktozy w układzie chromatograficznym zaproponowanym przez Studentów - Wykonanie kalibracji metody oznaczeń ilościowych wybranej przez grupę odrabiającą ćwiczenie - Oznaczenie czystości zebranych frakcji - Odparowywanie eluentu z zastosowaniem rotacyjnej wyparki próżniowej. 5. Wymagania do sprawdzianu Szczegółowy wykaz zagadnień podano w harmonogramie ćwiczeń laboratoryjnych. 1. Zakres wiadomości objęty niniejszą instrukcją 2. Rozdział 11,13 [*] 3. Podstawy następujących operacji: odparowanie próżniowe, destylacja i rektyfikacja (odzysk organicznych składników eluentu), ekstrakcja ciecz ciecz (przeniesienie składników hydrofobowych z hydrofilowego eluatu do lotnej cieczy organicznej, dotyczy lipidów, średnio polarnych metabolitów roślinnych oraz hydrofobowych białek i peptydów), liofilizacja (otrzymanie mikrokrystalicznej postaci białka z roztworu w wodzie). Bardziej szczegółowe informacje w specjalistycznej literaturze inżynierii bio-procesowej (np. poz. 12-14 literatury uzupełniającej) oraz w instrukcjach z przedmiotu Techniki Rozdzielania (dla Technologii Chemicznej) [***] 4. Przykłady zastosowań wymienione w [****] 16

6. Literatura Literatura podstawowa * M. Kamiński (ed.) Chromatografia Cieczowa, CEEAM, Gdańsk, 2004; ** M. Kamiński, Problemy stosowania kolumnowej chromatografii cieczowej, jako metody (techniki) otrzymywania substancji, rozprawa habilitacyjna, Gdańsk 1991; *** A) M. Trznadel, M. Kamiński, Instrukcja do ćwiczenia 3A Destylacja / Rektyfikacja dla Technologii Chemicznej II rok, dostępna on-line na stronie domowej katedry: http://www.pg.gda.pl/chem/katedry/inzynieria/images/data/mk/dydaktyka/tr2/3a.pdf B) M. Trznadel, M. Kamiński, Instrukcja do ćwiczenia 2B Ekstrakcja ciecz-ciecz dla Technologii Chemicznej II rok, dostępna on-line na stronie domowej katedry: http://www.pg.gda.pl/chem/katedry/inzynieria/images/data/mk/dydaktyka/tr4/cwiczenie2 B.pdf C) A. Zygler, M. Janicka, Ł. Heda, M. Kamiński, Instrukcja do ćwiczenia 2A Techniki wzbogacenia i prekoncetracji. Membrany stałe i odparowanie próżniowe dla Technologii Chemicznej II rok, dostępna on-line na stronie domowej katedry: http://www.pg.gda.pl/chem/katedry/inzynieria/images/data/mk/dydaktyka/tr2/cw2.pdf D) A. Zygler, M. Janicka, M. Kamiński, Instrukcja do ćwiczenia 5B Odparowanie próżniowe rozpuszczalnika/ eluentu, krystalizacja w warunkach różnej temperatury dla Technologii Chemicznej II rok, dostępna on-line na stronie domowej katedry: http://www.pg.gda.pl/chem/katedry/inzynieria/images/data/mk/dydaktyka/tr4/cwiczenie5 B.pdf E) Zygler, M. Janicka, M. Kamiński, Instrukcja do ćwiczenia 5C Suszenie w warunkach ciśnienia atmosferycznego / suszenie próżniowe / liofilizacja dla Technologii Chemicznej II rok, dostępna on-line na stronie domowej katedry: http://www.pg.gda.pl/chem/katedry/inzynieria/images/data/mk/dydaktyka/tr4/cwiczenie5 C.pdf` **** B. K. Głód (ed.), Postępy chromatografii i innych technik i technologii rozdzielania, Wyd. Akademii Podlaskiej, Siedlce, 2010 Strony 57-70 (A. Bylina, M. Kamiński, Preparatywna chromatografia cieczowa, podstawowe zasady efektywnego stosowania, elementy preparatyki), 17

