RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 341528 (22) Data zgłoszenia: 05.12.1997 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 05.12.1997, PCT/US97/23032 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 17.06.1999, WO99/29340, PCT Gazette nr 24/99 (11) 188925 (13) B1 (51) IntCl7 A61K 39/00 A61K 39/02 A61K 39/06 C12P 21/06 C12N 15/00 (54) Szczepionka przeciwko brucelozie, osłabiona lub awirulentna odmiana szczepu RB51 B. abortus, zastosowanie szczepionki, sposób wytwarzania szczepionki (43) Zgłoszenie ogłoszono: 23.04.2001 BUP 08/01 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.05.2005 WUP 05/05 (73) Uprawniony z patentu: VIRG INIA TECH INTELLECTUAL PROPERTIES, INC., Blacksburg, US REGENTS O F TH E U N IV E R S ITY OF CALIFORNIA, THE U N IVERSITY OF CALIFORNIA SAN DIEGO, La Jolla. US (72) Twórcy wynalazku: Stephen M. Boyle. Blacksburg, US Silvio Cravero, Moron, AR Lynette Corbeil, San Diego, US Gerhardt G Schurig, Blacksburg, US Nammalwar Spirnaganathan, Blacksburg, US Ramesh Vem ulapal i, Blacksburg, US (74) Pełnomocnik: Kossowska Janina, PATPO L Sp z o.o PL 188925 B1 (5 7 ) 1. Szczepionka przeciwko brucelozie, znamienna tym, że obejmuje osłabiony lub awirulentny patogen wyselekcjonowany z grupy składającej się z B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, B. neotomae oraz B. canis, w której osłabiony lub awirulentny patogen nadprodukuje co najmniej jeden antygen homologiczny kodowany przez co najmniej jeden gen z tego patogenu, oraz w której co najmniej jeden antygen jest zdolny do indukcji ochronnej odpowiedzi odpornościowej w kręgowcu przeciwko brucelozie. 8. Osłabiona lub awirulentna odmiana szczepu RB51 B. abortus nadprodukująca co najmniej jeden antygen homologiczny zdolny do stymulowania odporności ochronnej przeciwko brucelozie, przy czym ten antygen homologiczny jest kodowany przez co najmniej jeden gen wyselekcjonowany z grupy składającej się z genu Cu/Zn, genu GroES oraz genu GroEL. 9. Zastosowanie szczepionki określonej w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia i profilaktyki kręgowca przeciwko brucelozie. 15. Sposób wytwarzania szczepionki określonej w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje etapy: a) izolowania kwasu dezoksyrybonukleinowego z mikroorganizmu patogennego; b) identyfikacji w kwasie dezoksyrybonukleinowym co najmniej jednego genu kodującego co najmniej jeden antygen, który zdolny jest do stymulacji odporności ochronnej przeciwko mikroorganizmowi patogennemu; c) wprowadzenia co najmniej jednego genu do wielokopiowego plazmidu zdolnego do replikacji i ekspresji w mikroorganizmie patogennym; d) transformacji odmiany osłabionego lub awirulentnego mikroorganizmu patogennego tym plazmidem; e) wytwarzania szczepionki z uzyskanego mikroorganizmu.
2 188 925 Szczepionka przeciwko brucelozie, osłabiona lub awirulentna odmiana szczepu RB51 B. abortus, zastosowanie szczepionki, sposób wytwarzania szczepionki Zastrzeżenia patentowe 1. Szczepionka przeciwko brucelozie, znamienna tym, że obejmuje osłabiony lub awirulentny patogen wyselekcjonowany z grupy składającej się z B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, B. neotomae oraz B. canis, w której osłabiony lub awirulentny patogen nadprodukuje co najmniej jeden antygen homologiczny kodowany przez co najmniej jeden gen z tego patogenu, oraz w której co najmniej jeden antygen jest zdolny do indukcji ochronnej odpowiedzi odpornościowej w kręgowcu przeciwko brucelozie. 2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że jako patogen Brucella zawiera szczep RB51 B. abortus. 3. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że patogen jako co najmniej jeden gen zawiera gen Cu/Zn SOD. 4. Szczepionka według zastrz. 3, znamienna tym, że gen Cu/Zn pochodzi z biblioteki genomowej szczepu 2308 B. abortus na wektorze puc19. 5. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że jako co najmniej jeden gen patogen zawiera jeden lub obydwa geny GrosES i GroEL. 6. Szczepionka według zastrz. 