MIKROBIOLOGIA GENETYKA_2012 Teoria I. Sterylizacja/Wyjaławianie. Sterylizacja polega na pozbyciu się wszystkich żywych organizmów oraz ich przetrwalników z dowolnych materiałów. W praktyce, w laboratorium sterylizuje się m.in. podłoża hodowlane, końcówek do pipet, butelki oraz inne naczynia i przyrządy służące do przechowywania czy posiewu mikroorganizmów i utrzymywania ich w takim stanie przez dłuższy czas. Jeśli taki wyjałowiony materiał zostanie zanieczyszczony innymi mikroorganizmami, nie dodanymi tam celowo, to mówi się wówczas o zakażeniu. Aby określić stopień uśmiercenia danej populacji w danych warunkach używa się wartości D 10 (czas dziesięciokrotnej redukcji), określającej czas niezbędny do zabicia 90% komórek. Sterylizację można przeprowadzić różnymi metodami, dostosowanymi do właściwości sterylizowanego materiału. Sterylizacja parowa, Wilgotne gorąco Komórki wegetatywne większości bakterii i grzybów giną w temperaturze ok. 60 o C w ciągu 5-10 min., formy przetrwale drożdży i grzybów dopiero w temp. powyżej 80 o C, a spory bakteryjne wymagają ok. 15 min. w temp. 120 o C. Najczęściej używanym urządzeniem do sterylizacji parowej jest autoklaw umożliwiający ogrzewanie pod zwiększonym ciśnieniem. Służy on do sterylizacji podłoży hodowlanych, plastików laboratoryjnych i innych materiałów wrażliwych na wysokie temperatury. Aktualna temperatura pary wytwarzanej z wody w autoklawie zależy od ciśnienia, ale temperatura przy danym ciśnieniu jest znacznie niższa, jeśli w komorze znajduje się powietrze. Ponieważ efektywność sterylizacji zależy od temperatury, a nie od ciśnienia, należy zapewnić usunięcie powietrza ze sterylizatora za pomocą zaworu. Sterylizacja sucha, Suche gorąco Wymaga wyższych temperatur i dłuższego czasu ekspozycji nie sterylizacja wilgotnym gorącem (np. 2 godz. w 160 o C). Stosowane do sterylizacji szkła i innych materiałów odpornych na wysokie temperatury oraz materiałów nieodpornych na wilgoć (proszki, gleby). Do sterylizacji suchej używa się specjalnych suszarek lub pieców. Filtrowanie metoda stosowana do sterylizacji płynnych roztworów substancji termowrażliwych, np. antybiotyki czy witaminy oraz do sterylizacji powietrza przepływającego przez komory laminarne. Do sterylizacji płynów najczęściej wykorzystywany jest sterylny filtr nastrzykawkowy o średnicy porów 0,2 0,45 µm. Nie zapobiega on jednak przed przechodzeniem cząstek wirusowych. Naświetlanie najczęściej stosowane w laboratoriach jest promieniowanie UV o długości fal ok. 260 nm, wybiórczo absorbowane przez kwasy nukleinowe. Służy do częściowej sterylizacji pomieszczeń, komór laminarnych. 1
II. Podłoża mikrobiologiczne. Podłoże mikrobiologiczne jest to sztucznie stworzone środowisko do hodowli drobnoustrojów. Zawierają w postaci przyswajalnych związków, pierwiastki uczestniczące w tworzeniu masy komórkowej. Mikroorganizmy do wzrostu wymagają źródła energii i węgla, siarki, azotu, tlenu, soli mineralnych i czasem tzw. czynników wzrostowych. Czynniki wzrostowe to substancje odżywcze, takie jak witaminy, aminokwasy czy zasady purynowe i pirymidynowe. Substancje te wchodzą w skład komórek, ale nie wszystkie organizmy potrafią je syntetyzować. Organizmy wymagające do wzrostu takich dodatkowych czynników nazywają się auksotrofami, w odróżnieniu do prototrofów, które nie są uzależnione od dodatkowych substancji odżywczych. Ze względu na skład, podłoża dzielimy na