RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 209128 (21) Numer zgłoszenia: 365177 (22) Data zgłoszenia: 10.05.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 10.05.2001, PCT/US01/015057 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 15.11.2001, WO01/85790 (13) B1 (51) Int.Cl. C07K 14/715 (2006.01) C12N 15/12 (2006.01) C07K 16/28 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) (54) Białko receptora spokrewnionego z receptorami cytokin oraz związane z nim produkty, sposoby i zastosowania (30) Pierwszeństwo: 10.05.2000, US, 60/203,426 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 27.12.2004 BUP 26/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.07.2011 WUP 07/11 (73) Uprawniony z patentu: SCHERING CORPORATION, Kenilworth, US (72) Twórca(y) wynalazku: MADALINE CHIRICA, Palo Alto, US ROBERT A. KASTELEIN, Redwood City, US KEVIN W. MOORE, Palo Alto, US CHRISTI L. PARHAM, San Francisco, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PL 209128 B1
2 PL 209 128 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zasadniczo czysty lub zrekombinowany polipeptyd receptora spokrewnionego z receptorami cytokin, izolowany lub zrekombinowany kwas nukleinowy, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania polipeptydu, związek wiążący obejmujący przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, sposób wytwarzania kompleksu antygen : przeciwciało, kompozycje oraz zastosowania. Rozwiązania według wynalazku mają wpływ na fizjologię ssaków, w tym na funkcjonowanie ich układu immunologicznego. W szczególności umożliwiają one regulację rozwoju i/lub funkcjonowania układu immunologicznego. Niniejszym ujawnione są również diagnostyczne i terapeutyczne zastosowania. Technologia rekombinowania DNA dotyczy ogólnie technik integrowania informacji genetycznej ze źródła donorowego do wektorów i jej dalszej obróbki, takiej jak wprowadzenie do gospodarza, dzięki czemu informacja ta jest powielana i/lub wyrażana w nowym środowisku. Zazwyczaj, informacja genetyczna istnieje w postaci komplementarnego DNA (cdna) otrzymanego z informacyjnego RNA (mrna), kodującego pożądany produkt białkowy. Nośnikiem jest często plazmid, wykazujący zdolność do wbudowywania cdna, a następnie jego replikacji w komórkach gospodarza, a także, w niektórych przypadkach, kontroli ekspresji cdna i w ten sposób syntezy kodowanego produktu w gospodarzu. Patrz np. Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (wyd. II.) t. 1-3, CSH Press, NY. Od pewnego czasu wiadomo, że odpowiedź immunologiczna ssaków opiera się na szeregu złożonych oddziaływań komórkowych, zwanych siecią immunologiczną". Współczesne badania dostarczyły nowych danych dotyczących wzajemnych oddziaływań wewnątrz tej sieci. O ile jest jasne, że zasadnicza część odpowiedzi immunologicznej wiąże się ze wzajemnymi oddziaływaniami limfocytów, makrofagów, granulocytów i innych komórek, to obecnie, zdaniem immunologów, rozpuszczalne białka, takie jak limfokiny, cytokiny i monokiny, odgrywają kluczową rolę w kontrolowaniu tych oddziaływań międzykomórkowych. Stąd istnieje stosunkowo duże zainteresowanie izolowaniem, scharakteryzowaniem i wyjaśnieniem mechanizmów działania czynników regulujących aktywność komórek, co umożliwi znaczące postępy w diagnostyce i terapii licznych schorzeń, np. zaburzeń funkcjonowania układu immunologicznego. Limfokiny w sposób oczywisty regulują aktywność komórkową na wiele sposobów. Patrz np. Paul (red. 1996) Fundamental Immunology wyd. III, Raven Press, New York; i Thomson (red. 1994) The Cytokine Handbook wyd. II, Academic Press, San Diego. Wykazano, że wspierają one proliferację, wzrost i/lub różnicowanie się niezróżnicowanych komórek macierzystych szpiku kostnego w różnorodne komórki prekursorowe, w tym linie komórkowe tworzące złożony system immunologiczny. Właściwe i zrównoważone oddziaływania pomiędzy składnikami komórkowymi są niezbędne dla prawidłowej odpowiedzi immunologicznej. Różne linie komórkowe często reagują w różny sposób na limfokiny podawane wraz z innymi czynnikami. Linie komórkowe szczególnie ważne w odpowiedzi immunologicznej zawierają dwie klasy limfocytów: komórki B, które mogą wytwarzać i wydzielać immunoglobuliny (białka zdolne do rozpoznawania i wiązania obcych substancji w celu ich usunięcia) i różne typy komórek T, które wydzielają limfokiny i pobudzają lub hamują komórki B, a także różnorodne inne komórki (w tym inne komórki T), tworząc sieć immunologiczną. Limfocyty te oddziaływują z komórkami wielu innych rodzajów. Badania mające na celu lepsze poznanie i leczenie zaburzeń układu immunologicznego były hamowane przez zasadniczą niemożność hodowli wielu komórek układu immunologicznego in vitro. Immunolodzy stwierdzili, że hodowla wielu typów komórek może być prowadzona z wykorzystaniem nadsączy pochodzących z komórek T i innych typów komórek, które zawierają różnorodne czynniki wzrostowe, w tym wiele limfokin. Istnieje wiele różnych czynników wzrostowych i regulatorowych, które wpływają na rozwój morfogenetyczny. Poznano wiele receptorów cytokinowych. Zazwyczaj funkcjonalny receptor składa się z przynajmniej dwóch zasadniczych podjednostek. Patrz np. Heinrich i wsp. (1998) Biochem. J. 334: 297-314; Gonda i D'Andrea (1997) Blood 89: 355-369; Presky, i wsp. (1996) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93: 14002-14007; Drachman i Kaushansky (1995) Curr. Opin. Hematol. 2: 22-28 ; Theze (1994) Eur. Cytokine Netw. 5: 353-368; i Lemmon i Schlessinger (1994) Trends Biochem. Sci. 19: 459-463.