5, znamienna tym, że gen GroES i gen GroEL pochodzą z biblioteki genomowej szczepu 2308 B. abortus na wektorze puc19. 7. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że jest przeznaczona dla bydła. 8. Osłabiona lub awirulentna odmiana szczepu RB 51 B. abortus nadprodukująca co najmniej jeden antygen homologiczny zdolny do stymulowania odporności ochronnej przeciwko brucelozie, przy czym ten antygen homologiczny jest kodowany przez co najmniej jeden gen wyselekcjonowany z grupy składającej się z genu Cu/Zn, genu GroES oraz genu GroEL. 9. Zastosowanie szczepionki określonej w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia i profilaktyki kręgowca przeciwko brucelozie. 10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że osłabiony lub awirulentny patogen obecny w szczepionce dodatkowo wytwarza antygen heterologiczny. 11. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że szczepionka zawiera jako patogen szczep RB51 B. abortus, w którym co najmniej jeden gen jest genem Cu/Zn SOD. 12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że gen Cu/Zn pochodzi z biblioteki genomowej szczepu 2308 B. abortus na wektorze puc19. 13. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że szczepionka zawiera jako patogen szczep RB51 B. abortus, w którym co najmniej jeden gen jest jednym lub obydwoma genami GrosES oraz GroEL. 14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że gen GroES oraz gen GroEL pochodzą z biblioteki genomowej szczepu 2308 B. abortus na wektorze puc19. 15. Sposób wytwarzania szczepionki określonej w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje etapy: a) izolowania kwasu dezoksyrybonukleinowego z mikroorganizmu patogennego; b) identyfikacji w kwasie dezoksyrybonukleinowym co najmniej jednego genu kodującego co najmniej jeden antygen, który zdolny jest do stymulacji odporności ochronnej przeciwko mikroorganizmowi patogennemu; c) wprowadzenia co najmniej jednego genu do wielokopiowego plazmidu zdolnego do replikacji i ekspresji w mikroorganizmie patogennym; d) transformacji odmiany osłabionego lub awirulentnego mikroorganizmu patogennego tym plazmidem; e) wytwarzania szczepionki z uzyskanego mikroorganizmu. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że osłabiona lub awirulentna odmiana mikroorganizmu patogennego dodatkowo wytwarza jeden lub więcej antygenów heterologicznych.
188 925 3 17. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że mikroorganizm patogenny jest szczepem RB51 B. abortus. 18. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako co najmniej jeden gen mikroorganizm zawiera gen Cu/Zn SOD. 19. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako co najmniej jeden gen mikroorganizm zawiera jeden lub obydwa geny GrosES i GroEL. * * * Przedmiotem wynalazku jest szczepionka przeciwko brucelozie, osłabiona lub awirulentna odmiana szczepu RB51 B. abortus, zastosowanie szczepionki, sposób wytwarzania szczepionki. Szczepionka pochodzi z osłabionych lub awirulentnych wersji patogenu i wykazuje nadekspresję jednego lub więcej genów z patogenu dostarczając tym samym silniejszej odporności od indukowanej przez szczepionkę tego samego patogenu bez nadekspresji genu. Szczepionki stosowane są dla ochrony przed chorobami wywoływanymi patogenami. Patogeny te są organizmami mikrobiologicznymi, takimi jak bakterie i wirusy, które mają wpływ na zwierzęta w tym również na ludzi. Szczepionki pochodzą głównie z patogenów i są produkowane i podawane w postaci: a) osłabionej lub awirulentnej odmiany patogenu; b) zabitego patogenu; c) wyekstrahowanych antygenów ochronnych lub mieszanin antygenów z patogena (antygeny homologiczne); lub d) mikroorganizmu wytwarzającego jeden lub więcej antygenów ochronnych, kodowanych przez sklonowane geny pochodzące z patogenu mikrobiologicznego różniącego się od szczepu szczepionki (heterologiczne antygeny). Szczepionki, zarówno bakteryjne jak wirusowe, konstruuje się z mikroorganizmów wytwarzających jeden lub więcej antygenów ochronnych, jak opisali K. Jones i M. Sheppard w Designer Vaccines, CRC Press (1997). Szczepionki mają na