minimalne, pełne i wzbogacone. Podłoża minimalne zawierają tylko źródło energii, węgla i sole mineralne oraz czasem pojedyncze czynniki wzrostowe. Podłoża pełne zawierają wszystkie substancje niezbędne do dobrego wzrostu drobnoustrojów (źródło węgla, azotu, sole mineralne, wiele czynników wzrostowych). Podłoża wzbogacone stosuje się do hodowli drobnoustrojów słabo rosnących in vitro, wymagających dodatkowych substancji odżywczych. Jako czynniki wzbogacające podłoża stosuje się: krew, surowicę, płyny wysiękowe, wyciąg wątrobowy, mleko, żółtko jaj, sok z pomidorów. Ze względu na konsystencje podłoża dzielimy na płynne, półpłynne i stałe. Najczęściej jako czynnik zespalający pożywki mikrobiologiczne używany jest agar, w różnych proporcjach. Większość bakterii nie ma możliwości rozkładu agaru. Otrzymuje się go z morskich krasnorostów, u których występuje w ścianach komórkowych. Agar rozpuszcza się w temperaturze 100 o C, krzepnie przy temperaturze 45 o C (stężenie 2%, w ph obojętnym). Zestalony agar przetrzymywany w temperaturze do 100 o C pozostaje w konsystencji stałej. Podłoża ze względu na przeznaczenie i zastosowanie dzielimy na namnażające, wybiórcze (zawierają dodatek substancji chemicznych hamujących wzrost konkretnej grupy drobnoustrojów), namnażająco - wybiórcze (pozwala na namnożenie jednego typu organizmu, a hamuje wzrost innych), oraz pożywki izolacyjne (podłoże stałe zawierające odpowiedni wskaźnik pozwalający odróżnić od siebie kolonie bakterii). Podłoża do hodowli mogą być przygotowane w różnej formie. Hodowle płynne w zależności od ilości podłoża prowadzi się w probówkach, kolbach, butlach lub fermentatorach. Hodowle na podłożu stałym wykonujemy na szalkach Petriego, słupach, lub skosach. Przykładowe pożywki drożdżowe: Podłoże pełne stałe: Podłoże minimalne płynne: Bacto-Ekstrakt drożdżowy 10 g Zestaw soli mineralnych 6,7 g Bacto-Pepton 20 g Glukoza 20 g Glukoza 20 g Woda destylowana 1000 ml Agar 20 g Woda destylowana 1000 ml 2
III. Przechowywanie mikroorganizmów Mikroorganizmy przechowywane w różnych warunkach różnią się znacznie od siebie czasem przeżywania. W celu krótkoterminowego przechowywania drobnoustrojów (tj. kilka dni do ok. dwóch tygodni) wystarczy je włożyć do chłodziarki, 4 o C w formie takiej jakiej są w podłożu płynnym lub posiane na szalce agarowej. Chcąc je przechować dłużej należy je zamrozić. Aby zamarzająca woda nie zniszczyła komórek drobnoustrojów, zamraża się je w 15% roztworze glicerolu. W temperaturze 20 o C mikroorganizmy mogą być przechowywane kilka miesięcy a w temperaturze 70 o C mogą być przechowywane praktycznie bezterminowo. IV. Cykl życiowy drożdży Saccharomyces cerevisiae Drożdże Saccharomyces cerevisiae są modelowym organizmem eukariotycznym. Cechują się: niewielkim genomem (zawierającym około 6 tyś. genów), małej liczbie chromosomów, oraz krótkim czasem podziału komórkowego (w warunkach optymalnych 90 min). Są mikroorganizmami łatwymi do hodowli i manipulacji genetycznych. Nie formują grzybni, rozmnażają się wegetatywnie przez pączkowanie. Ogromną zaletą drożdży jest możliwość utrzymywania ich zarówno jako haplo- bądź diploidów. Haploidy mogą występować jako dwa typy kojarzeniowe: a lub α. Różnią się od siebie genetycznie locus MAT, określającym typ kojarzeniowy. Występują dwa allele tego locus: MATa i MATα. Szczep MATa kojarzy się ze szczepem MATα poprzez kompleksowy proces cytoplazmatycznej i jądrowej