PL 209 128 B1 3 Z niniejszego omówienia wynika, że ujawnienie i badanie nowych rozpuszczalnych białek i ich receptorów, w tym czynników podobnych do limfokin, powinno przyczynić się do powstania nowych sposobów leczenia szeregu zaburzeń, bezpośrednio lub pośrednio związanych z rozwojem, różnicowaniem lub funkcjonowaniem np. systemu immunologicznego i/lub komórek macierzystych szpiku. W szczególności byłoby bardzo korzystne ujawnienie i zbadanie nowych receptorów cząsteczek podobnych do limfokin, które wzmagają korzystne działanie innych limfokin. Niniejszy wynalazek dotyczy nowych receptorów ligandów wykazujących podobieństwo do kompozycji podobnych do cytokin i spokrewnionych związków, oraz sposobów ich zastosowania. Niniejszy wynalazek dotyczy nowych receptorów spokrewnionych z receptorami cytokin, np. molekularnych, podobnych do receptorów cytokin struktur u naczelnych, określanych jako podjednostki receptora cytokinowego DNAX (DCRS, ang. DNAX Cytokine Receptor Subunit) i ich aktywności biologicznych. W szczególności niniejszymi przedstawiono opis jednej takiej podjednostki o nazwie DCRS5. Przedstawione zostały sekwencje kwasów nukleinowych kodujące polipeptydy oraz sposoby ich wytwarzania i zastosowania. Kwasy nukleinowe według wynalazku są częściowo scharakteryzowane przez ich homologię do zawartych niniejszym sekwencji sklonowanego komplementarnego DNA (cdna). Niniejszym wykazano dopasowanie ligandu p40/il-b30 z podjednostkami receptora DCRS5 i IL12Rβ1. Dostarcza ono informacji dotyczących zastosowania agonistów i antagonistów w oparciu o odczynniki wobec których są one skierowane. Przedmiotem wynalazku jest zasadniczo czysty lub zrekombinowany polipeptyd obejmujący reszty aminokwasowe 1 do 606 SEKW. NR ID.: 2, a korzystnie reszty aminokwasowe -23 do 606 SEKW. NR ID.: 2. Rekombinowany polipeptyd może składać się z dojrzałej sekwencji opisanej w Tabeli 1; może być polipeptydem nieglikozylowanym; może pochodzić od człowieka; może być naturalnym wariantem polimorficznym SEKW. NR ID.: 2; może wykazywać przynajmniej 2 nienakładające się na siebie epitopy, które są specyficzne dla DCRS5 naczelnych; w formie naturalnie glikozylowanej może mieć masę cząsteczkową wynoszącą przynajmniej 30 kd; może być polipeptydem syntetycznym; może mieć sterylną postać; może występować w roztworze wodnym lub buforowanym; może być związany ze stałym podłożem; może być skoniugowany z innym chemicznym ugrupowaniem; lub może być w postaci fizycznie zasocjowanej z polipeptydem IL-12Rβ1. Polipeptyd według wynalazku może ponadto zawierać epitop umożliwiający jego oczyszczenie lub detekcję. Dostarczone zostały także różne kompozycje, obejmujące np.: zasadniczo czysty polipeptyd w kombinacji z białkiem IL-25 12Rβ1. Przedmiotem wynalazku jest heterodimerowa kompozycja obejmująca a) polipeptyd obejmujący reszty aminokwasowe 1 do 606 SEKW. NR ID.: 2; oraz b) IL-12Rβ1. Korzystnie kompozycja według wynalazku jest zdolna do wiązania IL-B30/p40. Polipeptyd według wynalazku może być dostarczany w nośniku, który może być: roztworem wodnym, w szczególności roztworem soli i/lub buforem; i/lub sformułowany do podawania doustnego, doodbytniczego, donosowego, miejscowego lub pozajelitowego. Niniejszym opisane zostały również zestawy obejmujące polipeptyd według wynalazku i: przedział zawierający polipeptyd; przedział zawierający polipeptyd IL12Rβ1; przedział zawierający polipeptyd p40, IL-B30 lub p40/il-b30; lub instrukcje dotyczące korzystania lub usunięcia wchodzących w skład zestawu odczynników. Dostarczone są przeciwciała i inne związki wiążące, np. obejmujące miejsce wiążące antygen z przeciwciała, które specyficznie wiąże się z wewnątrzkomórkową częścią DCRS5. W szczególności przedmiotem wynalazku jest związek wiążący obejmujący przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, które specyficznie wiążą się z polipeptydem obejmującym sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 2. Korzystnie, związek wiążący według wynalazku swoiście wiąże się z polipeptydem obejmującym reszty 1 do 606 SEKW. NR ID.: 2, korzystniej z polipeptydem obejmującym reszty 356 do 606 SEKW. NR ID.: 2. W korzystnej postaci wykonania związek wiążący według wynalazku jest przeciwciałem monoklonalnym lub jego wiążącym antygen fragmentem. Również korzystnie związek wiążący według wynalazku jest fragmentem Fab, Fab2 lub Fv. Związek wiążący może być skoniugowany z innym ugrupowaniem chemicznym. Może on być przeciwciałem uzyskanym w odpowiedzi na sekwencję peptydową dojrzałego polipeptydu przedstawioną w Tabeli 1, w odpowiedzi na dojrzały DCRS5 lub w odpowiedzi na oczyszczony ludzki DCRS5. Związek wiążący według wynalazku można otrzymać w wyniku immunoselekcji.
4 PL 209 128 B1 Może on być przeciwciałem poliklonalnym lub wiązać się ze zdenaturowanym DCRS5. Ponadto może on wiązać antygen ze stałą wiązania Kd wynoszącą przynajmniej 30 μm. Związek wiążący może występować w postaci związanej ze stałym podłożem, takim jak kulki lub membrana z tworzywa sztucznego. Związek wiążący według wynalazku może być formułowany w sterylnej kompozycji. Możliwe jest również jego znakowanie znacznikiem promieniotwórczym lub fluorescencyjnym w sposób umożliwiający jego detekcję. Niniejszym opisano także zestawy zawierające związek wiążący oraz: przedział zawierający związek wiążący; przedział zawierający: polipeptyd p40; polipeptyd IL-B30; polipeptyd DCRS5; i/lub polipeptyd IL-12Rβ1; przedział zawierający przeciwciało, które specyficznie wiąże się z: polipeptydem p40; polipeptydem IL-B30; polipeptydem DCRS5; i/lub polipeptydem IL-12Rβ1; lub instrukcje dotyczące korzystania albo usuwania odczynników wchodzących w skład zestawu. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania kompleksu antygenu z przeciwciałem obejmujący kontaktowanie polipeptydu DCRS5 według wynalazku ze związkiem wiążącymi według wynalazku, np. z przeciwciałem, w odpowiednich warunkach, które umożliwiają utworzenie kompleksu. W sposobie tym kompleks może być oddzielony od innych receptorów cytokinowych; kompleks może być oddzielony od innych przeciwciał; kontaktowanie może mieć miejsce w próbce zawierającej interferon; kontaktowanie umożliwia ilościowe oznaczanie antygenu; kontaktowanie może mieć miejsce w próbce zawierającej przeciwciało; lub kontaktowanie umożliwia ilościowe oznaczanie przeciwciała. Dostarczone są ponadto inne kompozycje, np. kompozycje zawierające: sterylny związek wiążący lub związek wiążący i nośnik, przy czym nośnik jest: roztworem wodnym, w tym roztworem soli i/lub buforem. Kompozycje takie mogą być formułowane do podawania doustnego, doodbytniczego, donosowego, miejscowego lub pozajelitowego. Wynalazek również dostarcza oczyszczonego lub zrekombinowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd DCRS5. Przedmiotem wynalazku jest izolowany lub zrekombinowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd według wynalazku. Korzystnie izolowany lub zrekombinowany kwas nukleinowy według wynalazku obejmuje reszty nukleotydowe 188-2005 SEKW. NR ID.: 1. lub reszty nukleotydowe 119-2005 SEKW. NR ID. : 1. Kwas nukleinowy według wynalazku może zawierać miejsce początku replikacji; pochodzić z naturalnego źródła; być znakowany w sposób umożliwiający detekcję; obejmować syntetyczną sekwencję nukleotydową; mieć długość mniejszą niż 6 kb lub mniejszą niż 3 kb; pochodzić od naczelnych; obejmować pełnej długości naturalną sekwencję kodującą; być sondą hybrydyzacyjną dla genu kodującego DCRS5; lub być starterem PCR, produktem PCR lub starterem do mutagenezy. Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresyjny obejmujący kwas nukleinowy według wynalazku oraz obejmujące taki wektor komórki gospodarza. Komórki zawierające zrekombinowany kwas nukleinowy mogą być: komórkami prokariotycznymi; komórkami eukariotycznymi; komórkami bakteryjnymi; komórkami drożdżowymi; komórkami owadzimi; komórkami ssaka; komórkami mysimi; komórkami naczelnych; albo komórkami ludzkimi. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania polipeptydu obejmujący: a) hodowanie komórek gospodarza według wynalazku w warunkach odpowiednich do ekspresji polipeptydu; oraz b) izolowanie lub oczyszczanie tego polipeptydu. Niniejszym opisano także zestawy, które obejmują kwas nukleinowy oraz: przedział zawierający kwas nukleinowy kodujący: polipeptyd p40; polipeptyd IL-B30; polipeptyd DCRS5; i/lub polipeptyd IL-12Rβ1; przedział zawierający: polipeptyd p40; polipeptyd IL-B30; polipeptyd DCRS5; i/lub polipeptyd IL-12Rβ1; przedział zawierający przeciwciało specyficznie wiążące się z: polipeptydem p40; polipeptydem IL-B30; polipeptydem DCRS5; i/lub polipeptydem IL-12Rβ1; lub instrukcje dotyczące korzystania lub usuwania odczynników wchodzących w skład zestawu. Kwasy nukleinowe mogą obejmować kwasy, które: podczas płukania przez 30 minut w temperaturze 30 C i przy stężeniu soli niższymi niż 2M hybrydyzują z częścią SEKW. NR ID.:1 kodującą część wewnątrzkomórkową polipeptydu. Korzystnie, taki kwas nukleinowy hybrydyzuje w temperaturze 45 C i/lub przy stężeniu soli 500 mm; albo w 55 C i/lub przy stężeniu 150 mm.
