Aneta Gerszberg i Andrzej K. Kononowicz Zakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin Uniwersytet Łódzki
Molekularna uprawa Termin molekularna uprawa (ang. molecular farming), odnosi się do produkcji na masową skalę (uprawy polowe) rekombinowanych białek przez rośliny. Możliwość wykorzystania roślin jako systemów produkcyjnych dla białek o znaczeniu farmakologicznym została wykazana w drugiej połowie lat 90. Molekularna uprawa poprzedzona jest identyfikacją białka o pożądanej aktywności terapeutycznej czy diagnostycznej, jego analizą na poziomie molekularnym i wreszcie jego ekspresją w heterologicznym systemie komórkowym.
Zalety molekularnej uprawy możliwość otrzymania materiału roślinnego na masową skalę przy niskich kosztach produkcji; opracowanie skutecznych technik transformacji oraz regeneracji in vitro; obecność eukariotycznych szlaków biosyntezy białek, co pozwala na uzyskanie prawidłowego produktu białkowego; uzyskanie bezpiecznego produktu; nie istnieje bowiem niebezpieczeństwo zakażenia człowieka takimi patogenami jak wirus HIV, priony czy wirus żółtaczki; pominięcie lub uproszczenie procedury oczyszczania produktu białkowego; tkanki mogą być wykorzystane jako jadalne szczepionki; docelowe kierowanie białek do wewnątrzkomórkowych przedziałów np. chloroplastów (transformacja chloroplastów minimalizuje ryzyko horyzontalnego transferu genów oraz umożliwia akumulację produktu białkowego do poziomu 46% całkowitego rozpuszczalnego białka; gwarantuje stabilną ekspresję transgenu).
Wady molekularnej uprawy niewłaściwe wstawienie, integracja genu i w konsekwencji ograniczenie jego ekspresji; możliwość potranskrypcyjnego wyciszenia genu, wtórny i pleiotropowy efekt ekspresji genu, obecność roślinnych specyficznych glikanaz (np. α-1,3-fukozy czy β-1,2-ksylozy), które mogą zmieniać właściwości rekombinowanych białek w roślinach, indukcja insercyjnej mutagenezy będącej wynikiem integracji transgenu w obszarze endogennego genu; horyzontalny transfer genów (złamanie barier międzygatunkowych wśród roślin za pośrednictwem transgenicznego pyłku)
Roślinne kultury tkankowe w produkcji rekombinowanych białek zawiesiny komórkowe kultury korzeniowe kultury somatycznych zarodków
Lista wybranych biofarmaceutyków produkowanych przy wykorzystaniu systemów roślinnych Potencjalne zastosowanie Zapalenie wątroby typu B i C Inhibitor trypsyny dla zabiegów transplantacyjnych Antybakteryjne Hormon wzrostu Oparzenia, operacje chirurgiczne Inhibitor trombiny Kolagen Zabliźnianie ran Roślina transgeniczna Ryż Tytoń Kukurydza Ziemniak Tytoń Tytoń Rzepak Tytoń Tytoń Białko Interferon α Interferon β Aprotynina Laktoferyna Somatotropina Albumina Hirudyna Homotrimeryczny kolagen Czynnik wzrostu Poziom ekspresji - < 0,01 % świeżej masy - 0,10 % 7,00 % 0,02 % 0,30 % < 0,01 % świeżej masy < 0,01 %
Białka i enzymy przemysłowe uzyskiwane z roślin transgenicznych awidyna, lakaza, trypsyna i β-glukuronidaza produkowane w transgenicznej kukurydzy, laktoferyna i β-kazeina produkowane w transgenicznych ziemniakach, bakteryjna celulaza produkowana w Arabidopsis thaliana, ksylanaza grzybowa produkowana w rzepaku i tytoniu, fitaza produkowana w rzepaku, hirudyna w połączeniu z oleozyną produkowaną w rzepaku
Stafylokinaza Stafylokinaza jest białkiem wytwarzanym i wydzielanym przez niektóre szczepy Staphyloccocus aureus,, a także S. epidermidis, S. lentus, S. sciuri, S. lugdunensis, S. xylosus, S. hominis. Obecnie do produkcji stafylokinazy wykorzystuje się różnorodne systemy s ekspresyjne np. Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pichia pastoris, Bacillus subtilis.
Model aktywacji plazminogenu przez stafylokinazę wg. Collen i Lijnen, 1993. [1] Plg + Sak Plg - Sak [2] Pli - Sak [3] 1. nieaktywny kompleks Plg Sak 2. generowanie aktywnej plazminy ze stafylokinazą Pli Sak 3. wytwarzanie aktywnej plazminy Plg Pli
W toku naszych dotychczasowych badań skonstruowaliśmy transgeniczne rośliny ziemniaka (Solanum tuberosum cv. Desireé) produkujące białko fuzyjne recsak-mgfp-gus, którego domena recsak wykazuje właściwości amidolityczne, charakteryzujące bakteryjną stafylokinazę. Do transformacji wykorzystano szczep AGL1 Agrobacterium tumefaciens, ze zrekombinowanym plazmidem pcambia1304 zawierającym fuzję genową stafylokinazy i genów reporterowych, pod kontrolą promotora CaMV 35S.