ceiu wytwarzanie odpowiedzi odpornościowej przez biorcę, która składa się z co najmniej jednej odpowiedzi odpornościowej, w której uczestniczy przeciwciało lub limfocyt T i tym samym zapobiega dalszej infekcji przez patogen lub walczy z bieżącą infekcją patogenną. W szczególności szczepionki przeciwko fakultatywnym patogenom wewnątrzkomórkowym, tym rozwijającym się wewnątrz komórek zainfekowanego gospodarza, muszą indukować silną i odpowiednią komórkową odpowiedź odpornościową. Dla kontrastu, szczepionki przeciwko obligatoryjnym zewnątrzkomórkowym patogenom muszą indukować odpowiednią odpowiedź odpornościową, w której pośredniczy przeciwciało. Często, bez względu na patogen odpowiednia kombinacja odpowiedzi odpornościowej z pośrednictwem przeciwciała i komórki daje wystarczającą ochronę lub złagodzenie infekcji. W ceiu osiągnięcia ochrony i złagodzenia infekcji szczepionki mogą wytwarzać jeden lub więcej antygenów homologicznych, antygenów heterologicznych lub kombinację ich obu. Szczepionki można podawać kręgowcom zarówno dla zapobiegania jak i leczenia infekcji wywołanej patogenami. Zatem, szczepionki są często podawane dla zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby wywołanej patogenem. W szczególności, zwierzęta stadne, jak krowy, kozy, owce i świnie są często szczepione celem zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby wśród członków stada. Dalej, ze względu na to, że pewne choroby mogą przenosić się pomiędzy różnymi kręgowcami, w tym pomiędzy różnymi zwierzętami oraz pomiędzy zwierzętami i ludźmi, szczepionki są stosowane do zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby pomiędzy różnymi gatunkami, zazwyczaj poprzez podawanie ich zainfekowanym zwierzętom oraz innym niezainfekowanym zwierzętom z bezpośredniego sąsiedztwa. Jednakże w celach profilaktycznych można także szczepić inne zwierzęta z tego terenu, które z mniejszym prawdopodobieństwem mogły nabawić się choroby. Przykładowo, zainfekowaną krowę i jej jeszcze niezainfekowane stado można szczepić w ceiu leczenia choroby i zapobieganiu jej dalszemu rozprzestrzenianiu. W celach profilaktycznych można również szczepić inne zwie-
4 188 925 rzęta, jak sąsiadujące krowy, owce lub ludzi, które mogłyby nabawić się choroby od zainfekowanej krowy. Stwierdzono, że szczepionki pochodzące z osłabionych lub awirulentnych odmian patogenu są bardziej skuteczne w zapobieganiu i zwalczaniu choroby wywołanej przez ten patogen. W szczególności wiadomo, że takie osłabione lub awirulentne patogeny można modyfikować celem wytworzenia przez ekspresję heterologicznych antygenów (antygenów, które pochodzą z patogenu innego gatunku). W ceiu wytworzenia antygenów heterologicznych w żądanym osłabionym lub awirulentnym patogenie, gen kodujący antygen zdolny do dostarczenia ochrony przed patogenem jest identyfikowany w kwasie dezoksyrybonukleinowym gatunku heterologicznego. Żądany gen jest izolowany, a następnie wprowadzony do plazmidu zdolnego do replikacji i ekspresji w osłabionym lub awirulentnym patogenie. Plazmid jest następnie wprowadzany do osłabionego lub awirulentnego patogenu i umożliwia ekspresję heterologicznego antygenu po podaniu zwierzęciu kręgowemu. Przykładem takiej ekspresji antygenu heterologicznego jest bakteiyjna szczepionka z Salmonella, która wytwarza białko spaa ze Streptococcus. Patrz patent USA nr 4888170. Szczepionka ta obejmuje awirulentną pochodną mikroorganizmu patogennego z rodzaju Salmonella, w której z kolei ekspresji ulega zrekombinowany gen pochodzący z patogenu z gatunku Streptococcus mutans, w wyniku czego produkowany jest antygen zdolny do indukowania odpowiedzi odpornościowej przeciw patogenowi u zwierzęcia kręgowego. Dalszym przykładem ekspresji heterologicznej są szczepionki Vibrio cholera. Szereg żywych, osłabionych szczepów Vibrio cholera wytworzono w ceiu szczepienia ludzi przeciwko cholerze. Patrz: Kaper, J.B. i wsp., New and improved vaccines against cholera w New Generation Vaccines (wyd. MM Levin i wsp.) Marcel Deker, Inc., NY, 1997. Niektóre z tych szczepów nadprodukują