PL 209 128 B1 5 Wynalazek dostarcza także zastosowania terapeutyczne. Przedmiotem wynalazku jest zatem kompozycja obejmująca będące antagonistą przeciwciało lub jego wiążący antygen fragment, które wiążą się z polipeptydem obejmującym aminokwasy 1-328 SEKW. NR ID.: 2 do zastosowania jako lek. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja obejmująca będące antagonistą przeciwciało lub jego wiążący antygen fragment, które wiążą się z polipeptydem obejmującym aminokwasy 1-328 SEKW. NR ID: 2 do zastosowania jako lek. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja obejmująca będące antagonistą przeciwciało lub jego wiążący antygen fragment, które wiążą się z kompleksem zawierającym: i) polipeptyd obejmujący aminokwasy 1-328 SEKW. NR ID.: 2; oraz ii) zewnątrzkomórkową część IL-12Rβ1 do zastosowania jako lek. Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja obejmująca kompleks zawierający: i) polipeptyd obejmujący aminokwasy 1-328 SEKW. NR ID.: 2; oraz ii) zewnątrzkomórkową część IL-12Rβ1 do zastosowania jako lek. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja obejmująca kwas nukleinowy antysensowny wobec polinukleotydu, który koduje polipeptyd obejmujący sekwencję z SEKW. NR ID.: 2, do zastosowania jako lek. Korzystnie kompozycja według wynalazku może być stosowana w kombinacji z antagonistą IL-12; IL-18; TNF; lub IFNγ. Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie określonej powyżej kompozycji według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia pacjenta z przewlekłą chorobą, w której pośredniczy Th1; ze stwardnieniem rozsianym; z reumatoidalnym zapaleniem stawów; z zapaleniem kości i stawów; z zapalną chorobą jelit; z cukrzycą; z łuszczycą; z posocznicą; lub z przeszczepem allogenicznym. Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja obejmująca będące agonistą przeciwciało lub jego wiążący antygen fragment, które wiążą się z kompleksem zawierającym: i) polipeptyd obejmujący aminokwasy 1-328 SEKW. NR ID.: 2; oraz ii) zewnątrzkomórkową cześć IL-12Rβ1 do zastosowania jako lek. Korzystnie kompozycja według wynalazku jest w kombinacji z: IL-12; IL-18; TNF; lub IFNγ. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie opisanej powyżej kompozycji według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia pacjenta z przewlekłą odpowiedzią Th2; z nowotworem; z zakażeniem wirusem; z zakażeniem grzybiczym; lub z reakcją alergiczną. Wynalazek dotyczy też zastosowania określonej powyżej kompozycji według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia pacjenta otrzymującego szczepionkę. Szczegółowy opis wynalazku Konspekt I. Zagadnienia ogólne II. Aktywności III. Kwasy nukleinowe A. fragmenty kodujące, sekwencje, sondy B. mutacje, chimery, fuzje C. przygotowanie kwasów nukleinowych D. wektory, komórki je zawierające IV. Białka, peptydy A. fragmenty, sekwencje, immunogeny, antygeny B. muteiny C. agoniści/antagoniści, odpowiedniki funkcjonalne D. przygotowanie białek V. Wytwarzanie kwasów nukleinowych i białek A. syntetyczne B. rekombinowane C. ze źródeł naturalnych VI. Przeciwciała
6 PL 209 128 B1 A. poliklonalne B. monoklonalne C. fragmenty ; Kd D. przeciwciała anty-idiotypowe E. linie komórkowe hybrydoma VII. Zestawy, diagnostyka i oznaczenia ilościowe A. ELISA B. oznaczanie kodującego mrna C. jakościowe/ilościowe D. zestawy VIII. Kompozycje terapeutyczne, sposoby A. kompozycje kombinowane B. jednostka dawkowania C. podawanie IX. Badania przesiewowe I. Zagadnienia ogólne Niniejszy wynalazek dostarcza sekwencji aminokwasowej i sekwencji DNA ssaczych, w tym naczelnych, cząsteczek podjednostki podobnej do receptora cytokinowego, nazwanej w podjednostką receptora cytokinowego DNAX, posiadającej szczególne, określone własności, zarówno strukturalne jak i biologiczne. Różne cdna kodujące te cząsteczki zostały uzyskane z bibliotek sekwencji cdna naczelnych, np. ludzkich. Pożądane byłyby także ich odpowiedniki pochodzące od innych naczelnych lub innych ssaków. Niniejszym wykazano dopasowanie ligandu p40/il-330 z podjednostkami receptora DCRS5 i IL-12Rβ1, które dostarcza informacji dotyczących zastosowania agonistów i antagonistów na podstawie odczynników wobec których są one skierowane. Niektóre ze standardowych metod, które mogą tu znaleźć zastosowanie, są opisane lub cytowane np. w Maniatis, i wsp. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Press; Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), t.t. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel i wsp., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; lub Ausubel i wsp. (1987 wraz z okresowymi uzupełnieniami) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Sekwencja nukleotydowa (SEKW. NR ID.: 1) i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasowa (SEKW. NR ID.: 2) części kodującej DCRS5 naczelnych, np. człowieka, jest przedstawiona w Tabeli 1. Przewidywana sekwencja sygnałowa została zaznaczona, lecz może ona zależeć od typu komórki lub może być o kilka reszt aminokwasowych dłuższa lub krótsza. Potencjalne miejsca N-glikozylacji to reszty asparaginy w pozycjach 6, 24, 58, 118, 157, 209 i 250. Mostki dwusiarczkowe prawdopodobnie mogą znajdować się pomiędzy resztami cysteiny w pozycjach 29 i 78; konserwowany motyw C_CXW znajduje się w pozycjach 110/121/123. Odnotować należy resztę tryptofanu w pozycji 219 i motyw WxxWS w pozycjach 281-285. Segment obejmujący pozycje około 1-101 jest domeną Ig; od około reszty 102-195 znajduje się wiążąca cytokiny domena 1; od około reszty 196-297 znajduje się wiążąca cytokiny domena 2; pomiędzy około 298-330 znajduje się łącznik; pomiędzy około 329-354 znajduje się część transbłonowa; oraz pomiędzy około 356-606 znajduje się domena wewnątrzkomórkowa. Część wewnątrzkomórkowa zawiera przypuszczalne miejsce wiążące SH2 w pozycjach Y374-I377, Y461-Q464, oraz Y588-Q591; oraz potencjalnie ważne reszty tyrozynowe w pozycjach 406, 427, 440, i 453. Miejsca te i zakresy zasługują na szczególną uwagę. ORF zawiera przypuszczalną sekwencję sygnałową, która zgodnie z przewidywaniami jest trawiona przy... CHG/GIT..., jak pokazano wyżej. Za przewidywaną domeną zewnątrzkomórkową o długości 328 aminokwasów znajduje się przypuszczalny segment transbłonowy, a za nim domena cytoplazmatyczna o długości około 252 aminokwasów. Przewiduje się, że funkcje wiązania ligandów spełnia domena zewnątrzkomórkowa. Sekwencja kwasu nukleinowego otrzymana po odwrotnej translacji jest przedstawiona w Tabeli 2.