Nośnikiem zrekombinowanego genu stafylokinazy był plazmid binarny pcambia 1304 (Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, Canberra, Australia). W odcinku T-DNA tego plazmidu znajduje się roślinny gen selekcyjny odporności na higromycynę oraz marker reporterowy w postaci fuzji genowej mgfp5-gusa-his6.
Transformacja Solanum tuberosum za pośrednictwem A. tumefaciens. Histochemiczna analiza poziomu ekspresji β-glukuronidazy. Histochemiczna analiza aktywności β-glukuronidazy in situ. Izolacja genomowego DNA z tkanki S. tuberosum. Amplifikacja DNA techniką PCR. METODY Rozdziały elektroforetyczne w żelach agarozowych. Izolacja białek z tkanki przetransformowanych roślin S. tuberosum. Analiza Western blot oraz elektroforeza białek (SDS-PAGE). Test na aktywność amidolityczną ekstraktu białkowego z transgenicznych roślin S. tuberosum.
A 1 mm 1 mm B Kolejne etapy regeneracji Solanum tuberosum cv. Desireé po transformacji Agrobacterium tumefaciens 1 mm C 1 mm D E 2 mm 2 mm F A i B różnicująca się tkanka kalusowa C G formujące się roślinki H transformant na pożywce selekcyjnej 1 mm G 2 cm H
Regeneranty Solanum tuberosum A roślina kontrolna (z lewej), roślina transgeniczna (z prawej) B rośliny transgeniczne A B
Elektroforegram produktów amplifikacji sekwencji kodującej stafylokinazę na matrycy genomowego DNA S. tuberosum, po transformacji A. tumefaciens. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 kanał 1 wzorzec mas kanał 7 S 24 kanał 2 roślina kontrolna kanał 8 S 25 kanał 3 S 5 kanał 9 S 26 kanał 4 S 7 kanał 10 S 27 kanał 5 S 13 kanał 11 S 28 kanał 6 S 23
Elektroforegram produktów amplifikacji sekwencji kodującej stafylokinazę na matrycy genomowego DNA Solanum tuberosum po transformacji A. tumefaciens. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kanał 1 wzorzec mas kanał 2 roślina kontrolna kanał 3 S 6 kanał 4 S 8 kanał 5 S 9 kanał 6 S 17 kanał 7 S 18 kanał 8 S 19 kanał 9 S 21 kanał 10 S 22
1 mm A 1 mm B Histochemiczna analiza aktywności β-glukuronidazy w zregenerowanych roślinach Solanum tuberosum. 1 mm C 1 mm D A kontrola negatywna B roślina GUS-pozytywna C-D przykłady chimeryzmu genu gusa w tkankach S. tuberosum E-F mikroskopowa detekcja ekspresji GUS 200 µm E 100 µm F
Analiza Western blot 119 kda 97,4 kda 1 2 3 4 5 2 3 4 5 A B A elektroforeza białek kanał 1 wzorzec mas kanał 2-2 S 6 kanał 3 roślina kontrolna kanał 4 S 8 kanał 5 S 9 B Western blot kanał 4 S 8 kanał 5 S 9
Aktywność amidolityczna stafylokinazy Kontrola Transgeniczne rośliny
WNIOSKI Konstrukcja transgenicznych roślin Solanum tuberosum produkujących białko fuzyjne SAK-mGFP mgfp-gusagusa analiza PCR wykazała a obecność sekwencji sak będącej elementem transgenu CaMV::sak sak-mgfp-gusa gusa w genomowym DNA 22,5% zregenerowanych roślin Solanum tuberosum, ekspresja białka fuzyjnego SAK-mGFP mgfp-gusa GUSA została a potwierdzona testem histochemicznym na aktywność β-glukuronidazy, analiza Western blot ujawniła a obecność stafylokinazy w ekstrakcie białkowym z dwóch na sześć analizowanych roślin, w preparacie białkowym tylko jednej z dotychczas zbadanych roślin, stwierdzono aktywność amidolityczną charakteryzującą stafylokinazę, rozbieżności pomiędzy wynikami analiz PCR, aktywności GUS, Western blot i aktywności amidolitycznej ekstraktów w białkowych wskazują na wysokie prawdopodobieństwo u otrzymanych roślin transgenicznych z jednej strony uszkodzeń lub rearanżacji acji transgenu, z drugiej zaś na możliwo liwość zakłóce ceń w ekspresji genu i aktywności jego produktu białkowego
PODSUMOWANIE Niniejsza praca dostarczyła po raz pierwszy eksperymentalnych dowodów na możliwość wprowadzenia do roślin genu kodującego stafylokinazę, jego ekspresję w otrzymanych roślinach oraz uzyskania tą drogą produktu białkowego wykazującego właściwości amidolityczne. Praca ta dowodzi możliwości wykorzystania roślin jako naturalnych bioreaktorów do produkcji rekombinowanej stafylokinazy, białkowego aktywatora plazminogenu, preparatu białkowego do wykorzystania w terapii chorób układu krążenia krwi u człowieka, spowodowanych wewnątrznaczyniowymi zakrzepami.
Andrzej K. Kononowicz Aneta Gerszberg Piotr Łuchniak Joanna Kaźmierczak Uniwersytet Łódzki Aneta Wiktorek-Smagur Katarzyna Hnatuszko Tomasz Sakowicz Uniwersytet Medyczny Janusz Szemraj Tadeusz Pietrucha