fuzji dzięki czemu powstaje komórka diploidalna (a/α). Pod względem zmienności typu kojarzeniowego wyróżnia się drożdże stabilne (heterotalliczne) i niestabilne (homotalliczne). Jest to uzależnione od genu HO, który odpowiada za zmianę typu kojarzeniowego przy każdym podziale mejotycznym komórki. Naturalnie występujące szczepy drożdży są diploidalne i mają funkcjonalny allel genu HO, powodujący spontaniczną zmianę typu kojarzeniowego co każdy podział mitotyczny. Szczepy laboratoryjne mają zmutowany/wydeletowany gen ho i dzięki temu mogą być utrzymywane jako szczepy o niezmiennym typie kojarzeniowym. Komórka o stabilnym typie kojarzeniowym dzieląc się mitotycznie produkuje komórki potomne o takich samych typie kojarzeniowym. Istnienie stabilnej fazy haploidalnej jest wyjątkowo atrakcyjne dla genetyków ze względu na możliwość izolacji i identyfikacji szczepów niosących recesywne mutacje. Istnienie stabilnego diploida jest również bardzo korzystne dla genetyków. Pozwala na określenie recesywności lub dominacji nowej mutacji lub na przeprowadzenie testu komplementacji (czy szczepy niosące po jednej mutacji niosą allele tego samego genu czy są to mutacje w różnych genach). Gdy drożdże są wystawione na stres np. niekorzystne warunki pokarmowych, komórki diploidalne przechodzą mejozę produkując cztery komórki potomne, zwane askosporami: dwie typu kojarzeniowego a- i dwie typu kojarzeniowego α- Askospory tworzą tetradę, która jest zawarta w pojedynczej strukturze zwanej ascus (worek). Gdy przywróci się odpowiednie warunki pokarmowe, każda z tych czterech askospor wykiełkuje i zacznie się rozmnażać jako haploid. 3
Rys.1.Schemat cyklu życiowego Sacharomyces cerevisiae.(za F. Sherman) V. Rekombinacja genetyczna i mapowanie mejotyczne (analiza tetrad) Rekombinacja genetyczna zachodzi wtedy gdy wśród genotypów potomstwa znajdą się genotypy inne niż rodziców. Prostym przykładem rekombinacji jest krzyżówka: F1: AA BB (czyli AB/AB) x aa bb (ab/ab) Gamety1: AB ab Zygota AaBb Gamety 2: typ rodzicielski: ab AB rekombinanty: Ab ab Pełna niezależność dwóch loci jest zapewniona, gdy umieszczone są one na osobnych chromosomach, są to loci w pełni nie sprzężone. Im dalej od siebie geny leżą na chromosomach tym częściej zachodzi między nimi rekombinacja. Jednostką odległości mapy genetycznej jest centymorgan (cm) liczony wg wzoru poniżej: liczba rekombinantów ------------------------------------- x 100 = liczba cm całkowita liczba potomstwa 1 cm to 1% rekombinacji (rekombinantów wśród potomstwa) 50 cm oznacza 50% rekombinacji; zachodzi gdy 2 geny leżą odpowiednio daleko na jednym chromosomie lub na dwóch chromosomach. Mapowanie oparte o analizę produktów mejozy jest tradycyjną metodą genetyki klasycznej określenia kolejności i odległości genów. Drożdże szczególnie dobrze nadają się do zastosowania tej metody ponieważ cztery haploidalne spory w ascus/worku są produktami jednego wydarzenie mejotycznego. Genetyczna analiza takich tetrad pozwala na ustalanie wzajemnego położenia genów obecnych w stanie heterozygotycznym diploidzie. Możliwe jest również mapowanie położenia genu w stosunku do jego centromeru. W tym przypadku należy użyć krzyżówki 4