antygeny heterologiczne. Patrz: Butterton, J.R. i S.B. Calderwood, Attenuated Vibrio cholera as a live vector for expression o f foreign antigens in New Generation Vaccines (wyd. MM Levin i wsp.) Marcel Deker, Inc., NY, 1997. Odporność indukowana osłabionymi szczepami szczepionek jest wynikiem indukcji przeciwciał, które m ają aktywności przeciwbakteryjne i/lub antytoksyczne. Niektóre szczepy osłabiano poprzez usuwanie szeregu genów kodujących komponenty toksygenne, w tym podjednostkę A toksyny cholery, kodowaną przez gen ctxa. Jednakże, po to by szczep szczepionki cholery był w pełni ochronny, konieczne jest, aby gen ctxb, kodujący podjednostkę B (z którą wiąże się podjednostka A), ulegał ekspresji, co pozwala na wytworzenie przeciwciał neutralizujących toksynę cholery. Gen ctxb nadwyrażano w Vibrio cholera w ceiu wytworzenia dużej ilości antygenu dla toksyny B cholery (CTB). Nadprodukowany antygen CTB zbierano, oczyszczano i stosowano jako szczepionkę podjednostkową, która jest ekstrahowanym antygenem CTB. Patrz: Lebens M. i wsp., 1993, Biotechnology (NY) Dec; 11:1574-1578. Jednakże pomimo, że nadprodukowany antygen sam jest stosowany jako szczepionka, to osłabiony lub awirulentny patogen z Vibrio cholera, który nadwyraża gen ctxb lub jakikolwiek inny gen homologiczny nie był stosowany jako żywa szczepionka. Innym przykładem ekspresji heterologicznej jest ekspresja zachodząca w szczepionkach Mycobacterium sp., stosowanych przy zapobieganiu gruźlicy u ludzi. Białko GroEL z Mycobacterium tuberculosis indukuje odporność ochronną, kiedy gen GroEL ulega ekspresji po transfekcji do makrofagów (Silva, C.L. i Lowrie, D.B., 1994, Immunology 84:244-248), co wskazuje na to, że białko GroEL jest antygenem ochronnym, jeśli jest prezentowane limfocytom T przez ten typ komórek prezentujących antygen (APC). Szczepionki z nagiego DNA wykorzystujące geny Mycobacterium, kodujące różnorodne antygeny (hsp70, 85kDa, 65kDa, 36kDa, 6 kda) są także zdolne do indukowania odporności ochronnej. Patrz: Lowrie, D.B. i wsp., 1997, Vaccine 15:834-838; Tascon, E. i wsp., 1996, Nat. Med. 2:888-892 oraz Lozes, E. i wsp., 1997, Vaccine 15:880-833. Uważa się, że szczepionki z nagiego DNA pracują ponieważ transfekują one APC (Chattergon, M i wsp. 1997, FASEB J. 11:753-763), które z kolei prezentują antygen odpowiednio limfocytom T, indukując tym samym komórkową odporność ochronną. M. bovis BCG, żywy, osłabiony szczep Mycobacterium jest stosowany do indukcji odporności ochronnej przeciw infekcjom M.tuberculosis u ludzi. Fine, PM 1988, Br. Med. Buli. 44-91.
188 925 5 Szczepionki antygenowe wytworzone przeciwko brucelozie stanowią przykłady ekspresji antygenu homologicznego, gdzie antygen pochodzi z tego samego gatunku co osłabiony patogen. Bruceloza jest zakaźną chorobą bakteryjną, która może przenosić się ze zwierząt na ludzi. Wywoływana jest przez dowolny gatunek różnorodnych, patogennych bakterii tlenowych z rodzaju Brucella. U zwierząt bruceloza wywołuje poronienia i niepłodność. U ludzi wywołuje gorączkę, złe samopoczucie i ból głowy. Szczegółowo zbadano tę chorobę i wynikiem tego stało się wytworzenie szeregu szczepionek. Wiadomo, że istniejące szczepy szczepionkowe Brucella, takie jak szczep 19 i RB51 B. abortus oraz szczep REVI B. melitensis mogą chronić przed gatunkami Brucella, z których pochodzą oraz krzyżowo chronić przed infekcją przez inne gatunki, takie jak B. abortus, B. melitensis, B. ovis, B. suis, B. canis i B. neotomae. Patrz Winter, A.J. i wsp., 1996, Am. J. Vet. Res., 57:677; P. Nicoletti w Animal Brucellosis, CRC Press (1990), str. 284-296; J.M. Blasco w Animal Brucellosis, CRC Press (1990), str. 368-370 oraz G.C. Alton w Animal Brucellosis, CRC Press (1990), str. 395-400. Nowe szczepy VTRM1 B. melitensis i VTRS1 B. suis także krzyżowo chronią przed różnymi gatunkami Brucella. Patrz: Winter, A.J. i wsp., Am. J. Vet. Res., 57:677. W przeszłości, jedną z najpowszechniej stosowanych szczepionek dla zapobiegania brucelozie bydlęcej był szczep 19 B. abortus, opisany przez P. Nicoletti w Animal Brucellosis, CRC Press (1990), str. 284-296. Ten szczególny szczep B. abortus nadawał odporności bydłu z zakresem ochrony od 65 do 75%, w zależności od wielu zmiennych, takich jak wiek szczepionego bydła, wielkość podawanej dawki, droga podawania oraz rozpowszechnienie brucelozy w szczepionym stadzie. Szczep RB51 B. abortus, nowa szczepionka z żywej osłabionej Brucella (oznaczona jako RB-51jest stabilną szczepionką zatwierdzoną do użytku w USA. Patrz: Schurig, G.G. i wsp., 1991, Vet. Microbiol. 