Literatura dodatkowa 1. R. Ven (ed), Encyklopedia of Separation Technology, vol. 1 i 2, J. Wiley, 19997; 2. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, WNT-W-wa, wyd. 2000 lub 2005; 3. K. Hostettman, A. Morston, Preparative Chromatography Techniques Applications, Springer Verlag, 1998; 4. J. Cazes (ed) Encyclopedia of Chromatography, Marcel Dekker, New York, 2001., 5. A.S. Grandison, M.J. Lewis, Separation processes in the food and biotechnology industries. Principles and applications, Woodhead Publishing Limitted, Cambridge, England, 1996., 6. M. Aguilar, J.L.v Cortina, Solvent extraction and liquid membranes, CRC Press, London, 2008., 7. M. Berek, M. Dressler, M. Kubin, K. Marcinka, Chromatografia żelowa, PWN, Warszawa, 1989; 8. A.S. Grandison (ed), M.J. Lewis (ed), Separation processes in the Food and Biotechnology Industries Principlea and Applications, Woodhead Publ. Ltd, Cambridge England; 9. O. Mikes, HPLC of Biopolimers and Biooligomers, Elsevier, Amsterdam, 1989; 10. J. Weiss, Handbook of ion chromatography vol 1,2, Wiley-VCH 2004; 11. R. Rautenbach, Procesy membranowe, WNT-W-wa, wyd. 1996; 12. M. Serwiński, Operacje jednostkowe w inżynierii chemicznej, WNT, Warszawa, dowolne wydanie, (podręcznik zawiera zasady ogólne i najważniejsze pojęcia dotyczące inżynierii technik rozdzielania). 13. A. Selecki., L. Gradoń Podstawowe procesy przemysłu chemicznego, WNT Wa-wa 1985.; 14. A. Selecki, Inżynieria chemiczna - Rozdzielanie mieszanin - Metody niekonwencjonalne, WNT Wa-wa, 1972; 15. A. Selecki, R. Gawroński, Inżynieria chemiczna. Podstawy projektowania wybranych procesów rozdzielania mieszanin, WNT 1992. 16. J. Bandrowski, L. Troniewski, Destylacja i rektyfikacja, Skrypt Politechniki Śląskiej. Gliwice 1996., 18

7. Sprawozdanie Każda grupa przygotowuje odrębne sprawozdanie w formie odręcznego czytelnego manuskryptu, z odpowiednimi obliczeniami i wykresami oraz naszkicowanymi odręcznie i poprawnie opisanymi chromatogramami. Każde z pięciu ćwiczeń stanowi odrębną część sprawozdania końcowego i powinno zawierać następujące części oraz informacje: - Wprowadzenie - opis operacji przygotowawczych oraz separacyjnych i wykorzystywane zjawiska fizykochemiczne mające główny / drugorzędny wpływ na osiągane rezultaty rozdzielania, opis optymalnych warunków i ograniczeń utrudniających / uniemożliwiających osiągnięcie optymalnych warunków, opinię dotyczącą zalet i wad uwzględnionych operacji i procesów separacyjnych, a także technik detekcji oraz metod oznaczania; - Cel ćwiczenia i odpowiedniej jego części; - Część doświadczalna - opis i warunki eksperymentów wykonanych podczas ćwiczenia, z podziałem, jak w publikacji naukowej, na: Materiały; Aparatura i wyposażenie; Metodyka i sposób opracowania wyników Ta część sprawozdania powinna zawierać opis sposobu wykonania obliczeń poszczególnych parametrów, przykład wykonania obleczeń, przeliczenia jednostek fizycznych oraz przykłady otrzymanych wartości obliczonych parametrów, po jednym przykładzie dla obliczania konkretnej wielkości. - Wyniki i dyskusja, zestawienie wyników w formie rysunków, tabel, fotografii, danych uzyskanych w rezultacie wykonanych obliczeń itp., wraz z opisem co one przedstawiają i jakie wnioski z nich wynikają; Należy stosować tabelaryczne przedstawianie danych i warunków oraz zamieszczać schematy budowy stanowisk laboratoryjnych, aparatury, kolumn i sprzętu pomocniczego z odpowiednimi opisami w podpisie pod rysunkami - w sposób jak najkrótszy, jednak na tyle jednoznaczny, aby można było na tej podstawie zamieszczonych danych i informacji powtórzyć eksperymenty bez konsultowania się z 19

wykonawcą, tzn., konieczne jest podanie nazw modułów aparatury i sprzętu, typu, modelu, stopnia czystości odczynników, producenta, stężeń itp. danych. - Wnioski końcowe - zestawienie wniosków wynikających z całej serii pięciu ćwiczeń, jednak bez powtarzania wniosków zamieszczonych w poszczególnych częściach sprawozdania, natomiast kilka wniosków znajdujących się w różnych częściach sprawozdania może być podstawą do sformułowania odpowiedniego wniosku końcowego (w tym sensie powtórzenie jest dopuszczalne); - Spis literatury - proszę zamieścić w sposób zgodny z zasadami cytowania literatury stosowanymi w publikacjach naukowych tylko te pozycje, z których rzeczywiście korzystali autorzy sprawozdania. Nad przygotowaniem sprawozdania powinna pracować cała grupa wykonująca ćwiczenie. Na stronie czołowej powinny zostać wpisane czytelnie nazwiska osób wykonujących ćwiczenie oraz sprawozdanie wraz z podpisami. Podpis oznacza, że określona osoba brała udział w pracy nad przygotowaniem sprawozdania i współodpowiada za jego treść i zamieszczone wnioski. 20