organizmów zawierających gen sprzężony z centromerem oraz drugi leżący w znanej odległości od niego. Izolacja czterech spor z ascus jest jednym z trudniejszych technik genetyki drożdży, wymagających pracy na mikromanipulatorze i dużej praktyki. Analiza tetrad jest rutynowo wykonywana w większości laboratoriów pracujących z drożdżami. Obecnie stosuje się te technikę nie do mapowania genetycznego, lecz raczej do określania tempa mutacji odpowiadających za zmiany w pojedynczym locus, do tworzenia nowych szczepów i do badania interakcji genów. Dla szczepu hybrydowego (AB x ab) który jest heterozygotyczny pod względem markerów istnieją 3 typy tetrad: PD (rodziców/parental ditype), NPD (bez rodziców/ nonparental ditype) i T (typ_tetra) jak pokazano na rysunku poniżej. Na podstawie wzajemnego stosunku ilościowego tych tetrad można wnioskować o sprzężeniach genowych i centromerowych : Jeśli dwa geny są sprzężone to istnieje nadmiar tetrad typu PD w stosunku do NPD. Jeśli dwa geny znajdują się na różnych chromosomach, i są sprzężone ze swoimi centromerami występuje mniejsza proporcja tetrad typu T. Jeśli oba geny leżą na różnych chromosomach, ale przynajmniej jeden z nich nie jest sprzężony ze swoim centromerem, lub geny leżą na jednym chromosomie ale sa daleko od siebie (odległość większa niż 50cM) to występują losowe proporcje rodzajów tetrad tj. PD: NPD: T wynosi 1: 1: 4. Rys.2. Różne rodzaje tetrad pochodzących z krzyżowania szczepów AB x ab. Częstość występowania tetrad typu: PD, NPD, i T mogą być stosowane do określenia odległości na mapie w cm (centimorgany) między dwoma genami, wyliczanej wg. poniższego wzoru: 5
Literatura 1. Schlegel Hans G. Mikrobiologia ogólna. 1996. Wydawnictwo Naukowe PWN 2. Sherman F. An Introduction to the Genetics and Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae. 1998. Department of Biochemistry and Biophysics. University of Rochester Medical School, Rochester, NY 14642. http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/yeast/index.html 3. Sherman F., Getting started with yeast, Methods Enzymol. 350, 3-41 (2002). http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/startedyeast.pdf --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Opracowały: mgr Joanna Bobula, dr Dominika Włoch-Salamon Ćwiczenia praktyczne Dbaj o swoje miejsce pracy. Pozostaw go tak czystym jak go zastałeś. Jednorazowe zużyte materiały wyrzuć, a materiały wielokrotnego użytku umyj. Zadanie nr 1: Kojarzenie drożdży Szczepy haploidalne użyte w tym doświadczeniu są auksotrofami różnych aminokwasów i żaden z nich nie jest w stanie rosnąć na podłożu minimalnym. Dopiero po skojarzeniu może powstać heterozygotyczny diploid, który dzięki komplementacji markerów troficznych jest zdolny do syntezy wszystkich aminokwasów, i tym samym wzrostu na podłozu minimalnym. Należy: (1) skojarzyć wszystkie szczepy (na zasadzie każdy z każdym), (2) wymazać próbkę na podłożu Sc-leu (3) zostawić do inkubacji do następnych zajęć. Na drugich zajęciach należy przypisać podane genotypy do numerów prób (napisanych na probówkach). - probówki z trzema płynnymi kulturami haploidalnych drożdży: Y55 MATα, ura2, URA 3, LEU2, tyr, Y55 MATa, ura2, URA 3, LEU2, tyr, Y55 MATα, URA2, ura3, leu2, TYR - pipeta i sterylne końcówki do pipety - szalki Petriego: ze stałym podłożem minimalnym (SD) i Sc-leu Przebieg doświadczenia: Praca w grupach pod komorami laminarnymi. SZALKI NALEŻY PODPISAĆ!!!!!! Na stronie/części z agarem (nie na pokrywce) 1. Połóż szalkę minimalną na części z agarem i ją otwórz zdejmując pokrywkę. 2. Wstrząśnij płynną kulturę haploida nr1 na worteksie, lub potrząścij tak aby nie wychlapać. 3. Nastaw pipetę na 10 l. 4. Otwórz naczynie ze sterylnymi końcówkami do pipet i delikatnie nabij jeden na pipetę dbając, by podczas wyciągania nie dotknąć niczego jej sterylnym końcem. 6