26:359 oraz Colby, L., 1997, M.Sc Thesis, Virginia Tech, Blacksburg, Va. Osłabienie szczepu RB51 wykazano poprzez badania prowadzone na myszach, kozach i bydle. Patrz: Schurig, G.G. i wsp., 1991, Vet. Microbiol. 28:171; Palmer, R.M. i wsp., 1997, Am. J. Vet Res. 58:472; Roop, R.M. i wsp., 1995, Res. Vet. Science, 51:359 oraz Zambrano, A.J. i wsp., 1995, Archivos de Medicina Veterinaria XXVIII, No. extraordinario: 119-121. W porównaniu z ochroną dostarczaną przez szczep 19, szczep RB51 wpojedynczym szczepieniu daje podobną ochronę u bydła. Patrz: Cheville, N:F. i wsp., 1993, Amer. J. Vet Research 53:1881 oraz Cheville, N.F. i wsp., 1996, Amer. J. Vet Research, 57:1153. Ponadto, podawanie doustne szczepu RB 51 u myszy i bydła nadawało odporność ochronną. Patrz Stevens, M.G. i wsp., 1996, Infect. Immun. 64:534. W szczególności, model mysi wykazuje, że odporność ochronna na brucelozę wywołana szczepem RB51 odbywa się wyłącznie za pośrednictwem limfocytów T, ponieważ bierny transfer zaindukowanych przez RB 51 przeciwciał nie chroni przed chorobą, podczas gdy adoptywny transfer limfocytów T chroni. Patrz: Bagchi, T., 1990, M.Sc Thesis, Virginia Tech, Blacksburg, Va; Jimenez debagues, M.P. i wsp., 1994, Infect. Immun. 62:4990. Uważa się, że szczepienie RB-51 nadaje ochronę osobnikowi poprzez indukcję wytwarzania interferonu gamma, zdolnego do aktywowania makrofagów i swoistych limfocytów T cytotoksycznych, które są zdolne do zabicia makrofagów zainfekowanych Brucella. Chociaż RB-51, pochodząca ze szczepu 2308 B. abortus jest obecnie najlepszą dla zwierząt szczepionką przeciw brucelozie, ciągle nie posiada ona 1 0 0 % skuteczności. Żadna z obecnych szczepionek przeciw brucelozie nie ma całkowitej skuteczności. Zatem, kontynuowane są badania na obiecujących szczepach jak szczep RB51 B. abortus. Przykładowo, opisano ekspresję heterologicznych antygenów przez szczep RB51 B. abortus, S. Cravero i wsp., 1995, Proceedings 4 111 Intl. Vet. Immunol. Symposium, July, Davis, Ca., Abstract # 276 oraz Cravero i wsp., 1996, Conference of Research Workers in Animal Diseases, Nov., Chicago, Abstract # 150. Nadprodukcję antygenu homologicznego przez Brucella opisano jako narzędzie badawcze do komplementacji specyficznych mutantów delecyjnych przy badaniu białka HtrA w B. abortus (P.H. Elzer, Inf. Immun., 1994, 62:4131) oraz przy badaniu funkcji fizjologicznych jak omówione przez R. Wrigth w ustnej prezentacji podczas Brucella Research Conference, Nov. 9, 1997 w Chicago, 111.
6 188 925 Jednakże, nadprodukcję antygenów homologicznych z Brucella lub innych patogenów, z lub bez towarzyszącego powstawania w wyniku ekspresji antygenu heterologicznego, nie badano pod kątem zastosowania w szczepionkach. Nadprodukcji antygenów homologicznych używano wcześniej głównie jako narzędzia badawczego, jak opisano powyżej. Osłabiony lub awirulentny patogen zmodyfikowany do nadprodukcji antygenu homologicznego nie był używany jako żywa szczepionka. Jednakże stwierdziliśmy, że taka szczepionka, która jest osłabionym lub awirulentnym patogenem nadprodukującym jeden lub więcej antygenów homologicznych, jak tu opisano, będzie dostarczać większą ochronę przeciw chorobie patogennej niż szczepionki z osłabionych patogenów wytwarzających te same antygeny homologiczne na poziomach dzikiego typu. Zatem, wynalazek dotyczy szczepionki, sposobu wytwarzania szczepionki oraz jej zastosowania do wytwarzania leku do stosowania w profilaktyce i leczeniu chorób patogennych, przy czym szczepionka jest osłabionym lub awirulentnym patogenem