PL 209 128 B1 7 T a b e l a. 1: Sekwencja nukleotydowa i polipeptydowa podjednostki receptora cytokinowego DNAK (DCRS5). Sekwencje naczelnych, np. człowieka (patrz SEKW. NR ID.: 1 i 2). Wskazano przewidywaną sekwencję sygnałową, lecz jej długość może różnić się o kilka pozycji i zależeć od rodzaju komórki. Zidentyfikowane pozycje zmienne znajdują się w pozycjach nukleotydowych 127 i 563; które występują sparowane z G i G (translacja do kombinacji Q i G) lub T i A (translacja do H i R).
8 PL 209 128 B1
PL 209 128 B1 9
10 PL 209 128 B1
PL 209 128 B1 11
12 PL 209 128 B1
PL 209 128 B1 13 Zewnątrzkomórkowa domena IL30R" jest najbliżej spokrewniona z będącym przekaźnikiem sygnału IL-6 białkiem gp130 i IL12Rβ2. Jest nieco słabiej spokrewniona z receptorem GCSF, receptorem leptyny, receptorem czynnika inhibitorowego białaczki i receptorem CNTF. A zatem IL-30R" należy do klasy I w obrębie nadrodziny receptorów cytokinowych i jest blisko spokrewniona z rodziną 6R/IL-12R. Tabela 3 przedstawia porównanie dostępnych sekwencji podjednostek receptorów naczelnych z DCRS5 naczelnych, np. człowieka (IL-30R). DCRS5 wykazuje podobieństwo do podjednostki gp130 receptora IL-6 (np. podjednostki IL-6R) i do podjednostki IL-12β2. DCRS5 wykazuje cechy strukturalne podjednostki beta, ale właściwy przebieg oddziaływań białkowych i przekazywania sygnałów pozostaje nieznany. W rozumieniu niniejszego zgłoszenia nazwa DCRS5 będzie używana do opisania białka obejmującego sekwencję aminokwasową przedstawioną w Tabeli 1. W wielu przypadkach znaczna jego część będzie jego funkcjonalnym lub strukturalnym odpowiednikiem, włączając w to np. dodatkowe części zewnątrz komórkowe. Niniejszym opisano również wariant białkowy odpowiedniego allelu DCRS5, którego sekwencja jest dostarczona, np. muteiny i innych konstruktów. Zazwyczaj takie warianty będą wykazywały mniej niż 10% różnic sekwencji w docelowym regionie i w ten sposób często będą miały od 1- do 11-krotnych podstawień, np. 2-, 3-, 5-, 7-krotne i inne. Niniejszym opisano warianty alleliczne i inne, np. naturalne polimorfizmy opisanego białka. Zazwyczaj białko to wiąże się ze swoim odpowiednim naturalnym ligandem, możliwie w postaci dimeru z podjednostką alfa receptora z dużym powinowactwem, np. przynajmniej około 100 nm, zazwyczaj lepszym niż około 30 nm, korzystnie lepszym niż 10 nm, korzystniej lepszym niż 3 nm. Nazwa ta będzie również używana w niniejszym zgłoszeniu do opisu naturalnie występujących form, np. alleli, wariantów polimorficznych i metabolicznych białka ssaka. Pożądane formy kompleksów receptorowych będą wiązać odpowiedni ligand z siłą i specyficznością odpowiednią dla oddziaływania ligand - receptor. Rozwiązania według wynalazku odnoszą się także do kombinacji białek lub peptydów, które wykazują znaczące podobieństwo sekwencji aminokwasowej do sekwencji aminokwasowej z Tabeli 1. Niniejszym ujęto także warianty sekwencyjne ze względnie niewielką liczbą podstawień, np. korzystnie z mniejszą niż około 3-5. Znaczny fragment" lub segment" polipeptydu oznacza odcinek reszt aminokwasowych o długości przynajmniej około 8 aminokwasów, ogólnie przynajmniej 10 aminokwasów, bardziej ogólnie przynajmniej 12 aminokwasów, często przynajmniej 14 aminokwasów, częściej przynajmniej 16 aminokwasów, typowo przynajmniej 18 aminokwasów, bardziej typowo przynajmniej 20 aminokwasów, zazwyczaj przynajmniej 22 aminokwasów, częściej niż zazwyczaj przynajmniej 24 aminokwasów, korzystnie przynajmniej 26 aminokwasów, korzystniej przynajmniej 28 aminokwasów, a, w szczególnie pożądanych wykonaniach, przynajmniej około 30 lub więcej aminokwasów. Sekwencje segmentów różnych białek mogą być porównywane ze sobą na odcinkach odpowiedniej długości. W wielu przypadkach fragmenty mogą wykazywać funkcjonalne właściwości całych podjednostek, np. domena zewnątrzkomórkowa receptora transbłonowego może zachowywać
14 PL 209 128 B1 zdolność wiązania liganda i może być wykorzystywana do otrzymywania rozpuszczalnego kompleksu podobnego do kompleksu receptora. Homologia sekwencji aminokwasowej lub podobieństwo sekwencji jest określone przez najlepsze zestawienie pozycji poszczególnych reszt. W niektórych porównaniach w miarę potrzeby można wprowadzać odstępy. Patrz np. Needleham i wsp., (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; Sankoff i wsp., (1983) rozdz. 1 w: Time Warps, String Edits, i Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA; i programy opracowane przez IntelliGenetics, Mountain View, CA oraz University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI. To zmienia się, gdy rozważa się podstawienia o charakterze konserwatywnym jako miejsca dopasowane. Do podstawień o charakterze konserwatywnym zazwyczaj zalicza się podstawienia w następujących grupach: glicyna, alanina; walina, izoleucyna, leucyna; kwas asparaginowy, kwas glutaminowy; asparagina, glutamina; seryna, treonina; lizyna, arginina; i fenyloalanina, tyrozyna. Homologiczne sekwencje aminokwasowe powinny zawierać naturalne alleliczne i międzygatunkowe warianty w sekwencji cytokinowej. Typowe homologiczne białka lub peptydy będą wykazywać od 50-100% homologii (jeśli można wprowadzić odstępy do sekwencji) do 60-100% homologii (jeśli uwzględni się podstawienia o charakterze konserwatywnym) do części sekwencji aminokwasowej z Tabeli 1. Stopień homologii będzie wynosił przynajmniej około 70%, ogólnie przynajmniej 76%, bardziej ogólnie przynajmniej 81%, często przynajmniej 85%, częściej przynajmniej 88%, typowo przynajmniej 90%, bardziej typowo przynajmniej 92%, zazwyczaj przynajmniej 94%, częściej niż zazwyczaj przynajmniej 95%, korzystnie przynajmniej 96%, i korzystniej przynajmniej 97%, oraz w szczególnie pożądanych wykonaniach, przynajmniej 98% lub więcej. Stopień homologii będzie zależeć od długości porównywanych fragmentów. Homologiczne białka lub peptydy, takie jak warianty alleliczne, będą wykazywać w większości takie same biologiczne aktywności, jak te przedstawione w Tabeli 1, szczególnie w części wewnątrzkomórkowej. Określenie aktywność biologiczna" jest stosowane niniejszym do opisania, w sposób nieograniczający, efektów wywieranych przez ligandy podobne do cytokin na przekazywanie sygnału, odpowiedzi zapalne, wrodzoną odpowiedź immunologiczną i/lub rozwój morfogenetyczny. Na przykład, receptory te powinny pośredniczyć w aktywności fosfatazy lub fosforylazy, które to aktywności można łatwo zmierzyć przy pomocy standardowych metod. Patrz np. Hardie i wsp. (red. 1995) The Protein Kinase FactBook t. I i II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks i wsp. (1991) Meth. Enzymol. 200: 38-62; Hunter i wsp. (1992) Cell 70: 375-388; Lewin (1990) Cell 61: 743-752; Pines i wsp. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 56: 449-463; oraz Parker i wsp. (1993) Nature 363: 736-738. Receptory lub ich części mogą być wykorzystywane jako enzymy przyłączające grupę fosforanową do znakowania specyficznych lub niespecyficznych substratów. Podjednostki mogą również wykazywać właściwości immunogenne i powodować powstawanie rozpoznających je przeciwciał lub mogą być antygenami zdolnymi do wiązania przeciwciał. Określenia ligand, agonista, antagonista, i analog, np. DCRS5, odnoszą się do oddziaływania liganda z receptorem, np. w których receptor jest receptorem naturalnym lub przeciwciałem. Odpowiedź komórkowa prawdopodobnie zazwyczaj przebiega za pośrednictwem receptora będącego kinazą tyrozynową, Również, ligand jest cząsteczką, która albo działa jak naturalny ligand, z którym wiąże się wyżej wymieniony receptor lub jego analog, lub cząsteczką, która stanowi funkcjonalny analog naturalnego liganda. Analog funkcjonalny może być ligandem zawierającym modyfikacje strukturalne lub może być całkowicie niespokrewnioną cząsteczką, której kształt umożliwia oddziaływanie z odpowiednimi determinantami wiązania liganda. Ligandy mogą działać jako agoniści lub antagoniści, patrz np. Goodman i wsp. (red. 1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, Pergamon Press, New York. Racjonalne projektowanie leków może się również opierać na badaniach strukturalnych budowy receptora lub przeciwciała i innych elektorów lub ligandów. Patrz np. Herz i wsp. (1997) J. Recept. Signal Transduct. Res. 17: 671-776; oraz Chaiken i wsp. (1996) Trends Biotechnol. 14: 369-375. Efektorami mogą być inne białka, które pełnią inne funkcje w odpowiedzi na wiązanie liganda lub inne białka, które normalnie oddziaływują z receptorem. Jedną z metod umożliwiających określenie, które miejsca cząsteczki oddziaływują z innymi specyficznymi białkami jest badanie struktury fizycznej, np. krystalografia rentgenowska lub techniki dwuwymiarowego NMR. Mogą one dostarczyć wskazówek, które reszty aminokwasowe tworzą molekularne regiony kontaktowe. Aby zapoznać się ze szczegóło-
PL 209 128 B1 15 wym opisem określania struktury białek patrz np. Blundell i Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York, włączone tu na drodze odniesienia. II. Aktywności Białka podobne do receptorów cytokinowych będą wykazywać szereg różnych aktywności biologicznych, np. wewnątrzkomórkowe przekazywanie sygnału, np. przez STAT4, wpływając na proliferację komórek lub metabolizm fosforanów dodawanych lub usuwanych ze specyficznych substratów, zazwyczaj białek. Aktywności te na ogół będą powodować zmiany funkcji zapalnych, wpływać na wrodzoną odpowiedź immunologiczną lub mieć efekt morfologiczny. Podjednostka prawdopodobnie wiąże ligand z niskim powinowactwem. DCRS5 posiada motywy charakterystyczne dla receptorów przekazujących sygnał na drodze JAK. Patrz np. Ihle i wsp. (1997) Stem Cells 15 (dodatek 1) : 105-111; Silvennoinen i wsp. (1997) APMIS 105: 497-509; Levy (1997) Cytokine Growth Factor Review 8: 81-90; Winston i Hunter (1996) Current Biol. 6: 668-671; Barrett (1996) Baillieres Clin. Gastroenterol. 10 : 115; oraz Briscoe i wsp. (1996) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 351: 167-171. Szczególnie interesujące są motywy wiążące SH2 opisane powyżej. Aktywności biologiczne podjednostek receptora cytokinowego są związane z dodawaniem lub usuwaniem ugrupowań fosforanowych do substratów zazwyczaj w sposób specyficzny, ale czasem w sposób niespecyficzny. Możliwa będzie identyfikacja substratów, a także określenie warunków aktywności enzymatycznej standardowymi metodami, np. jak opisane w Hardie i wsp. (red. 1995) The Protein Kinase FactBook t. Ii II, Academic Press, San Diego, CA; Hanks i wsp. (1991) Meth. Enzymol. 200: 38-62; Hunter, i wsp. (1992) Cell 70: 375-388; Lewin (1990) Cell 61: 743-752; Pines, i wsp. (1991) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 56: 449-463; oraz Parker, i wsp. (1993) Naturę 363: 736-738. Podjednostki receptora mogą łączyć się i tworzyć funkcjonalne kompleksy, np. które mogą być stosowane do wiązania liganda lub otrzymania przeciwciał. Będzie to miało istotne zastosowanie diagnostyczne, na przykład do wykrywania lub oznaczania ilościowego. Połączenie funkcjonalne receptora z ligandem p40/il-b30 dostarcza istotnych informacji o wskazaniach klinicznych, dla których receptor ten będzie znajdował zastosowanie. A zatem, antagoniści i agoniści będą mieć określone efekty funkcjonalne. III. Kwasy nukleinowe Rozwiązania według wynalazku odnoszą się do zastosowania wyizolowanych kwasów nukleinowych lub ich fragmentów, np. kodujących te lub blisko spokrewnione białka lub ich fragmenty, np. kodujących odpowiedni polipeptyd, korzystnie taki, który wykazuje aktywność biologiczną. Możliwe jest zastosowanie izolowanego lub rekombinowanego DNA, który koduje kombinacje białek lub polipeptydów o charakterystycznych sekwencjach, np. samego DCRS5 lub kombinacji z innymi, takimi jak podjednostka IL-12Rβ1 (patrz Showe i wsp. (1996) Ann. N. Y. Acad. Sci. 795: 413-425; Gately i wsp. (1998) Ann. Rev. Immunol. 16: 495-521; GenBankU03187, NM005535). Zazwyczaj kwas nukleinowy może w odpowiednich warunkach hybrydyzować z kwasem nukleinowym o sekwencji pokazanej w Tabeli 1, lecz korzystnie nie z odpowiadającym mu fragmentem innych receptorów, opisanych w Tabeli 3. Wyżej wymienione aktywne biologicznie białko lub polipeptyd może być białkiem pełnej długości lub fragmentem i zazwyczaj będzie zawierać segment sekwencji aminokwasowej silnie homologicznej, np. wykazującej znaczące odcinki identyczności, do tych pokazanych w Tabeli 1. Ponadto niniejszy wynalazek obejmuje zastosowanie izolowanych lub rekombinowanych kwasów nukleinowych lub ich fragmentów, które kodują białka zawierające części odpowiadające białkom DCRS5, np. ich fragmentom wewnątrzkomórkowym. Izolowane kwasy nukleinowe mogą zawierać odpowiednie sekwencje regulatorowe na swoich końcach 5' i 3', np. promotory, wzmacniacze transkrypcji, sygnały poliadenylacji i inne, pochodzące z naturalnego genu. Dostarczone są także, jak to opisano, kombinacje, np. połączenie DCRS5 z IL-12Rβ1 lub ich zewnątrzkomórkowych fragmentów wiążących ligand, działające jako antagoniści liganda. Bezsporne jest również znaczenie diagnostyczne, np. wariantów polimorficznych i innych. Izolowany" kwas nukleinowy jest to kwas nukleinowy, np. RNA, DNA lub mieszany polimer, który jest zasadniczo czysty, np. oddzielony od innych składników, które naturalnie towarzyszą kwasom nukleinowym, takich jak rybosomy, polimerazy i sekwencje flankujące specyficzne dla gatunku pochodzenia. Określenie to obejmuje kwas nukleinowy, który został pozyskany ze swojego naturalnego środowiska, a także obejmuje DNA zrekombinowane lub sklonowane, które są przez to nierozróżnialne od naturalnie występujących kompozycji, a także chemicznie zsyntetyzowane analogi lub ana-