5. Włóż delikatnie pipetę do probówki i przenieś kroplę kultury drożdży na szalkę umieszczając ją po lewej stronie szalki. 6. Dbając, by niczego po drodze nie dotknąć, przenieś drugą kroplę zawiesiny drożdży i umieść ją na środku szalki. 7. Wstrząśnij płynną kulturę haploida nr2 na worteksie. 8. Zmień końcówkę pipety i przenieś kroplę zawiesiny na prawą stronę szalki. 9. Zmień końcówkę pipety, przenieś kroplę zawiesiny i umieść ją na kropli będącej już na środku szalki. 10. Poczekaj, aż krople wyschną. 11. Powtórz to wszystko dla drugiego (nr1 i nr3) i trzeciego (nr2 i nr3) kojarzenia i przełóż szalkę do inkubatora. 12. Każdy ze szczepów wymaż patyczkiem na szalce Sc-leu Kontynuacja doświadczenia tydzień później. 12. Wyjmij szalki z inkubatora i oceń wzrost poszczególnych szczepów. 13. Przypisz podane genotypy do numerów prób Zadanie nr 2: Test replik (stemplowanie) Na otrzymanych szalkach z podłożem pełnym YPD (yeast peptone dextrose) wysiano prototroficzny pod względem syntezy leucyny szczep drożdży. Istnieje jednak podejrzenie, że nastąpiło zakażenie kultury wyjściowej innym, auksotroficznym pod tym samym względem szczepem drożdży. W celu sprawdzenie, które kolonie wyrosłe na szalce z podłożem pełnym są auksotroficzne, należy wykonać test replik na podłożu nie zawierającym leucyny. Założeniem tej metody jest odbicie drożdży z powierzchni agaru na sterylny aksamit, a następnie transfer tego wzoru na kolejną szalkę. Doświadczenie ma na celu oszacowanie proporcji kolonii drożdży auksotroficznych pod względem syntezy leucyny do kolonii prototroficznych, a tym samym sprawdzenie czy doszło do zakażenia szczepu - szalki z wyrośniętymi koloniami drożdży na podłożu YPD - sterylne szmatki aksamitne - szalki Petriego ze stałym podłożem SC-leu Procedura: Praca w grupach pod komorami laminarnymi. 1. Wyjmij z naczynia sterylny aksamit i ostrożnie rozprostuj go uważając, by nie dotknąć palcami powierzchni z włoskami w centrum szmatki. 2. Rozprostowaną szmatkę połóż na stemplu włoskami do góry i przymocuj do niego gumką recepturką. 3. Szalkę matrycę otwórz, delikatnie przyciśnij agarem do aksamitu, zamknij. 4. Szalkę docelową otwórz, delikatnie przyciśnij do welwetu, zamknij i umieść w inkubatorze. Kontynuacja doświadczenia tydzień później. 7
5. Wyjmij szalki z inkubatora i policz kolonie wyrosłe na różnych podłożach a następnie oblicz proporcję szczepu leu do LEU. Zadanie nr 3: Obserwacja komórek wegetatywnych i zesporulowanych drożdży pod mikroskopem. Rozmiar komórek drożdży jest zmienny w zależności od faz wzrostu (pączek a kom. dojrzała), stanów metabolicznych (szybki wzrost a starzenie się), rodzaju szczepów, form ploidalności (haploidy a diploidy). Typowa diploidalne komórka drożdża jest elipsoidalnego kształtu o wymiarach 5 x 6 µm, a haploidalna to sferoida o średnicy 4 µm. Podczas fazy wzrostu logarytmicznego haploidy zbijają się w liczniejsze zgrupowania niż haploidy. Dodatkowo nowe komórki haploida pączkują sąsiadująco w stosunku do swojej komórki matki, natomiast diploidy kiełkują na przeciwległych biegunach. Po podziale mejotycznym 4 spory (askospory) są zamknięte w worku (askus). Komórki są niewielkie w przestrzeni między szkiełkami preparatu nie są ułożone płasko a przestrzennie. Tetrady spor są najczęściej widoczne jako 3 małe kuleczki (4-ta jest ukryta pod spodem) otoczone ścianą komórkową. - płynne kultury drożdży wegetatywnych (1n, 2n) i zesporulowanych - sterylne patyczki drewniane - szkiełka mikroskopowe i nakrywkowe Procedura: 1. Wymieszać dobrze płynne kultury drożdży 2. Na szkiełko podstawowe należy nanieść pipetą kroplę kultury drożdży i nakryć szkiełkiem nakrywkowym. 3. Obserwować pod powiększeniem 40X 4. Narysuj komórki wegetatywne (1n, 2n) i spory. Zaznacz różnice w preparatach Zadanie nr 4: Oznaczanie genotypu drożdży wegetatywnych (1n) na podłożach selekcyjnych Podłoża, na których będą przeprowadzane testy to podłoża syntetyczne (Sc-), czyli w pełni zdefiniowane o dokładnie poznanym składzie, w których brakuje pojedynczego czynnika wzrostowego, w tym wypadku są to poszczególne aminokwasy. Na takim podłożu mogą rosnąć tylko te drożdże, które mają sprawny szlak syntezy danego aminokwasu. Gdy szlak ten jest uszkodzony na jakimś etapie, drożdże na takim podłożu nie rosną i nazywane są aksotrofami tego poszczególnego nutrientu, np. szczep nie rosnący na podłożu SC-ura to auksotrof uracylu. - szalki z wyrośniętymi koloniami drożdży o nieznanym genotypie na podłożu pełnym bulionowym YPD - szalki z wykonanymi replikami na podłożach selekcyjnych Procedura: 8
Na podstawie wyników wzrostu kolonii odbitych na szalkach testowych określ genotypy poszczególnych szczepów drożdży. Zadanie nr 5: Oznaczanie genotypu askospor na podłożach selekcyjnych Używając mikromanipulatora można rozdzielić askospory pochodzące z jednej tetrady. Uzyskuje się w ten sposób haploidy będące produktem mejozy jednej komórki diploidalnej. Podczas tworzenia spor większość genów segreguje do komórk potomnych wg. Praw genetyki mendlowskiej. Heterozygotyczny marker będzie segregował zgodnie z wzorcem 2:2. W ten sposób można otrzymać szczepy o nowej kombinacji cech. Doświadczenie ma na celu określenie genotypów askospor powstałych w wyniku sporulacji diploidalnego szczepu drożdży, hetoryzygotycznego w każdym locus markerów troficznych oraz określenie, czy askospory rzeczywiście pochodzą z jednej tetrady. - szalka z wyrośniętymi koloniami powstałymi w wyniku rozłożenia za pomocą mikromanipulatora nadtrawionych tetrad na pełnym podłożu YPD - szalki z wykonanymi replikami na podłożach SC-lys, SC-ade, YPD+nat Procedura: Na podstawie wyników wzrostu kolonii odbitych na szalkach testowych określ genotypy poszczególnych kolonii wyrosłych z pojedynczych askospor i określ na tej podstawie czy dana tetrada jest tetradą prawdziwą czy fałszywą. Zadanie nr 6: Mapa genetyczna (analiza sprzężeń genowych) ZADANIE TYLKO DLA STUDENTÓW BIOLOGII oraz chętnych studentów biologii i geografii Skrzyżowano dwa szczepy: Nr 1: haploid Y55 MAT a his4 leu2 lys2 ade1 ura3 nr. 2: haploid Y55 MATα, HIS4 LEU2 LYS2 ADE1 URA3 Otrzymany szczep diploidalny poddano sporulacji. Tetrady spor rozdzielono za pomocą mikromanipulatora. Otrzymano 4 kolonie haploidalne o różnych genotypach (patrz zadanie 5.) Celem zadanie jest analiza sprzężeń 2 par genów: leu i his; i ade i lys. W każdym przypadku oceń ile jest określonych typów tetrad (rodzicielski, nie rodzicielskie, typ-tetra) w twoim zestawie szalek eksperymentalnych. Po zebraniu danych ze wszystkich zestawów (praca całej grupy) można zastosować wzór (podany we wstępie) i oszacować odległość między genami w cm. 9