nadprodukującym co najmniej jeden antygen homologiczny i tym samym dostarcza większej ochrony i leczenia choroby wywołanej nie osłabionym patogenem u osobnika, którym jest kręgowiec. Przedmiotem wynalazku jest szczepionka przeciwko brucelozie, która obejmuje osłabiony lub awirulentny patogen wyselekcjonowany z grupy składającej się z B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, B. neotomae oraz B. canis, w której osłabiony lub awirulentny patogen nadprodukuje co najmniej jeden antygen homologiczny kodowany przez co najmniej jeden gen z tego patogenu, oraz w której co najmniej jeden antygen jest zdolny do indukcji ochronnej odpowiedzi odpornościowej w kręgowcu przeciwko brucelozie. Korzystnie szczepionka jako patogen Brucella zawiera szczep RB51 B. abortus. Patogen jako co najmniej jeden gen zawiera gen Cu/Zn SOD, który korzystnie pochodzi z biblioteki genomowej szczepu 2308 B. abortus na wektorze puc19. Jako co najmniej jeden gen patogen może również zawierać może jeden lub obydwa geny GrosES i Gro- EL, korzystnie pochodzące z biblioteki genomowej szczepu 2308 B. abortus na wektorze puc19. Szczepionka jest głównie przeznaczona dla bydła. Szczepionka według wynalazku z nadprodukcją antygenu homologicznego jest wytwarzana sposobem według wynalazku na drodze inżynierii genetycznej żywych, osłabionych mikroorganizmów w procesie obejmującym etapy: a) izolowania kwasu dezoksyrybonukleinowego z mikroorganizmu patogennego; b) identyfikacji w kwasie dezoksyrybonukleinowym co najmniej jednego genu kodującego co najmniej jeden antygen, który zdolny jest do stymulacji odporności ochronnej przeciwko mikroorganizmowi patogennemu; c) wprowadzenia co najmniej jednego genu do wielokopiowego plazmidu zdolnego do replikacji i ekspresji w mikroorganizmie patogennym; d) transformacji odmiany osłabionego lub awirulentnego mikroorganizmu patogennego tym plazmidem; e) wytwarzania szczepionki z uzyskanego mikroorganizmu. Wytworzona szczepionka syntetyzuje antygen w wyniku transkrypcji i translacji genu położonego co najmniej w dwóch miejscach tzn. w genomie i w plazmidzie. W szczególności korzystnie, gdy plazmid jest typu wielokopiowego, tak że może wytwarzać większą ilość ochronnego antygenu niż z pojedynczej kopii genomowej. Powyższy sposób można stosować do wytwarzania szczepionek z nadprodukcją antygenu homologicznego dla wielu różnych chorób. Nadprodukcja antygenu zazwyczaj podnosi odpowiedź odpornościową związaną zarówno z limfocytami T jak i przeciwciałami, podnosząc tym samym znacząco poziom ochrony w osobniku. Ponieważ wzmocnione są oba typy odpowiedzi odpornościowej, atakowane są zarówno patogeny wewnątrzkomórkowe jak zewnątrzkomórkowe, a tym samym dostarczana jest większa ochrona przed patogenem. Szczepionka użyta w sposobie profilaktyki i leczenia może być pierwotnym szczepem szczepionkowym lub modyfikacją istniejącego szczepu szczepionkowego. Przykładowo, szczep RB 51 B. abortus można modyfikować dla uzyskania nadprodukcji antygenu homologicznego wytwarzając tym samym nowy szczep, którego można użyć w szczepionce do profilaktyki lub leczenia brucelozy, szczególnie u bydła. W szczególności now ą szczepionkę Brucella można wytwarzać poprzez: 1) wyselekcjonowanie genu kodującego ochronny antygen ze szczepu Brucella-,
188 925 7 2 ) wprowadzenie genu z patogenu do wiełokopiowego plazmidu zdolnego do replikacji i ekspresji w Brucella; oraz 3) wprowadzenie plazmidu do Brucella sposobem takim jak transformacja. W ten sposób można nadprodukować jeden lub więcej antygenów homologicznych. Dodatkowo, jeden lub więcej antygenów heterologicznych można wytwarzać w szczepionce metodami znanymi specjalistom. Poprzez wytworzenie jednego lub kilku antygenów homologicznych danego patogenu, stymulowana jest większa odpowiedź odpornościowa za pośrednictwem limfocytów T i/lub przeciwciał przeciwko patogenowi w kręgowcu, któremu podano szczepionkę wytworzoną z osłabionego lub awirulentnego patogenu, dostarczającą większej ochrony przed nieosłabionym patogenem. Dalszą ochronę można nadać poprzez dodatkową