16 PL 209 128 B1 logi syntetyzowane biologicznie w systemach heterologicznych. Zasadniczo czysta cząsteczka oznacza wyizolowane formy cząsteczki, zarówno całkowicie, jak i zasadniczo czyste. Izolowany kwas nukleinowy zasadniczo jest homogenną kompozycją cząsteczek, ale może w niektórych wykonaniach wykazywać różnorodność, najkorzystniej niewielką. Ta różnorodność zazwyczaj ma miejsce na końcach polimeru lub w częściach nieistotnych dla pożądanej funkcji biologicznej lub aktywności. Rekombinowany" kwas nukleinowy jest zazwyczaj określony przez sposób jego wytwarzania lub swoją budowę. W odniesieniu do sposobu wytwarzania, np. produktu wytwarzanego w procesie, proces stanowi użycie techniki rekombinacji kwasów nukleinowych, np. wiążącej się z interwencją człowieka w sekwencję nukleotydową. Zazwyczaj interwencja ta wiąże się z manipulacją in vitro, chociaż w pewnych warunkach może wykorzystywać bardziej klasyczne techniki hodowli zwierząt. Alternatywnie, może to być kwas nukleinowy otrzymany przez wytworzenie sekwencji obejmującej połączenie dwóch fragmentów, które w naturze nie występują obok siebie, co ma na celu wyeliminowanie naturalnych produktów, np. naturalnie występujących mutantów odkrytych w stanie naturalnym. A zatem, np. włącza się niniejszym produkty otrzymane przez transformację komórek wektorem niewystępującym w przyrodzie, jak również kwasy nukleinowe obejmujące sekwencję uzyskaną z użyciem procesu syntetycznych oligonukleotydów. Taki proces jest często prowadzony w celu zastąpienia np. kodonu kodonem o tym samym znaczeniu kodującym taki sam lub konserwatywny aminokwas, tym samym wprowadzając lub usuwając miejsce sekwencji rozpoznawanej przez enzym restrykcyjny lub dla celów analizy struktura-funkcja. Alternatywnie, proces jest prowadzony, aby połączyć ze sobą części kwasów nukleinowych o pożądanych funkcjach w celu otrzymania pojedynczej całości genetycznej obejmującej pożądaną kombinację funkcji nieobecną w powszechnie dostępnych formach naturalnych, np. kodującą białko fuzyjne. Miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne są często celem takich sztucznych manipulacji, ale inne specyficzne docelowe miejsce, np. promotory, miejsca replikacji DNA, sekwencje regulatorowe, sekwencje kontrolujące i inne użyteczne cechy mogą być włączone przez zaprojektowanie. Podobne podejście jest zamierzone dla rekombinowanego, np. fuzyjnego, polipeptydu. Niniejszym ujęto powtórzenie dimerowe lub fuzję DCRS5 z podjednostką IL-12Rβ1. Konkretnie zawarte niniejszym są syntetyczne kwasy nukleinowe, które przez degenerację kodu genetycznego, kodują polipeptydy odpowiadające fragmentom DCRS5 i fuzjom sekwencji z różnych pokrewnych cząsteczek, np. innych należących do rodziny receptorów cytokinowych. Fragment" w odniesieniu do kwasu nukleinowego jest ciągłym segmentem o długości przynajmniej około 17 nukleotydów, ogólnie przynajmniej 21 nukleotydów, bardziej ogólnie przynajmniej 25 nukleotydów, powszechnie przynajmniej 30 nukleotydów, bardziej powszechnie przynajmniej 35 nukleotydów, często przynajmniej 39 nukleotydów, częściej przynajmniej 45 nukleotydów, typowo przynajmniej 50 nukleotydów, bardziej typowo przynajmniej 55 nukleotydów, zazwyczaj przynajmniej 60 nukleotydów, częściej niż zazwyczaj przynajmniej 66 nukleotydów, korzystnie przynajmniej 72 nukleotydy, korzystniej przynajmniej 79 nukleotydów, i w szczególnie korzystnych wykonaniach przynajmniej 85 i więcej nukleotydów, w tym 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200 itd. Zazwyczaj, fragmenty różnych sekwencji genetycznych mogą być porównywane ze sobą na odcinkach odpowiedniej długości, na szczególnie określonych segmentach, takich jak domeny opisane poniżej. Kwas nukleinowy, który koduje DCRS5 będzie szczególnie użyteczny przy identyfikacji typów genów, mrna i cdna, które kodują sam DCRS5 lub blisko spokrewnione białka, jak również DNA, które kodują polimorficzne, alleliczne i inne genetyczne warianty np., z różnych osób lub gatunków pokrewnych. Korzystne sondy do takich poszukiwań stanowią regiony receptora, które są konserwowane pomiędzy różnymi wariantami polimorficznymi, lub które zawierają nukleotydy którym brak jest specyficzności, oraz które najkorzystniej będą pełnej lub prawie pełnej długości. W innych sytuacjach bardziej użyteczne będą specyficzne sekwencje wariantów polimorficznych. Kombinacje polimorficznych wariantów DCRS5 z wariantami IL-12Rβ1 mogą również być rozpoznawane. Niniejszy wynalazek ponadto obejmuje cząsteczki rekombinowanych kwasów nukleinowych i fragmenty posiadające sekwencję kwasu nukleinowego identyczną z lub wysoce homologiczną do izolowanego DNA określonego niniejszym. W szczególności, sekwencje będą funkcjonalnie połączone z segmentami DNA, które kontrolują transkrypcję, translację i replikację DNA. Te dodatkowe segmenty zazwyczaj pomagają w wyrażaniu pożądanego segmentu kwasu nukleinowego. Homologiczne lub wysoce podobne sekwencje kwasów nukleinowych, np. DCRS5, wykazują znaczące podobieństwo przy porównywaniu ze sobą nawzajem. Standardy homologii kwasów nukleinowych stanowią albo miarę homologii ogólnie używaną w dziedzinie przez porównywanie sekwencji,
PL 209 128 B1 17 albo są oparte o warunki hybrydyzacji. Porównawcze warunki hybrydyzacji są opisane poniżej bardziej szczegółowo. Zasadnicze podobieństwo w kontekście porównywania sekwencji kwasów nukleinowych oznacza, że albo segmenty albo ich nici komplementarne przy porównywaniu są identyczne, gdy optymalnie zestawione, z odpowiednimi insercjami lub delecjami nukleotydowymi w przynajmniej około 60% nukleotydów, ogólnie przynajmniej 66%, powszechnie przynajmniej 71%, często przynajmniej 76%, częściej przynajmniej 80%, zazwyczaj przynajmniej 84%, częściej niż zazwyczaj przynajmniej 88%, typowo przynajmniej 91%, bardziej typowo przynajmniej około 93%, korzystnie przynajmniej około 95%, korzystniej przynajmniej około 96% do 98% lub więcej i w szczególnych wykonaniach w tak wielu jak około 99% lub więcej nukleotydów, włączając np. segmenty kodujące domeny strukturalne lub inne opisane segmenty. Alternatywnie, zasadnicze podobieństwo będzie istniało, gdy segmenty będą hybrydyzowały w selektywnych warunkach hybrydyzacji z nicią lub nicią komplementarną, zazwyczaj wykorzystując sekwencję pochodzącą z Tabeli 1. Zazwyczaj selektywna hybrydyzacja będzie występować, gdy homologia na odcinku przynajmniej około 14 nukleotydów wynosi przynajmniej około 55%, bardziej typowo przynajmniej około 65%, korzystnie przynajmniej około 75% i korzystniej przynajmniej około 90%. Patrz Kanehisa (1984) Nucl. Kwasy Res. 12:203-213. Długość homologicznych porównań, jak opisano, może dotyczyć dłuższych odcinków i w pewnych wykonaniach taki odcinek będzie miał przynajmniej około 17 nukleotydów, ogólnie przynajmniej około 20 nukleotydów, powszechnie przynajmniej około 24 nukleotydy, zazwyczaj przynajmniej około 28 nukleotydów, typowo przynajmniej około 32 nukleotydy, bardziej typowo przynajmniej około 40 nukleotydów, korzystnie przynajmniej około 50 nukleotydów, korzystniej przynajmniej około 75 do 100 lub więcej nukleotydów, w tymi również np. 