produkcję jednego lub kilku antygenów heterologicznych przez osłabiony lub awirulentny patogen, sposobami znanymi specjalistom. Wytwarzaną szczepionkę z nadprodukcją antygenu homologicznego można podawać w skutecznych dawkach dla umożliwienia profilaktyki i leczenia choroby wywołanej patogenem w żądanym organizmie kręgowca. Dawki, co znane jest specjalistom, powinny być dostosowane do każdego osobnika w oparciu o takie czynniki jak waga, wiek oraz czynniki środowiskowe. Skuteczna dawka może być podawana w skuteczny sposób w oparciu o typ zwierzęcia, któremu jest podawana, jego wiek i stan. Wynalazek obejmuje również zastosowanie szczepionki do wytwarzania leku do leczenia i profilaktyki kręgowca przeciwko brucelozie. Jak opisano powyżej zastosowanie w którym osłabiony lub awirulentny patogen obecny w szczepionce dodatkowo wytwarza antygen heterologiczny. W zakres wynalazku wchodzi też osłabiona lub awirulentna odmiana szczepu RB51 B. abortus nadprodukująca co najmniej jeden antygen homologiczny zdolny do stymulowania odporności ochronnej przeciwko brucelozie, przy czym ten antygen homologiczny jest kodowany przez co najmniej jeden gen wyselekcjonowany z grupy składającej się z genu Cu/Zn, genu GroES oraz genu GroEL. Załączone figury mają na ceiu wyjaśnienie i szczegółowe zilustrowanie opisanego tu wynalazku. W szczególności: Figura 1. stanowi diagram przedstawiający otrzymywanie antygenu homologicznego z gatunków Brucella i wprowadzenie antygenu do szczepionki szczepu gatunków Brucella', Figura 2. przedstawia konstrukcję zrekombinowanych plazmidów do nadprodukcji miedź/cynk SOD (A) i GroES i GroEL (B) w szczepie RB51 B. abortus; Figura 3. przedstawia oczyszczanie szczepu 2308 B. abobortus ze śledzion myszy szczepionych szczepem RB51 B. abortus, nadprodukujących miedź/cynk SOD lub GroES/EL; oraz Figura 4. przedstawia aktywność cytotoksyczną limfocytów przeciwko komórkom zainfekowanym Brucella z myszy szczepionych szczepem RB51 B. abortus nadprodukującym miedź/cynk SOD lub GroES/EL. Przykłady Przykład 1 Dwie OHAV skonstruowano poprzez nadprodukcję genu Cu/Zn SOD lub genów GroES i GroEL w szczepie RB51 B. abortus. Geny Cu7Zn SOD, GroES i GroEL otrzymano pierwotnie z genomowej biblioteki szczepu 2308 B. abortus na wektorze puc19. Jak przedstawiono na fig. 2 wstawki zawierające te geny wraz z ich własnymi promotorami wycinano z regionów wpba113 (SOD) i pba2131 (GroES i GroEL) i subklonowano wpbbrimcs, plazmid o szerokim zakresie gospodarza, który rutynowo jest stosowany w badaniach z Brucella. Otrzymane zrekombinowane plazmidy nazwano pbbsod i pbbgroses/el (fig. 2). Szczep RB51 B. abortus transformowano tymi plazmidami poprzez elektroporację. Brucella zawierające plazmidy selekcjonowano poprzez wysianie stransformowanych bakterii na szalkach z agarem sojowym (trypticase soya agar) zawierającym 30 ig/ml chloramfenikolu. Celem określenia nadekspresji sklonowanych genów kolonie oporne na antybiotyk hodowano pojedynczo w podłożu sojowym (trypticase soja broth), a ekstrakty bakteryjne stosowano jako antygeny w analizie typu immunoblot. Szczep RB51, zawierający pbbsod (RB51SOD) i pbbgroes/el
8 188 925 (RB51GroESL), nadprodukował odpowiednio Cu/Zn SOD i GroEL w porównaniu ze szczepem RB51 zawierającym sam pbbrim CS (RB51pBB). Badanie ochrony u myszy. Grupy po 8 myszy szczepiono poprzez podanie dootrzewnowo, 4 x 108 jednostek koloniotwórczych (cfu), każdego ze szczepów RB51SOD, BRB51GroESL, RB51pBB lub RB51 w 0,5 ml w wodnym roztworze. Jedną grupę myszy szczepiono 0,5 ml wodnego roztworu soli, jako kontrolę. Po 6 tygodniach, 5 myszom z każdej grupy podawano dootrzewnowo 2,5 x 104 cfu wirulentnego szczepu 2308. Pozostałe trzy myszy w każdej grupie stosowano do scharakteryzowania odpowiedzi odpornościowych. Dwa tygodnie po podaniu wirulentnego szczepu 2308 myszy uśmiercano i określano cfu szczepu 2308 na śledzionę. Myszy immunizowane szczepem RB51SOD miały znacząco niższą liczbę bakterii w porównaniu z tymi immunizowanymi szczepem RB51. W myszach immunizowanych szczepem RB51GroESL liczba obserwowanych bakterii była poniżej granicy wykrywalności metody ( < 2 0 cfu/śledzionę). Charakterystyka odpowiedzi odpornościowych. Po 6 tygodniach po szczepieniu, pobierano surowicę od 3 myszy z każdej grupy do analizy odpowiedzi humoralnej przeciwciał. Myszy te uśmiercano, a limfocyty zebrane z ich śledzion stosowano do badania komórkowej odpowiedzi odpornościowej. Jak pokazano na fig. 3 myszy szczepione szczepem RB 51 wytworzyły przeciwciała przeciwko GroEL, lecz nie wytworzyły przeciwciał przeciwko Cu/Zn SOD. Dla kontrastu, myszy szczepione szczepem RB51SOD wytworzyły silną odpowiedź przeciwciał przeciwko Cu/Zn SOD, a myszy szczepione szczepem RBŚlGroESL wytworzyły silniejszą odpowiedź przeciwciał przeciwko białku GroEL (fig. 3), niż myszy szczepione szczepem RB51. Wyniki te wskazują na wzmocnioną odpowiedź przeciwciał dzięki OHAV. Wywołaną kom órkow ą odpowiedź odpornościową charakteryzowano poprzez określenie aktywności cytotoksycznej limfocytów w stosunku do komórek zainfekowanych Bruce lia. Swoista aktywność śledzionowych limfocytów była wzmocniona, in vitro, przez wspólne hodowanie z traktowanymi mitomycyną C makrofagami zainfekowanymi Brucella jako komórkami stymulatorowymi. Test na cytotoksyczność prowadzono przy użyciu wzmocnionych limfocytów jako komórek efektorowych(e) a makro fagów zainfekowanych Brucella jako komórek docelowych (T). W oznaczeniu komórki E i T mieszano w dwóch różnych stosunkach, 10:1 i 5:1. Procent swoistej lizy komórek docelowych obliczano dla każdego stosunku E:T przy użyciu standardowych metod (fig. 4). Limfocyty z myszy szczepionych RB51SOD lub RB51 GroESL wykazywały wzmocnioną aktywność cytotoksyczną względem myszy szczepionych wodnym roztworem soli lub szczepem RB51. Ta podniesiona cytotoksyczną aktywność limfocytów (wykazana na podstawie wzrostu % swoistej lizy) bezpośrednio koreluje z obserwowaną wzmocnioną ochroną myszy przeciwko działaniu wirulentnego szczepu 2308 B. abortus; im wyższy podwyższony poziom ochrony tym wyższa swoista aktywność cytotoksyczną. Przykład 2 OHAV konstruowano poprzez nadekspresję genu ctxb w Vibrio cholera. Gen otrzymano z kwasu dezoksyrybonukleinowego z patogenu i wprowadzono do plazmidu zdolnego do replikacji i ekspresji w patogenie. Powstały zrekombinowany plazmid jest używany do transformacji Vibrio cholera na drodze elektroporacji. Plazmidy wysiewano i selekcjonowano metodami znanymi specjalistom. Otrzymany szczep do szczepionki, nadprodukujący homologiczny antygen pobudza nadprodukcję przeciwciał neutralizujących toksynę cholery, dostarcza zatem większą ochronę w profilaktyce i leczeniu cholery u ludzi. Przykład 3 OHAV konstruowano poprzez nadekspresję genu groel z Mycobacterium tuberculosis w gatunkach Mycobacterium. Gen otrzymano z kwasu dezoksyrybonukleinowego z patogenu i wprowadzono do plazmidu zdolnego do replikacji i ekspresji w patogenie. Powstały zrekombinowany plazmid jest używany do transformacji gatunków Mycobacterium na drodze elektroporacji. Plazmidy wysiewano i selekcjonowano metodami znanymi specjalistom. Otrzymany szczep do szczepionki, nadprodukujący homologiczny antygen pobudza nadprodukcję białka GroEL, dostarcza zatem większą ochronę w profilaktyce i leczeniu gruźlicy u ludzi. W szczególności nadekspresja genu groel kodującego białko GroEL w M. bovis
188 925 9 BCG dostarcza większej odporności ochronnej przeciwko gruźlicy ponieważ wiadomo, że szczepionki BCG rozpoznają komórki chroniące antygen, jak makrofagi, dostarczając tym samym sposobu wprowadzania antygenu do komórek limfocytów T, co indukuje ochronną odporność komórkową. Powyższe przykłady są jedynie ilustracją. Zakres wynalazku nie jest ograniczony do przykładów lecz jest opisany w specyfikacji i towarzyszących zastrzeżeniach. Specjaliści w dziedzinie znają metody i materiały, którymi można zastąpić opisane powyżej i jakiekolwiek sposoby i materiały są objęte powyższym ujawnieniem i następującymi zastrzeżeniami.
10 188 925 FIG. 2A FIG. 2B
188 925 11 FIG. 3 FIG. 4
12 188 925 FIG. 1 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.