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 itp. i inne długości. Ostre warunki w odniesieniu do homologii w kontekście hybrydyzacji będą oznaczać ostre warunki wynikające z kombinacji stężenia soli, temperatury, rozpuszczalników organicznych i innych parametrów typowo kontrolowanych w reakcjach hybrydyzacji. Ostre warunki temperaturowe będą zazwyczaj zawierać temperatury przekraczające około 30, zazwyczaj przekraczające około 37, typowo przekraczające około 45, bardziej typowo przekraczające około 55, korzystnie przekraczające około 65 i korzystniej przekraczające około 70. Ostre warunki stężenia soli będą powszechnie niższe niż około 500 mm, zazwyczaj niższe niż około 400 mm, częściej niż zazwyczaj niższe niż około 300 mm, typowo niższe niż około 200 mm, korzystnie niższe niż około 100 mm i korzystniej niższe niż około 88 mm, a nawet niższe niż około 50 lub 20 mm. Jednakże kombinacja parametrów jest znacznie istotniejsza niż wartość dowolnego pojedynczego parametru. Patrz np. Wetmur i Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370. Izolowane DNA może być łatwo modyfikowane przez podstawienia nukleotydowe, delecje nukleotydowe, insercje nukleotydowe i odwrócenia odcinków nukleotydów. W wyniku tych modyfikacji otrzymuje się nowe sekwencje DNA, które kodują to białko lub jego pochodne. Zmodyfikowane sekwencje mogą być wykorzystywane do wytwarzania zmutowanych białek (mutein) lub do wzmacniania ekspresji typów wariantowych. Wzmocniona ekspresja może wiązać się z amplifikacją genu, zwiększoną transkrypcją, zwiększoną translacją i innymi mechanizmami. Takie zmutowane DCRS5 imituje DCRS5 jak określono powyżej, lecz posiada sekwencję aminokwasowi, która różni się od sekwencji innych białek podobnych do receptorów cytokinowych spotykanych naturalnie, zarówno przez wprowadzenie delecji, podstawień lub insercji. W szczególności mutant DCRS5 o miejscowo specyficznej mutacji" obejmuje białko posiadające znaczące podobieństwo sekwencji z białkiem z Tabeli 1 i typowo wykazujące większość biologicznych aktywności lub efektów jak postaci zawarte w niniejszym zgłoszeniu. Różne naturalne polimorficzne warianty sekwencji będą również zidentyfikowane. Chociaż miejsca mutacji specyficznej miejscowo są z góry określone, mutanty nie muszą być specyficzne wobec miejsca. Mutageneza ssaczego DCRS5 może być uzyskana przez wprowadzanie insercji aminokwasowych lub delecji w genie, w połączeniu z ekspresją. Podstawienia, delecje, insercje lub wiele kombinacji może być wytworzonych, aby uzyskać końcowy konstrukt. Insercje zawierają fuzje amino- lub karboksykońcowe. Losowa mutageneza może być prowadzona na docelowym kodonie i wyrażane mutanty ssaczego DCRS5 mogą następnie być analizowane pod względem pożądanej aktywności, dostarczając wiedzy na temat związku struktura-aktywność. Metody uzyskiwania mutacji podstawieniowych w określonych miejscach DNA posiadającego znaną sekwencję są dobrze znane w dziedzinie, np. przez mutagenezę starterami M13. Patrz również Sambrook i wsp. (1989) oraz Ausubel i wsp. (1987 wraz z okresowymi uzupełnieniami). Szczególnie użytecznymi konstruktami będą zewnątrzkomórkowe części DCRS5 związane z segmentami IL-12Rβ1.
18 PL 209 128 B1 Mutacje w DNA standardowo nie powinny powodować, aby sekwencje kodujące wypadły z ramek odczytu i korzystnie nie powinny tworzyć regionów komplementarnych, które mogłyby hybrydyzując wytwarzać struktury drugorzędowe mrna, takie jak pętle lub szpilki. Metodą amidofosforynową opisaną przez Beaucage i Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862, można wytwarzać odpowiednie syntetyczne fragmenty DNA. Dwuniciowy fragment będzie często otrzymywany, albo przez syntezę nici komplementarnej i połączenie nici razem w odpowiednich warunkach, albo przez dodanie nici komplementarnej przy użyciu polimerazy DNA z odpowiednią sekwencją startera. Techniki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) mogą być często stosowane w mutagenezie. Alternatywnie mutagenne startery są powszechnie używaną metodą wytwarzania określonych mutacji w wybranych miejscach. Patrz np. Innis i wsp. (wyd. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA; oraz Dieffenbach i Dveksler (1995; wyd.) PCR Primer: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, CSH, NY. Pewne wykonania wynalazku dotyczą kombinacji składników obejmujących opisane sekwencje receptora. W innych wykonaniach funkcjonalne części sekwencji mogą być łączone i kodować białka fuzyjne. W innych postaciach wykonania warianty opisywanych sekwencji mogą być podstawiane. IV. Białka, peptydy Jak opisano powyżej niniejszy wynalazek obejmuje DCRS5 naczelnych, np. których sekwencje znajdują się w Tabeli 1 i zostały opisane powyżej. Warianty alleliczne i inne są także rozważane włączając np. białka fuzyjne, łączące części takich sekwencji z innymi, włączając np. IL-12Rβ1, znaczniki epitopowe i domeny funkcjonalne. Niniejszy wynalazek dotyczy również białek rekombinowanych, np. białek będących heterologicznymi fuzjami wykorzystującymi segmenty z białek naczelnych lub gryzoni. Białko będące fuzją heterologiczną jest fuzją białek lub segmentów, które w naturze nie są normalnie połączone w ten sposób. W ten sposób produkt fuzji DCRS5 z innym receptorem cytokinowym jest ciągłą cząsteczką białkową, posiadającą sekwencje połączone typowymi wiązaniami peptydowymi, zazwyczaj wytwarzaną jako pojedynczy produkt translacji i wykazującą właściwości, np. sekwencję lub antygenowość, pochodzące z każdego peptydu źródłowego. Podobne pojęcie stosuje się do heterologicznych sekwencji kwasów nukleinowych. Zestawienia w kompleksy różnych zaplanowanych białek są również dostarczone. Ponadto nowe konstrukty mogą być wytwarzane przez łączenie podobnych funkcjonalnych lub strukturalnych domen z innych spokrewnionych białek, np. receptorów cytokinowych lub receptorów z grupy Toll, włączając warianty gatunkowe. Na przykład segmenty wiążące ligandy lub inne mogą być wymieniane" pomiędzy różnymi nowymi polipeptydami fuzyjnymi lub fragmentami. Patrz np. Cunningham i wsp. (1989) Science 243: 1330-1336; oraz O'Dowd i wsp. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992. W ten sposób nowe chimeryczne polipeptydy, wykazujące nowe kombinacje właściwości, zostaną uzyskane dzięki funkcjonalnemu połączeniu właściwości receptorów wiążących. Na przykład, domeny wiążące ligand z innych spokrewnionych cząsteczek receptorów mogą być dodawane lub zamieniane z innymi domenami tego lub pokrewnych białek. Uzyskane białko będzie często miało hybrydowe funkcje i właściwości. Na przykład, białko fuzyjne może zawierać domenę sygnałową, która może służyć kierowaniu białka fuzyjnego do określonej organelli komórkowej. Potencjalni uczestnicy fuzji i sekwencje mogą zostać wybrane z różnych baz danych sekwencji, np. GenBank, IntelliGenetics, Mountain View, CA; oraz BCG, University of Wisconsin Biotechnology Computing Group, Madison, WI. W szczególności korzystne są kombinacje sekwencji polipeptydowych opisanych w Tabelach 1 i 3. Warianty postaci tych białek mogą być wykorzystane w opisanych kombinacjach. Niniejszym opisano muteiny, które wiążą ligandy podobne do cytokin i/lub które są zmienione pod względem przekazywania sygnału. Strukturalne zestawienie ludzkiego DCRS5 z innymi członkami rodziny receptorów cytokinowych wykazuje konserwatywne cechy/reszty. Patrz Tabela 3. Zestawienie sekwencji ludzkiego DCRS5 z innymi członkami rodziny receptorów cytokinowych wykazuje różne strukturalne i funkcjonalne wspólne cechy. Patrz również Bazan i wsp. (1996) Nature 379: 591; Lodi i wsp. (1994) Science 263: 1762-1766; Sayle i Milner-White (1995) TIBS 20: 374-376; oraz Gronenberg i wsp. (1991) Protein Engineering 4: 263-269. Podstawienia sekwencjami mysimi lub sekwencjami ludzkimi są szczególnie korzystne. Przeciwnie, konserwatywne podstawienia poza regionami wiązania ligandów prawdopodobnie zachowają
PL 209 128 B1 19 większość aktywności sygnałowych; i konserwatywne podstawienia poza domenami wewnątrzkomórkowymi prawdopodobnie zachowają większość własności wiązania ligandów. Pochodne" DCRS5 naczelnych zawierają mutanty sekwencji aminokwasowej, warianty glikozylacji, pochodne metaboliczne i kowalencyjne lub zasocjowane koniugaty z innymi resztami chemicznymi. Pochodne kowalencyjne mogą być przygotowane przez przyłączenie podstawników do grup, które znajdują się w łańcuchach bocznych aminokwasów DCRS5 lub na jego końcu N, np. sposobami, które są dobrze znane w dziedzinie. Te pochodne mogą zawierać, bez ograniczeń, estry alifatyczne lub amidy końca karboksylowego lub reszty zawierające karboksylowe łańcuchy boczne, pochodne O-acylowe reszt zawierających grupy hydroksylowe i pochodne N-acylowe aminokwasu końca aminowego lub reszt zawierających grupy aminowe, np. lizyny lub argininy. Grupy acylowe są wybrane z grupy ugrupowań alkilowych, łącznie z prostymi alkilami C3 do C18, tworząc w ten sposób ugrupowania alkanoiloaroilowe. W szczególności włączone są tu zmiany wynikające z glikozylacji, np. spowodowane przez modyfikację wzorów glikozylacji polipeptydu podczas jego syntezy i obróbki lub na dalszych etapach obróbki. Szczególnie korzystne sposoby polegają na poddaniu peptydu działaniu enzymów glikozylujących pochodzących z komórek, które normalnie prowadzą taką obróbkę, np. enzymy glikozylujące ssaków. Enzymy deglikozylujące powinny być również brane pod uwagę. Również włączone są wersje tej samej pierwotnej sekwencji aminokwasowej, które mają inne drobne modyfikacje, przykładowo fosforylowane reszty aminokwasowe, np. fosfotyrozynę, fosfoserynę lub fosfotreoninę. Główną grupą pochodnych są koniugaty kowalencyjne receptorów lub ich fragmentów z innymi białkami lub polipeptydami. Te pochodne, takie jak N-końcowe fuzje mogą być wytwarzane w rekombinowanej kulturze, lub z wykorzystaniem czynników znanych w dziedzinie ze względu na ich użyteczność w sieciowaniu białek poprzez reaktywne łańcuchy boczne. Korzystne miejsca tworzenia pochodnych pod wpływem czynników sieciujących stanowią wolne grupy aminowe, reszty karboksylowe i reszty cysteiny. Polipeptydy fuzyjne między receptorami i innymi homologicznymi lub heterologicznymi białkami są również dostarczone. Polipeptydy homologiczne mogą być fuzjami między różnymi receptorami, w wyniku czego powstaje na przykład białko hybrydowe, wykazujące specyficzność wiązania wobec wielu różnych ligandów cytokinowych lub receptor o rozszerzonej lub osłabionej specyficzności działania substratu. Podobnie mogą być konstruowane heterologiczne fuzje, które będą wykazywać kombinacje właściwości lub aktywności macierzystych białek. Typowe przykłady to fuzje polipeptydu reporterowego, np. lucyferazy, z segmentem lub domeną receptora, np. segmentem wiążącym ligand, co umożliwia łatwe określenie obecności i lokalizacji pożądanego liganda. Patrz np. Dull i wsp., patent USA nr 4859609. Inni partnerzy" fuzji genowych zawierają transferazę S-glutationową (GST), bakteryjną β-galaktozydazę, trpe, białko α, β-laktamazę, alfa amylazę, dehydrogenazę alkoholową i drożdżowy czynnik płciowy alfa. Patrz np. Godowski i wsp. (1988) Science 241: 812-816. Znakowane białka będą często podstawiane w opisywanych kombinacjach białek. Połączenie DCRS5 z IL-12Rβ1 jest szczególnie znaczące, tak jak opisano. Metoda amidofosforynowa opisana przez Beaucage i Carruthers (1981) Tetra, Letts. 22: 1859- -1862, dostarcza odpowiednich syntetycznych fragmentów DNA. Dwuniciowy fragment będzie często otrzymywany, albo przez syntezę nici komplementarnej i połączenie nici razem w odpowiednich warunkach, albo przez dodanie nici komplementarnej przy użyciu polimerazy DNA z odpowiednią sekwencją startera. Takie polipeptydy mogą również zawierać reszty aminokwasowe, które zostały chemicznie zmodyfikowane przez fosforylację, sulfonowanie, biotynylowanie lub przez dodanie lub usunięcie innych reszt, szczególnie takich, które mają formy molekularne zbliżone do grup fosforanowych. W niektórych wykonaniach te modyfikacje będą użytecznymi odczynnikami znakującymi lub będą służyć jako ugrupowania docelowe przy oczyszczaniu, np. ligandy powinowactwa. Białka fuzyjne typowo będą wytwarzane metodami rekombinacji kwasów nukleinowych, albo przez syntezy polipeptydów. Techniki manipulacji i ekspresji kwasów nukleinowych są ogólnie opisane, na przykład, w Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (wyd. 2), t. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, oraz Ausubel i wsp. (red. 1987 wraz z okresowymi uzupełnieniami) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York. Techniki syntezy polipeptydów są opisane na przykład w Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85 : 21492156; Merrifield (1986) Science 232: 341-347; oraz Atherton i wsp. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL